doi:10.3969/j.issn.1000484X.2021.01.013
miRNA-7靶向SP1的3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建及评价①
刘文莉国东②刘加霏②王玉珊②张焕虎②宋文刚(北华大学医学技术学院，吉林132013)
中图分类号R735.2文献标志码A文章编号1000-484X(2021)01-0072-06
[摘要]目的：构建胃癌细胞核转录因子SP1的3'非翻译区(3忆UTR)双荧光素酶报告基因载体，验证microRNA-7 (miR-7)调控SP1的分子机制。方法：应用相关生物信息学软件预测miR-7靶向作用于SP1基因的3'UTR区；PCR扩增人胃黏膜上皮细胞SP1的3'UTR，插入至psiCHECK2载体双荧光素酶基因下游，构建野生型(w-3'UTR)和突变型重组表达载体(m-3'UTR)，鉴定正确后，分别与miR-7模拟物(mimics)/抑制物(inhibitor)/阴性对照物(NC)共转染胃癌细胞MKN45，检测荧光素酶活性及SP1表达情况。结果：成功构建SP1的3'UTR野生型(psiCHECK2-SP1-w-3'UTR)和突变型(psiCHECK2-SP1-m-3'UTR)表达载体，双荧光素酶报告基因检测显示w-3'UTR/miR-7-mimics组的相对荧光素酶活性表达受抑制，与miR-7NC组比较降低75%，差异具有统计学意义(P<0.001)，而m-3'UTR/miR-7-mimics组的活性表达没有受到影响(P>0.05)。RT-PCR 和Western blot检测结果显示miR-7-mimics组SP1表达水平低于miR-7NC组(P<0.001)，而miR-7-inhibitor组SP1表达水平高于miR-7NC组(P<0.001)o结论：成功构建SP1的3'UTR野生型双荧光素酶报告基因表达载体,miR-7能够显著降低其荧光素酶活性，提示miR-
7能靶向负调控SP1的表达。
[关键词]microRNA-7；SP1基因；双荧光素酶报告系统;MKN45；胃癌
Construction and evaluation of dual-lucifera reporter gene vector bad on miRNA-7targeting nuclear transcription factor SP1-3'UTR
LIU Wen-Li,GUO Dong,LIU Jia-Fei,WANG Yu-Shan,ZHANG Huan-Hu,SONG Wen-Gang.School of Medical Technology,Beihua University,Jilin132013,China
[Abstract]Objective:To construct the dual lucifera reporter plasmid psiCHECK2-SP1-w-3'UTR and its mutant plasmid psi-CHECK2-SP1-m-3'UTR in order to clarify the molecular mechanism of microRNA-7(miR-7)regulating gastric cancer cell SP1 expression.Methods:Relevant bioinformatics software was ud to predict miR-7targeting the3'UTR region of SP1gene.The full quence of SP13'UTR gene was amplified and inrted into the downstream of lucifera gene in psiCHECK2vector.A wild type of dual lucifera reporter plasmid of psiCHECK2-SP1-w-3'UTR was constructed.Meanwhile,a modified type of dual lucifera reporter plasmid psiCHECK2-SP1-m-3'UTR was constructed by fusion PCR.When both of vectors were verified by PCR,restriction endonuclea and DNA quencing to be true,they were cotransfected into gastric cancer MKN45ce
lls with miR-7mimics,miR-7 inhibitor and miR-7NC totally.Afterguards,the relative lucifera activity and SP1was detected.Results:The two kinds of double lucifera reporter plasmid psiCHECK2-SP1-w-3'UTR and its mutant plasmid psiCHECK2-SP1-m-3'UTR were constructed and confirmed by enzyme digestion and quences.The double lucifera reporter experiment showed that overexpression of miR-7could significantly inhibit the relative lucifera activity of psiCHECK2-SP1-w-3'UTR,and the difference was statistically significant(P< 0.001),with no effect on the expression of psiCHECK2-SP1-m-3'UTR(P>0.05).Rt-PCR and Western blot results showed that SP1 expression level of miR-7-mimics group was lower than that of miR-7NC group(P<0.001),while SP1expression level of miR-7-inhibitor group was higher than that of miR-7NC group(P<0.001).Conclusion:We successfully constructed the dual lucifera reporter plasmid and its mutant plasmid bad on psiCHECK2-SP1-3'UTR,which can be ud to elucidate the molecular mechanism of miR-7regulating gastric cancer cell SP1expression.
