NanoString数字基因定量技术原理及应⽤简介
作者：胡东王芳周围段家玺范灵灵黄⼠昂
导读
数字化基因分析系统是最新的多重基因定量检测技术。此技术可直接检测条形码探针标记的单个mRNA转录⼦，并通过数字计数进⾏定量；它仅需NanoString数字化基因分析系统是最新的多重基因定量检测技术。
100 ng的RNA即可对逾⼋百个特异的mRNA转录⼦进⾏准确的定量；它⽆需酶促和扩增过程，其检测的敏感性和准确性与实时荧光定量PCR(RQ—PCR)技术相当。近年来，NanoStfing技术的特点及优势使其被越来越⼴泛地应⽤到⽣物医学前沿领域，包括⾼通量基因表达结果验证、基因表达谱研究、基因调控⽹络研究、临床疾病分⼦分型及诊断预后等领域。
随着后基因组学和系统⽣物学的发展，在特定⽣物学过程或疾病状态中对转录⽔平RNA表达的⾼通量研究越来越受到关注，并成为⼈们深⼊了解⽣物学过程中转录调控、信号转导机制、疾病分⼦病理分型等的重要⼯具。
基因芯⽚、RNA测序等技术应⽤于⾼通量基因表达谱研究，产⽣了⼤量基于各种⽣物过程及疾病模型的
信息；但由于其检测敏感性和准确性不⾜，往往需要对结果中⼤量的信息进⾏进⼀步的筛选和验证。传统的实时荧光定量PCR(real—time quantitative PCR，RQ．PCR)⽅法敏感性⾼，准确性好，是⾼通量研究最常⽤的验证⽅法；
但其通量不⾜，在需要对多个基因定量的情况下，实验设计及操作步骤繁琐。NanoString数字化基因检测技术(NanoString nCounter Analysis)是新⼀代的多重核酸定量技术，在基因表达谱的验证、研究和临床应⽤中扮演了越来越重要的⾓⾊。
NanoString技术在⼀个体系中可进⾏逾⼋百个的颜⾊条码探针和特异性序列的杂交反应，最后直接以数字化输出的形式读取定量结果。此技术⾃动化程度⾼，反应中⽆需酶逆转及扩增的过程，避免了相关偏差，其检测敏感性、准确性和实时荧光定量PCR技术相当。
⾃2008年《NatureBioteehnology》杂以封⾯⽂章形式报道了NanoString技术，⾄今PubMed数据库已有逾百篇应⽤这⼀⽅法开展研究的⽂章，其中多篇⽂章发表
本⽂将这⼀技术的原理及应⽤作⼀简述。
在《Nature》、《Cell》等⼀流杂志上。本⽂将这⼀技术的原理及应⽤作⼀简述。
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wyyyyNanoString技术原理
我要学NanoString技术是基于核酸分⼦与探针杂交后，对探针上的颜⾊分⼦条形码标记直接探测、计数⽽实现多重定量的检测技术。其核⼼技术原理包括分⼦条形码技术和单分⼦成像数字计数技术。NanoString可检测各种类型的核酸，以下以mRNA定量检测为例介绍其原理。
1．1 基本原理
NanoString分⼦条形码技术在NanoString杂交反应体系中，针对每⼀个⽬标mRNA分⼦会设计⼀对分⼦探针，每对探针包括⼀个在5’端载有颜⾊条形码color barcode)标记的约35～50 bp的报告探针和⼀个在3’端载有⽣物素的约35～50 bp捕获探针(图l)。报告探针5’标记的颜⾊条形码共有6个位置，每个位置可以是4种颜⾊的荧光团中的⼀种。
探针的颜⾊条码标记使得每⼀种条码对应每⼀特异的⽬标mRNA序列。条码中6个序列位置的4种颜⾊排列组合理论上允许有4^6(即4096)种⽅式，但需要排除易混
淆的相近颜⾊条形码的探针和内置阳性对照、阴性对照所需的探针，在⼀个标本中可同时检测约⼋百个不同的条码即约⼋百种不同的⽬标mRNA序列。
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1．2 NanoString单分⼦成像技术
1．2 NanoString单分⼦成像技术
单分⼦成像是指对反应体系中各个特异mRNA⽬标分⼦进⾏直接的绝对数字计数。样品探针混合物杂交完成后，经过纯化洗脱、杂交产物固定于样品板、电极极化等步骤，使所有杂交信号以同⼀⽅向位于同⼀成像平⾯上，进⽽可由数字成像分析系统对样本板上的报告荧光信号进⾏扫描、处理图⽚信息及数字计数。
图⽚信息处理中，每⼀个特异颜⾊条形码标记的探针信号将对应⼀个特异的mRNA序列，即这⼀特异mRNA分⼦的⼀次计数，最终将产⽣⼀个对应于反应体系中多个颜⾊条码即多个特异⽬标mRNA分⼦计数信息的计数⽂件(图2)，从⽽实现了对多种特异mRNA序列的绝对计数。
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NanoString技术特点
2．1 可重复性好、准确性和敏感性⾼
