乳山长牡蛎（
Crassostrea gigas ）的抗性基因表达和生存环境的季节差异
魏钰恒1，2，潘英1，刘圣2，4
，谭林涛3，
张国范2，李莉2，黄宝玉5
（
1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁530004；
2.中国科学院海洋研究所，山东青岛266071；
3.山东省乳山市
水产技术推广站，山东威海264500；4.浙江万里学院浙江省水产种质资源高效利用技术研究重点实验室，
浙江宁波315100；5.鲁东大学农学院，山东烟台264025
）摘要：长牡蛎（
Crassostrea gigas ）是我国重要的海水养殖贝类，近年其大规模死亡现象频繁发生。为了解长牡蛎的免疫基因在季节上的表达模式变化规律及死亡爆发高峰期的水环境情况，在其主养区山东乳山进行了相关研究。分别在2018年1、3、5—9月对该地区牡蛎鳃样品做了免疫基因定量分析，在6、7、9月对养殖海域的环境因子（水温、盐度、pH 、溶解氧）、
各时间点水体里的浮游植物数量及各采样点牡蛎条件指数的变化进行了研究。结果显示，HSP70在7月份高表达，其余5个抗性相关基因在8月表达水平达到峰值。在测量的三个月中，7月水温最高，6月和9月水温略低于7月，这一结果和表达
模式相关。研究表明近岸的藻类丰度更大。因此，温度是影响长牡蛎存活的各环境因子中的主要因素，温度显著影响到体内抗性基因的表达情况并且间接影响到夏季牡蛎的条件指数。
关键词：长牡蛎（Crassostrea gigas ）；季节变化；基因定量；养殖环境
中图分类号：S944.3文献标识码：A 文章编号：1001原6932（圆园20）
05原园601原08Seasonal differences in resistance gene expression and
environment of Crassostrea gigas at Rushan
友的成语WEI Yuheng 1,2,PAN Ying 1,LIU Sheng 2,4,Tan Lintao 3,
ZHANG Guofan 2,LI Li 2,HUANG Baoyu 5
渊1.Guangxi University,College of Animal Science and Technology,Nanning 530004,China;2.Institute of Oceanology,Chine Academy of Sciences,Qingdao 266071,China;3.Aquatic Technology Extension Station of Rushan,Weihai 264500,China;
4.Key Laboratory of Aquatic Germplasm Resourceof Zhejiang,Zhejiang Wanli University,Ningbo 315100,China;
5.Ludong University,College of Agricultural,Yantai 264025,China)
Abstract:Crassostrea gigas is an important agriculture shellfish in China,who in recent years faced with mass mortality.In order to understand the asonal expression patterns of immune genes in oyster and the water environment at the peak of death outbreak,relevant rearch was carried out in Rushan of Shandong Province,the main breeding area of oyster.qRT-PCR for immune genes was conducted on the gill samples in 2018January,March,May,June,July,August and September,respectively.In June,July and September,the environmental factors 渊water temperature,
salinity,PH,dissolved oxygen),phytoplankton quantity in the water at each time and the changes of oyster condition index at each sampling point in the Xi鄄
huang island of Rushan were studied.The results show that HSP70is highly expresd in July,and the expression level of the other five resistance-related genes peak in August.The water temperature is the highest in July and slightly lower in June and
收稿日期：2020-03-09；修订日期：2020-04-22基金项目：农业部贝类产业技术体系（CARS-49
）作者简介：魏钰恒（1994-），硕士研究生，主要从事贝类遗传育种研究。电子邮箱：***************
通信作者：潘英，博士，教授。电子邮箱：*************** ；李莉，博士，研究员。电子邮箱：************
Doi ：10.11840/j.issn.1001-6392.2020.05.009
海
洋通报
MARINE SCIENCE BULLETIN
Vol.39袁No.5
Oct.2020
第39卷第5期圆园20年10月
海洋通报39卷September,which is related to the expression pattern.Statistics on algae show that the abundance of algae is greater near the shore.Therefore,temperature is the main influencing factor affecting the survival of C.gigas.It affects the expression of resis鄄tance genes and indirectly affects the conditional index of oyster in summer.