[Key words]microRNA-7；SP1；Dual lucifera reporter plasmid；MKN45；Gastric cancer
①本文为北华大学研究生创新项目(北华研创合字[2019]074)；威海市医学微生物与免疫学重点实验室项目(2017GGH08)；山东省自然科学
基金(ZR2020QC073)。
②山东大学附属威海市立医院中心实验室，威海264200o
黯的意思作者简介：刘文莉，女，在读硕士，主要从事微生物检验方面的研究,E-mail：。
通信作者及指导教师：张焕虎，男，医学硕士，教授，硕士生导师，主要从事胃肠道疾病机制研究与临床应用方面的研究，E-mail：whzhanghuanh 。
宋文刚，男，医学博士，教授，硕士生导师，主要从事分子免疫学方面的研究，就职于北华大学医学院，吉林132013,
E-mail：。
SP1属于SP/KLF(Kruppel-like factor)转录因子家族，可通过调节癌基因及抑癌基因、肿瘤细胞凋亡等方式，调控多种肿瘤细胞生长周期相关信号传导途径［1］。研究发现SP1与胃癌的发生发展密切相关，在胃癌患者中，SP1高表达患者的生存时间明显低于弱表达或者低表达的患者，下调SP1的过表达可以抑制胃癌肿瘤的增殖和瘤细胞的形成［2］。粉点福利导航
微小RNAs(microRNAs)是真核细胞生物内源性的具有调控功能的非编码RNA，其成熟体通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，根据互补的程度指导沉默复合体降解靶基因或阻碍mRNA的翻译［3］。miR-7自2001首次在果蝇中发现以来，在许多癌症中表达降低，发挥抑癌基因的作用⑷。最近研究发
现,miR-7在胃癌组织和胃癌细胞中均显著下调，已逐渐成为胃癌诊断和治疗的靶标［5］。miR-7可通过抑制mTOR(mechanistic target of rapamycin)的表达，增强胃癌细胞对顺铂的敏感性［6］；通过抑制上皮生长因子受体和胰岛素样生长因子1受体的表达，抑制胃癌细胞的侵袭和转移能力［7］。基于上述理论,miR-7与SP1可能存在某种联系，但目前没有关于miR-7作用于SP1对胃癌参与调控的相关研究报道。
本研究拟通过构建双荧光素酶报告质粒及突变质粒，以阐述miR-7调控胃癌细胞SP1表达的分子机制，为研究miRNAs在胃癌中的作用提供新的思路。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂细胞总RNA抽提取试剂盒、质粒抽提试剂盒、通用型DNA纯化回收试剂盒购于TIANGEN公司；50bp DNA ladder,D2000DNA Marker、1kb plus DNA ladder、Pro-Light HRP化学发光检测试剂购于天根生化科技(北京)有限公司；实时荧光定量PCR(qPCR)试剂盒、cDNA合成试剂盒、2xTaq酶、DNA聚合酶、dNTP、T4连接酶、限制性内切酶Xho I、Not I购于宝日医生物技术(北京)有限公司；miR-7mimics、mimics-NC、miR-7inhibitor 购于上海吉玛制药技术有限公司；1640培养基、胎牛血清(fetal bovine rum,FBS)购于TaKaRa公司；Lipofectamine2000购于美国Thermo Sci
entific公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天公司；SP1抗体、GAPDH抗体及二抗均购于武汉三鹰公司；PCR 引物合成及测序由北京Thermo Scientific公司完成。大肠埃希菌感受态细胞DH5琢及双荧光素酶报告载体psiCHECK2由威海市立医院中心实验室馈赠。1.1.2细胞株健康人胃黏膜上皮细胞GES-1细胞株、人胃癌细胞株MKN45购于上海中科院细胞库。
1.1.3仪器设备MCO-18AIC细胞培养箱(Panasonic,Japan)；ChemiDoc XRS+化学发光成像系统、Synergy H4多功能酶标仪、荧光定量PCR仪(Bio-Rad, USA)；Nano-200超微量核酸分析仪(奥盛，广州)。
