毒理学杂志2020年10月第34卷第5期J Toxicol October2020Vol.34No.5•413・中图分类号：R285.5；R114文献标识码：A文章编号：1002-3127(2020)05-0413-03•实验研究・茯苓多糖抑制甲醛染毒小鼠DPC和8-OHDG的实验研究
胡昌军J张志军S姚祖福'，张在其'
(1.湖南医药学院侗医药研究湖南省重点实验室，湖南怀化418000；2.湖南医药学院公共卫生与
检验医学院，湖南怀化418000； 3.湖南医药学院药学院，湖南怀化418000)
马力和功率换算
【摘要】目的观察茯苓多糖对甲醛诱导DNA-蛋白交联物(DPC)和8-羟基脱氧鸟昔(8-OHDG)的抑制作用，探索茯苓多糖的抗遗传毒性效应。方法将40只成年昆明种雄性小鼠随机分成阳性对照组(甲醛染毒)和茯苓多糖低、中、高剂量组，每组10只阳性对照组灌胃0.4ml浓度为0.5“L的甲醛溶液，茯苓多糖组小鼠除了灌胃0.2ml浓度为
1.0g/L的甲醛溶液外，还灌胃0.2ml不同浓度的茯苓多糖溶液(低剂量组
2.0g/L，中剂量组4.0g/L和髙剂量组
8.0g/L)o1周后摘眼球取血，用ELISA法测定各组小鼠血清DPC和8-OHDG含量。结果各茯苓多糖组DPC和
8-OHDG浓度均低于甲醛组；茯苓多糖剂量越高，DPC和8-OHDG浓度越低，呈现明显的剂量-效应关系(DPC：r g=-0.855,P<0.01；8-OHDG：r9=-0.412,P<0.05)；DPC与 8-OHDG呈正相关关系(r=0.361,Pv0.05)。结论茯苓多糖可抑制甲醛诱导小鼠体内DPC和8-OHDG水平，且存在剂量-效应关系，作用随茯苓多糖剂量的提高而增强，表明茯苓多糖具有较强的抗遗传毒性作用。
【关键词】茯苓多糖；DNA-蛋白交联物；8-羟基脱氧鸟昔；酶联免疫吸附测定；甲醛；小鼠
Experimental study on inhibitory effect of pachymaran on DPC and8-OHDG
梁国公induced by formaldehyde
HU Chang-jun1,ZHANG Zhi-jun2,YAO Zu-fu3,ZHANG Zai-qi1
(1.Hunan Provincial Key Laboratory of Dong Medicine,Hunan University of Medicine,Huaihua Hunan418000,China；
2.College of Public Health and Laboratory Medicine,Hunan University of Medicine,Huaihua Hunan418000,China；
3.College of Pharmacology,Hunan University of Medicine,Huaihua Hunan418000,China)
[Abstract]Objective To obrve the inhibitory effect of pachymaran on DPC and8-OHDG information induced by formaldehyde, and explore its anti-genotoxicity effect.Methods40adult male Kunming mice were randomly divided into four groups,in which the positive control group was perfud with0.4ml formaldehyde solution of0.5g/L,pachymaran low,medium and high do groups,were respectively perfud with0.2ml pachymaran solution of2,4and8g/L besides0.2ml formaldehyde solution of1.0g/L.A week later,the blood of the eyeball was taken out to measure the concentration of mice peripheral blood DPC and8-OHDG by the ELISA method.Results Pachymaran processing groups DPC and8-OHDG levels were lower than tho of the positive control group.A negative correlation was obrved between pachymaran clo and DPC and8-OHDG level(DPC:r、=-0.855,PvO.01；8-OHDG:r、=-0.412,P<0.05).A positive correlation between DPC and8-OHDG was also obrved(r=0.361,P<0.05).Conclusion It can be inferred that pachymaran can stop the formation of mice rum DPC and8-OHDG induced by formaldehyde,and the do-effect relationship is obvious.The effect can be enhanced with the increa of the pachymaran do.The conclusion can be drawn that pachymaran has strong anti-genotoxicity effect.