Key words:Crassostrea gigas;asonal;gene quantification;breeding environment
长牡蛎（Crassostrea gigas）又称太平洋牡蛎，生物学分类为软体动物门（Mollusca），双壳纲（Bivalvia），牡蛎目（Osteroida），牡蛎科（Ostreidae），巨牡蛎属（Crassostrea）。牡蛎是世界上养殖最广泛的海洋软体动物之一，具有重要的经济价值（Li et al，2018），除了是世界范围内重要的渔业资源外，牡蛎的养殖对其生存的潮间带和潮下带也具有重要的生态意义，对周围环境的生态发展有益（Cranfield et al，2003）。
我国2017年牡蛎的养殖产量高达487.9万吨，几乎占全国海水贝类总产量的1/3，而其大规模死亡已成
为制约我国牡蛎产业的重要瓶颈，仅2017年牡蛎的病害损失就近40亿元。
近些年来，在世界范围内也发生了长牡蛎的大规模死亡现象（Li et al，2008）。2008年法国养殖的长牡蛎幼虫出现了大规模死亡，因为牡蛎的养殖海域不同，死亡率在40%~100%之间，这一现象对牡蛎养殖产业造成了巨大的经济损失（Pernet et
al，2012）。虽然我国养殖牡蛎大规模死亡频发，但是正式的报道并不多（时少坤等，2016），究其原因主要是大规模死亡事件往往集中在较短时间内爆发，难以捕捉。
目前国外对长牡蛎夏季死亡现象进行了比较多的研究，法国、美国、爱尔兰、澳大利亚、新西兰等国都有类似事件的相关报道（Cheng et al，2016；Malham et al，2009；EFSA，2010；Peeler et al，2012；Jenkins et al，2013；Paul-Pont et al，2014；Huvet et al，2004），国内也有一些研究认为，死亡原因主要是环境、食物、繁殖和病原体侵染等，并且在繁殖方面，有研究表明长牡蛎大量死亡的时间恰好与性腺肥满度相关（马绍赛等，1997）。山东省作为牡蛎养殖大省，其下辖乳山市拥有100多万亩国家一类海水养殖海区，2018年牡蛎养殖水域约有8万亩（谭林涛等，2019），年产量和产值均为全国县级单位之首，被誉为“中国牡蛎之乡”，但是近些年牡蛎的度夏死亡率骤升困扰着当地的渔民。2019年乳山牡蛎度夏死亡率在50%以上，有的地点甚至达到了90%，对乳山的生态、经济造成了较大的影响。由于环境因素是影响牡蛎死亡的主要原因之一，因此对海域水文的监测尤为重要。
可以通过实时的监测数据结合死亡爆发的高峰期来对牡蛎死亡做出相应的分析，从而推演出相应的应对办法。此前的研究大部分为单独的实验室研究或者野外监测，缺乏整体性。本研究选择乳山这一典型的牡蛎养殖区为对象，在野外方面，从养殖环境、条件指数等方面调查了不同海岸和不同水层的差异，探讨了长牡蛎度夏死亡的原因，并且通过在实验室内检测抗性基因的季节性表达模式趋势，初步认知以上因素对牡蛎机体的影响。
1材料与方法
1.1牡蛎样品来源及环境监测
研究共选取了三个实验点，分别是山东省乳山市的西黄岛近岸（36毅45忆25义N，121毅31忆12义E）、西黄岛远岸表层（36毅43忆56义N，121毅30忆34义E）和西黄岛远岸底层（36毅43忆56义N，121毅30忆34义E）（图1）。
本实验所使用的长牡蛎个体全部由人工繁育获得，采用的养殖方式为浮筏养殖。为了研究获得牡蛎抗性相关基因季节性差异的变化趋势，在2018年的1月，3月以及5—9月对西黄岛近岸的牡蛎进行取样，1月牡蛎大小为18月龄，后面几个月份牡蛎养殖时间依次顺延。整个实验过程中取样情况详细列于表1。
1.2主要仪器和试剂
在本研究中，使用的仪器主要有4益冰箱、-80益超低温冰箱、高压灭菌锅、可调移液枪、制冰机、超净工作台、凝胶成像仪、微波炉、电泳槽、恒温水浴锅、普通PCR仪、高速冷冻离心机、Nano-drop2000超微量分光光度计（Thermo Fisher），7500 Fast实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems）等。用到的试剂有LB培养基，RNA提取过程使用天根公司的试剂盒，反转录及定量PCR过程中使用日本Takara公司的相关试剂盒等。
602
5期
1.3鳃组织的获取