1.2方法
1.2.1microRNA-7靶基因预测利用Targetscan (http：//www.targetscan/vert_72/)和miRDB (mirdb/)生物信息学技术相关软件预测miR-7的靶基因以及miR-7与SP1-3'UTR序列配对分析。
1.2.2GES-1细胞的培养和基因组DNA提取GES-1细胞株培养于1640培养基(含10%胎牛血清+1%的青霉素/链霉素双抗),37益、5%C02培养箱。当细胞汇合度为80%时，收集细胞，用细胞基因组快速抽提试剂盒，按照说明书提取细胞基因组DNA，用2%凝胶电泳检测DNA完整性并用超微量核酸分析仪检测浓度。
1.2.3PCR扩增SP1-3'UTR基因片段从NCBI数据库中下载人源SP1基因序列(NM_138473.3)，应用Prime primer5.0软件设计SP1-3'UTR特异性引物，在引物的前端加入Xho I和Not I两个限制性内切酶位点和保护性碱基(表1)。以提取GES-1细胞的基因组DNA为模板,PCR扩增SP1-3'UTR区miR-7结合位点。PCR体系：2xTap10滋l，上引物0.5滋l，下引物0.5滋l，模板2滋l，水8滋l。PCR反应条件为:94益预变性5min；95益变性30s,58益退火30s,72益延伸15s，共35个循环；最后72益延伸5min。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。使用凝胶回收试剂盒回收目的片段，用于后续连接反应。
表1用于扩增SP1及3忆UTR特异性引物序列
Tab.1Oligonucleotide primers for SP1and3'UTR ud in PCR
Primer name Primer quence(5'-3')
SP1-w-3'UTR-F CCGCTCGAGCGTCATGTGCTCAGAAGAGGAAAT
SP1-w-3'UTR-R
ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATATTCACTGG-
CTGATGCTCC
SP1-m-3'UTR-R1AAACTTAGAGCTACCTACCTTGACA
SP1-m-3'UTR-F1TGTCAAGGTAGGTAGCTCTAAGTTT RT-SP1-F GTGGAGGCAACATCATTGCTG
RT-SP1-R GCCACTGGTACATTGGTCACAT
Note:SP1-W-3'UTR-F underline:XhoI restriction site；SP1-W-3'UTR-R underline: Not I restrictin site.
1.2.4野生型表达载体psiCHECK2-SP1-w-3'UTR的构建及鉴定将PCR产物纯化后采用Xho I和Not I 双酶切37益过夜。回收酶切片段，插入到荧光素酶报告载体psiCHECK2的对应位点，连接体系如下: 3'UTR7滋l,XhoI、NotI双酶切纯化psiCHECK21滋l, 10xT4DNA buffer1滋l,T4连接酶1滋l，水补至10滋l, 16益连接过夜。转化DH5琢感受态细胞，挑取单菌落接种于氨苄抗性的LB液体培养基中培养筛选阳性克隆，按照DNA提取试剂盒说明书步骤，提取psiCHECK2-SP1-w-3'UTR质粒进行Xho I.Not I酶切鉴定，将鉴定正确的质粒送去生工生物工程公司（上海）测序。
1.2.5突变型表达载体psiCHECK2-SP1-m-3'UTR的构建及鉴定以1・2.4中构建的psiCHECK2-SP1-w-3'UTR为模板，分别以SP1-w-3'UTR-F和SP1-m-3' UTR-R1为引物扩增片段F1,SP1-m-3'UTR-F1和SP1-w-3'UTR-R为引物扩增片段F2，再以F1和F2为模板，以SP1-w-3'UTR-F和SP1-w-3'UTR-R为引物，通过融合PCR技术扩增F3片段（对miR-7的结合位点进行了连续4个碱基突变），经回收、酶切和