[Key words]Pachymaran；DNA-protein crosslinks(DPC)；8-hydroxy-2deoxyguanosine(8-OHDG)；ELISA；Formaldehyde；M ice
茯苓为多孔菌科卧菌属真菌的干燥菌核，味甘淡，性平，有健脾补中、养心安神、利水渗湿的功能。我国食用茯苓已有长达千年的历史，其功效广泛，与多种药材相配均能发挥其药效，是一种重要的中药药材，是多
基金项目：湖南省科技基础条件平台建设专项(2015TP1020-03)；中央引导地方科技发展专项(2OI7CT5O25)
作者简介：胡昌军，硕士，教授，研究方向：预防医学教学与科研。
通讯作者：张在其，博士，教授，研究方向：侗医药研究：种方剂及中成药的原料。茯苓多糖(pachymaran)是从茯苓中提取的生物活性物质，由葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖等成分组成，具有抗肿瘤、抗衰老、降血脂、抗病毒、抗炎及免疫调节等药理作用3)。研究发现，茯苓多糖可以明显增加环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠的胸腺指数，降低模型小鼠细胞介素-IO(IL-IO)水平，增强模型小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用，提升模型小鼠IgG 和IgM抗体的水平，缓解环磷酰胺对小鼠体液免疫功
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能的抑制作用茯苓多糖还有明显的抗氧化能力，其清除DPPH自由基的能力甚至超过VitC⑷。茯苓多糖还有很好的抗疲劳作用"。侯玮婷和罗佳波⑷发现，复方茯苓多糖口服液有抑制小鼠S180和H22肿瘤
房子绘画
生长的作用，对实体瘤有明显抑制作用，能增强巨噬细胞吞噬功能，促进小鼠淋巴细胞增殖和NK细胞活性，调节荷瘤小鼠免疫功能。DNA-蛋白交联物（DNA-protein crosslinks,DPC）是生物大分子遗传损害的重要标志物之一，它的形成可影响基因的表达，破环染色体的正常结构，导致DNA复制过程中某些重要遗传信息的改变和丢失，从而诱发突变及肿瘤的发生；8-轻基脱氧鸟昔（8-hydroxy-2deoxyguanosine, 8-OHDG）是活性氧自由基如轻自由基、单线态氧等攻击DNA分子中的鸟瞟吟碱基第8位碳原子而产生的一种氧化性加合物。为进一步挖掘茯苓的药用价值，本研究用ELISA法分析茯苓多糖对甲醛诱导小鼠DPC和8-OHDG水平的影响，以探讨茯苓多糖的抗遗传损伤效应。
1材料与方法
1.1主要试剂和仪器茯苓多糖提取物（西安开来生物工程有限公司，茯苓多糖含量63.5%，临用前用生理盐水溶解稀释至所需浓度）；甲醛（分析纯，临用前用生理盐水配制成所需浓度）;DPC和8-OHDG检测ELISA试剂盒（上海易利生物科技有限公司）；RT-6000酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；TD24-WS低速自动平衡离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。
1.2动物40只成年健康昆明种雄性小鼠由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供，许可证号为SCXK （湘）2009-0002，合格证号20-011，体重19-21g。用随机方法将其分成甲醛染毒组、茯苓多糖低剂量组（甲醛+2g/L茯苓多糖）、茯苓多糖中剂量组（甲醛+ 4g/L茯苓多糖）和茯苓多糖高剂量组（甲醛+8g/L 茯苓多糖）共4组，每组10只。
1.3受试物给予方法小鼠先在通风及光照良好的实验室适应性饲养，普通饲料，自由饮食及摄水，实验室温度为18-24°C，湿度为30%-40%，每晚7点喂食1次，每2日更换1次饮水与垫料，饲养4d后用于实验。甲醛组小鼠灌胃0.4ml浓度为0.5g/L的甲醛溶液，各茯苓多糖组小鼠灌胃0.2ml浓度为1.0g/L的甲醛溶液和0.2ml不同浓度的茯苓多糖溶液（低剂量组
2.0g/L，中剂量组4.0g/L，高剂量组8.0g/L），各组小鼠每次灌胃量均为0.4ml，持续灌胃7d后（甲醛组死亡2只，茯苓多糖低剂量组死亡1只）摘眼球取血，1500r/min离心3min分离血清备用。
1.4DPC和8-OHDG检测用EL1SA法测定各组小鼠血清DPC和8-0HDG含量，具体操作按试剂盒要求进行。
1.5统计学方法数据用SPSS1J.0统计软件分析，组间差异比较用方差分析或秩和检验（Kruskal Wallis Test），剂量-效应关系用Spearman等级相关系数，P< 0.05为差异有统计学意义。
2结果
茯苓多糖对小鼠血清DPC浓度有影响，4组间DPC浓度差异有统计学意义（Kruskal Wallis Test,H= 27.551,P<0.01）；茯苓多糖剂量越高，DPC浓度越低，小鼠血清DPC浓度与茯苓多糖剂量呈负相关（Spearman等级相关系数r=-0.855,P<0.01） o4组间8-OHDG浓度差异有统计学意义（F=4.439,P< 0.