为了做季节性抗性基因荧光定量，在每个取样
月，将牡蛎从养殖海域取回实验室，并且用牡蛎刀仔细剔除牡蛎表面的附着物，使用刷子仔细清洗牡蛎个体。每个月份随机选取15只牡蛎，取样时，使用牡蛎刀从牡蛎壳顶铰合部将牡蛎撬开，顺势切断闭壳肌。打开牡蛎，用干净的剪刀镊子取每个个体的四片鳃，装入冻存管立即放在液氮中冷冻，随后放在-80益超低温冰箱中备用。1.4研究用基因及引物信息
为了研究长牡蛎鳃组织中与机体免疫相关基因表达量的季节性变化差异，选择热休克蛋白基因（HSP
70），能量代谢相关基因6-磷酸果糖激酶（PFK
），以及一些免疫相关的基因，如金属蛋白酶抑制剂（MPI2），髓样分化蛋白（MyD88），溶菌酶（Lys ）和白细胞介素17（IL -17）。EF -1琢（ELongation factor 1alpha ）基因为使用的内参基
因，以上各基因的引物序列见表2。1.5RNA 提取和样品混合
将之前放在超低温冰箱保存的鳃样品取出，使用天根公司的RNA 提取试剂盒（DP431
），按照说明书的要求对组织全RNA 进行提取，整个过程在超净工作台进行，并且保证每一步添加试剂都在冰上进行，以防止RNA 的降解。提取成功后使用琼脂糖凝胶电泳检测核酸的完整性，并且用Nanodrop2000检测核酸的浓度和RNA 的纯度，为下一步操作做准备。
以上7个月份的鳃组织全部提取RNA 并保存在冰箱中，共计105个RNA 样品。由于牡蛎个体之间的差异性比较大，为了尽可能减少个体之间的差异对实验结果造成的影响，将每个月的15个RNA 样品分为3个生物学平行组，每组包含5个样品的全RNA 混样。RNA 混样方法为：将每组的5个样品通过计算各自的浓度进行等量混合。公式
图1取样点位置信息表1本研究取样情况
采样地点取水样月份（2018年）
取牡蛎月份（2018年水温PH 盐度溶解氧藻类条件指数基因定量西黄岛近岸6、7、96、7、96、7、96、7、96、7、96、7、91、3、5—9
西黄岛远岸表层6、7、96、7、96、7、96、7、96、7、96、7、9无西黄岛远岸底层
6、7、9
6、7、9
6、7、9
6、7、9
6、7、9
6、7、9
无
西黄岛远岸表层
西黄岛远岸底层
西黄岛近岸
海阳所镇
宫家庄
乳山市
魏钰恒等：乳山长牡蛎（Crassostrea gigas ）的抗性基因表达和生存环境的季节差异
121毅22忆E
121毅46忆E
形容字写得好
121毅26忆E
121毅30忆E
121毅34忆E
121毅38忆E
121毅42忆E
603
海洋
通报39卷
猪肝豆腐汤
如下：
总RNA =（m /C1）+（m /C2）+…+（m /C5）
公式中m 代表每个样品需要添加的核酸的量，Cn 表示样品浓度，如此可得到每个生物学平行组的总RNA 量，在反转录前混合完毕并且检测总RNA 的浓度。
1.6反转录及实时荧光定量（qRT-PCR
）取上一步获得的混样RNA 进行反转录，本研究反转录过程使用PrimeScript RT reagent kit with gDNA Erar （Takara ，Japan ）试剂盒。反转录过程分两步进行，第一步为去除gDNA ，第二步为反转录。反应体系列于表3。
表2
引物序列
基因分类缩写基因名称
引物序列（5'-3'）内参基因EF-1-琢ELongation factor 1alpha F:GAGCGTGAACGTGGTATCAC
R:ACAGCACAGTCAGCCTGTGA 热休克蛋白
HSP70-02823
HeatShockProtein70-02823
F:GCTGTGGCTTATGGAGCTGCTG
R:TCCTGCCGTTTCAATGCCCAAA 免疫相关
MPI2Metalloproteina inhibitor 2-like precursor
F:GTTCTAGCGACACTCTGGTC
R:GTGAATCGTGCAGTTACAGC MyD88Myeloid differentiation primary respon protein MyD88-like isoform X1
F:AGGTACCGGCTGTGATACGA
R:TTCAAACGCCACCAAGACTG Lys Lysozyme
F:CACCAAGTAATCATGCAGCG
R:CACGAGTATGAGAACACGTC IL-17