纯化后插入到双荧光素酶报告载体psiCHECK2的对应位点，转化感受态细胞，筛选阳性克隆，经测序后保存。1.2.6细胞分组及转染将MKN45细胞接种于12孔板中，每孔2x106个细胞，培养过夜，当细胞密度达到70%〜80%时，分别将:psiCHECK2-SP1-w-3'UTR 和miR-7mimics,psiCHECK2-SP1-m-3'UTR和miR-7 mimics,psiCHECK2-SP1-w-3'UTR和miR-7inhibitor, psiCHECK2-SP1-m-3'UTR和miR-7inhibitor及各自阴性对照mimics-NC，通过Lipofectamine2000进行瞬时转染MKN45细胞,37益培养,6h后更换细胞培养液，培养48h后取出，用PBS洗涤3次，每孔加入1ml总RNA裂解液，置摇床震荡充分裂解后，离心吸取上清裂解液提取总RNA并测定浓度后，置-80益冻存备用。
1.2.7双荧光素酶报告基因活性检测转染48h 后，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行操作，最后利用Synergy H4多功能酶标仪读取荧光值并计算相对荧光活性。
1.2.8RT-PCR检测SP1和miR-7的表达变化提取待分析细胞的总RNA和microRNA后，分别采用逆转录试剂盒进行反转，反转条件为42益15min,85益5min后置-20益保存备用。按照UltraSYBR Mixture 试剂盒说明书进行实验，采用2-驻驻CT方法计算目的基因的倍性变化。每个实验组设3个平行，重复3次实验并记录实验结果。1.2.9Western blot检测SP1的表达变化提取待分析细胞的总蛋白，并用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。GAPDH作为内参。上样30滋g蛋白进行电泳，通过湿转法将蛋白转到PVDF膜上,5%脱脂奶粉中37益封闭1h后添加一抗,4益孵育过夜, TBST漂洗4次后添加辣根过氧化物酶HRP标记的二抗，室温孵育1h后TBST漂洗4次，最后采用ProLight HRP化学发光检测试剂盒显色，并
用ChemiDoc XRS+化学发光成像系统采集图像。
1.3统计学分析研究中所有数据采用SPSS17.0软件进行统计处理。每组实验重复3次，结果以x±s 表示。统计分析采用单因素方差分析或t检验,P< 0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1microRNA7靶基因预测使用Targetscan、miRDB和Cytoscape软件对miR-7的靶基因进行预测。Targetscan的标准是Contest+<-0.4,miRDB的标准是>80。将两个数据库的预测结果进行交叉，得到46个目标基因。利用在线数据库（https：//string-db/）Cytoscape软件（version11.0）进行可视化，建立包括蛋白质和基因在内的众多生物分子之间的相互作用网络（图1A）。发现miR-7与SP1的3'UTR 区有潜在结合位点（图1B）o
2.2荧光素酶报告载体psiCHECK2-SP1-w-3'UTR的鉴定以提取的GES-1细胞基因组为模板,PCR扩增SP1-3'UTR目的片段,1.5%琼脂糖凝胶电泳显示扩增出的片段大小约为220bp，大小与预期相符（图2A）o采用凝胶回收试剂盒回收扩增产物与载体psi-
miR-7-5p:3'-ACCUUCUGUCGUCAUGGUUUCAG-5'
IIIIIII
spl・w$UTR:5,-...3'
spl-m・3'UTR:5'-...3'
图1miR-7靶基因预测网络图及与SP13'-UTR序列配对分析
Fig.1miR-7target gene prediction website and quence pairing analysis of SP13'-UTR
Note:A.miR-7target gene prediction website； B.Sequence pairing analysis of SP13'-UTR with
miR-7.