01），茯苓多糖剂量越高,8-OHDG浓度越低（Spearman等级相关系数r=-0.412,P<0.05）o DPC 与8-OHDG间存在正相关关系（r=0.361,P<0.05）o 结果见表1。
表1茯苓多糖对甲醛诱导小鼠DPC和8-OHDG的
抑制作用（仏s,ng/L）
组别n
茯苓
(g/L)
组织职能DPC8-OHDG
阳性对照组80108.86±14.0159.46±9.27
茯苓多糖低剂量组9 2.090.16±4.41"53.29±6.08*茯苓多糖中剂量组10 4.077.71±4.77**50.24±4.13**茯苓多糖高剂量组108.072.80±7.93**49.96±4.67**注：与阳性对照组比较，*P<0.01,•*P<0.0k
3讨论
DPC是近年来备受关注的除DAN-加合物之外的另一类生物大分子的重要遗传损害标记物，是环境理化因素对生物大分子物质的一种重要遗传损害，它的形成可影响基因的表达，破环染色体的正常结构，导致DNA复制过程中某些重要遗传信息的改变和丢失，从而诱发突变及肿瘤的发生。DPC最初用于研究紫外线和电力辐射对DNA的损伤，后用于观察某些抗肿瘤药物包括顺钳等的生物效应，由于许多环境污染物和化学致癌物包括烷化剂，苯丙（a）茁、碑化物、醛类化和物以及一些重金属如锯、鎳等均可引起DPC，目前作为外来化学物的毒作用分子生物标志物已备受关
毒理学杂志2020年10月第34卷第5期J Toxieol October2020Vol.34No.5•415•
注「DPC形成的机制目前还不完全清楚，可能与轻基自由基形成、细胞内疏基水平降低有关。氧化代谢是机体生命活动的基本过程.会产生各种活性氧自由基导致氧化损伤，进而引起各种疾病：作为活性氧自由基攻击I)NA分子的一种氧化性加合物,8-0HIM；的检测可以评估体内氧化损伤和修复的程度。氧化应激与DNA损伤的相互关系，对研究退行性疾病、衰老机制、癌发生机制、环境毒物与氧化应激的关系等均有重要的意义，也可以用来评价抗氧化剂治疗DNA氧化损伤的效果。8-OHDG已成为DNA氧化损伤中最常用的生物标志。甲醛具有遗传毒性，广泛地存在于现实生活与工作环境中，更有人将其用于食品防腐保鲜。有研究发现，甲醛浓度为10'6-W5mol/L时，可引起16HBE细胞DNA断裂，浓度达到104mol/L时，DPC 严重⑺。甲醛可引起小鼠肝、脾组织的氧化损伤，降低肝、脾组织超氧化物歧化酶(SOD)水平，提高脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量⑷。因此，本研究中用甲醛染毒，确保实验
小鼠血清中有可供检测的DPC和8-OHDG。
舒畅等⑼研究发现，茯苓多糖铁具有促进DNA凝聚的作用，效应随浓度增加而增强，具有作为DNA载体的可能。本研究结果表明，茯苓多糖具有较好的抑制DPC和8-OHDG形成作用，且存在明显的剂量-效应关系，剂量越大.抑制效应越明显，说明茯苓多糖具有较好的抗遗传损伤作用，由于DPC与8-0HDG都反映了DNA的损害，研究还观察到了二者之间的正相关关系(r=0.361,P<0.05)o综上，茯苓多糖作为天
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