Interleukin 17-like protein precursor
F:ACTGAGGCTCGATGCAAGTG R:AGCCTTCTTGCTTCATGTGG 能量代谢相关PFK
6-phosphofructokina
F:TGTACAGAAGGCGATGAGTGA
R:CATTGGAACCGCAAGCAG 表3反转录过程中的试剂及反应体系
试剂
体积去除gDNA 42益，2min
5伊gDNA Erar Buffer
2滋L
gDNA Erar 1滋L
Total RNA
1滋g （根据混样浓度算体积）
RNa-Free H 2O 加至总量10滋L
反转录
37益，15min ；85益，5s
第一步的反应液
10滋L Primer Script RT Enzyme Mix 1滋L RT Primer Script Buffer
1滋L 5伊Primer Script Buffer 2
4滋L
脚底板痒RNa-Free H 2O 4滋L 反转录完成后，将所得cDNA 稀释20倍作为qRT-PCR 的模板，以EF-1琢作为内参基因，定量
实验选择的目的基因。定量前期准备过程全部在超
净工作台冰盒上进行，所用试剂参考2伊SYBR Green PCR 试剂盒（Takara ，Japan ）说明书，总体积20滋L 的反应体系见表4。各步骤完成后使用低温离心机2000r 左右转速将管壁上的液体甩下混匀。荧光实时定量PCR 在仪器ABI 7500Fast Real-time （Thermal Cycler Applied Biosystems ，Foster City ，CA ，United States ）中进行。设置反应参数
为：95益预变性30s ，循环一次；95益变性5s ，60益退火30s ，循环40次。PCR 完成后将测得的
表4荧光定量20滋L 的反应体系
所用试剂
添加体积/滋L
DEPC H 2O
06.82伊SYBR Green PCR Mix
10F 引物0.4R 引物0.4ROX reference Dye 域
0.4反转录得到的稀释后cDNA
1一12月的英语单词2604
5期
数据导出，定量结果分析采用2-驻驻Ct 法。1.7
牡蛎生存地点环境参数的统计及样品肥满度的差异
由于2018年8月天气不适宜出远海，因此于
6月、7月和9月分别在3个位置各采集60只长牡
蛎带回实验室，取回后刷洗干净，其中30只用来
分析条件指数。在每个月取样时用YSI 测量取样点海区的温度、盐度、pH 及溶解氧情况。并且现场取水样，置于500mL 聚丙烯（PE ）瓶中，加入20mL 福尔马林固定，将样品带回实验室，送至青岛正源水生物检测有限公司分析浮游植物种类并且计数。
2结果
2.1实时荧光定量PCR （qRT-PCR ）实验结果
通过2-驻驻Ct 方法计算得到了各个基因在每个
取样季节鳃组织中的相对表达量（图2）。发现
HSP70的表达水平在1、3、5月非常低，在6月有了上调的趋势并且在7月份达到了峰值（86.28），然后在8、9月份表达水平骤降（图2a ）。参与代谢的PFK 在1、3、5、6月的表达水平有略微的波动，然后在6月后开始出现显著的上调，在8月份达到最高点，之后又突然降低（图2b ）。在选用的
4个免疫基因中，MPI2在这几个月中的表达量变化情况与FPK 相似，同样在前几个月中没有固定
的趋势，从6月开始上升，至8月到达表达量极大值，然后在9月显著下降（图2c ）。MyD88的表达量也是呈现8月前的递增水平，8月表达水平达到峰值，之后骤降（图2d ）。同样，Lys （图2e ）和IL17（图2f ）的表达水平同样出现了和以上基因类
似的情况，从1月至7月始终保持较低的表达量，8月的表达量飙升至最高点，之后骤降。通过图中
120100806040200
取样月份
6543210
取样月份
12108642
0取样月份
卜算子拼音302520151050
取样月份
140120100806040200
取样月份
6050403020100
五房色播取样月份
图2
各目的基因在牡蛎鳃组织中的表达量。
注：图中每个柱形代表对应取样月份的基因表达量，折线为变化趋势。
a
b
c
d
e
f
魏钰恒等：乳山长牡蛎（Crassostrea gigas ）的抗性基因表达和生存环境的季节差异
皆605