NanoString技术是基于杂交后对报告探针上的荧光基团条形码标记的直接检测，其⽆酶促反应或PCR扩增等步骤，不会因检测样品质量不佳造成对酶活性的影响，也⽆扩增引⼈的误差产⽣；同时，这⼀检测技术⾃动化程度⾼，主要依赖于样本制备站和数据分析站的⾃动化操作，⼿动操作简单，可避免更多的⼈为误差。实验证明，NanoString在样本核酸3个log动态范围内多次平⾏重复的平均R2为0．999。
NanoString技术检测敏感性⾼、线性范围⼴。在⼀个100 ng总RNA和500个基因探针的反应体系中，中，NanoString技术最低检测限为0．1～0．5 fmol／L。以每个细胞含10 Pg RNA来计算，即最低可检测到每个细胞中0．2～1个拷贝数，且这⼀检测在浓度⼤于2．5个log的范围内检测计数值和浓度均有很好的线性关系(线性回归系数>0．998)。
2．2 多种类型核酸的检测
毒蘑菇有哪些NanoString技术在原则上可⽤于检测任何类型的核酸样品。除了mRNA，它还可以对⾮编码RNA包括
微⼩RNA(miRNA)、长链⾮编码RNA(lncRNA)以及DNA等各种类型的核酸进⾏多重定量。NanoString可⼴泛地应⽤在mRNA、miRNA、lncRNA基因定量表达谱、基因组DNA拷贝数变异性(CNV)以及DNA、RNA病原体的检测。
2．3 标本来源的多样化
2．3 标本来源的多样化
NanoString技术是基于直接检测杂交后报告探针上的荧光基团标记，进⾏计数分类，⽆需PCR扩增或其他酶促反应，即⽆扩增误差，能检测出样品中低丰度的mRNA，即使样品质量不佳也能进⾏杂交、扫描，因此NanoString技术可检测多种来源的标本。
它除了可对多种来源组织细胞提纯的核酸进⾏定量，还可对新鲜或冻存组织、细胞、细菌等的裂解物以及多聚甲醛固定⽯蜡包埋(formalin—fixed paraffin embedded，FFPE)组织细胞的裂解物等直接进⾏定量检测。
2．4 标本量要求少、通量较⾼、操作简单
NanoString技术仅需少量的RNA(100 ng)就能完成对逾⼋百个特异转录⼦序列的准确定量。NanoString检测系统⾃动化程度⾼，由样本制备仪和数字化分析仪2部分组成，对12个样本的检测可
同时上机进⾏，整个⼿动操作过程为15～30 min。
现世安稳岁月静好下⾯我们主要介绍⼀下nanostring技术在肿瘤分⼦分型诊断与预后领域的应⽤
NanoString表达谱⽤于疾病的诊断和预后
湖南莽山
肿瘤的诊断和预后⼀直以来主要是依据患者的年龄、肿瘤的⼤⼩、是否存在转移等临床及组织细胞病理辅助检查特征来判断的。基因表达谱能从分⼦⽔平更准确地表现患病组织的疾病状态，从⽽可为患者提供更具体的个体化疾病分⼦诊断及预后分层的新⽅案。
⽬前，基因表达谱分⼦分型研究已⼴泛地⽤于乳腺癌、髓母细胞瘤、淋巴瘤等多种肿瘤，其中乳腺癌的表达谱分⼦分型已应⽤于临床。乳腺癌分⼦分型表达谱PAM50是⼀个基于NanoString技术的分⼦病理分型检测。这⼀表达谱可将乳腺癌依其内在分⼦表达特征分为管腔A型(1uminal A)、管腔B型(1uminal B)、Her2富集(Her2⼀Enriched)及基底样(Basal-1ike)型，每⼀型都有其独⽴的预后特征。
PAM50对淋巴结阴性且尚未接受辅助治疗患者的⽆复发⽣存率进⾏预测，与标准的病理学参数⽐较，证明可以更准确地预测乳腺癌患者的10年⽆复发⽣存率。⽬前，基于NanoString技术的这⼀检测⽅法已通过欧盟的认证并已⽤于临床。
髓母细胞瘤通过组织学分⼦分型可将其分为4类核⼼亚组，即WNT、SHH、C组和D组。每个亚组具有
特异的⼈⼝统计学特征和转录组、基因组表型以及临床表现和预后。过去，这类分型需要从急冻标本获取⾼质量的RNA并通过基因芯⽚⾼通量检测来实现；
安全心得体会300字
⽽使⽤NanoString技术，通过对髓母细胞瘤分⼦分型中关键的25个基因的mRNA表达进⾏⾼灵敏度和准确性的检测即可进⾏分⼦分型，其结果和基因芯⽚结果相关性好，在130例的验证组实验中，⼀致率⾼达98％。张云逸大将
Scott等将进展期⾮霍奇⾦⽒淋巴瘤⽤NanoString检测的23个基因表达谱进⾏风险预测，此⽅法的预测相⽐国际预后积分(IPs)和CD68免疫组化检测其对疾病预后能⼒更佳。
Lira等应⽤NanoString技术对肺⾮⼩细胞癌标本多种断裂点的ALK融合基因进⾏检测，此⽅法的敏感性⾼，与FISH及免疫组化⽅法结果⾼度⼀致；并可确定各种断裂点亚型的融合基因及其表达⽔平，可⽤于肺⾮⼩细胞癌的分⼦诊断。
《Int J BiomedEng》, December 2013，V01．36，No．6
病理柳叶⼑
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