湄公河行动真实事件图2psiCHECK2-SP1-w-3忆UTR的质粒构建及酶切验证Fig.2Construction of psiCHECK2-SP1-w-3'UTR and
validation by enzyme digestion
Note：A.Agar gel electrophoresis of SP1-3'UTR product by PCR；B.Agar gel electrophoresis of constructed wild plasmid verified by enzyme
digestion.M1.DL2000marker；M2.50bp ladder； 1.Target fragment;2,3.Verified by restriction endonuclea with two en-
zymes.
图3psiCHECK2-SP1-m3忆UTR的质粒构建及鉴定
Fig.3Construction of psiCHECK2-SP1-m3'UTR and validation by enzyme digestion
Note：A.Agar gel electrophoresis of SP1-3'UTR product by PCR；B.Agar gel electrophoresis of constructed wild plasmid verified by enzyme
digestion； C.Comparison of wild and modified3'UTR
quences.M1.DL2000marker； 1.Target fragment F1； 2.Target fragment F2； 3.Fusion fragment； 4.Verified by restriction
endonuclea with two enzymes.
CHECK2连接，转化感受态受体菌DH5a，经氨卞抗性筛选挑取单菌落，经PCR鉴定，挑选鉴定正确的菌落摇菌，抽提质粒，经Xho I和Not I双酶切后验证，在220bp处可见酶切片段，与预期SP1片段大小相符（图2B）。初步证实目的基因已经插入到质粒载体中。重组质粒测序结果表明，目的基因成功克隆入载体，并且其序列与GeneBank中公布的一致。
2・3双荧光素酶报告质粒psiCHECK2-SP1-m-3' UTR的鉴定以2.2中构建成功的荧光素酶报告载体psiCHECK2-SP1-w-3'UTR为模板。融合PCR 技术依次扩增片段F1,F2和F3（图3A、B）。经酶切及测序鉴定F3片段含有与miR-7结合的4个碱基突变位点，由TTCC突变为AAGG（图3C）。
2.4双荧光素酶报告实验双荧光素酶报告实验
图4双荧光素酶活性分析野生型与突变型psiCHECK2-SP1-3忆UTR在胃癌MKN45细胞表达情况
Fig.4Analysis of dual relative lucifera activity of psi-CHECK2-SP1-w-3'UTR and psiCHECK2-SP1-m-对大学生的寄语
3'UTR in gastric cancer MKN45cells
Note:Compared with the w-3'UTR+NC,Rluc/Luc of the w-3'UTR+ miR-7,***.P<0.001；Compared with the m-3'UTR+NC,Rluc/ Luc of the m-3'UTR+miR-7,ns.P>0.05.
图5miR-7模拟物及抑制剂对MKN45细胞中miR-7的表达影响
Fig.5Expression change of miR-7in miR-7mimic and inhibitor transfected MKN45cells
Note：A.Compared with the miR-7-NC,expression of miR-7in the w-3' UTR+miR-7-mimic,***.P<0.001；B.Compared with the miR-7-NC,expression of miR-7in the w-3'UTR+miR-7-inhibitor,***
示儿宋陆游.P<0.001.
结果显示，与阴性对照mimics-NC相比，转染miR-7-5p 能显著降低转染psiCHECK2-SP1-w-3'UTR的MKN45细胞的相对荧光活性比值(Rluc/Luc)(P<0.001)，而对转染psiCHECK2-SP1-m-3'UTR的MKN45细胞的Rluc/ Luc未有明显改变(P>0.05)(图4)。
2.5miR-7在胃癌细胞中负调控SP1的表达miR-7mimic及miR-7inhibitor转染胃癌MKN45细胞，经48h培养提取细胞总RNA、microRNA和总蛋白，分别通过qRT-PCR和Western blot检测SP1的表达变化。结果发现，与转染阴性对照相比，转染miR-7mimic促使miR-7过表达(图5A)，同时在mRNA水平和蛋白质水平抑制细胞内SP1的表达(P<0.001)，而转染miR-7inhibitor则抑制内源性miR-7的表达(图5B)，同时促进SP1的表达(P< 0.001)(图6和图7)
。
图6 miR-7模拟物及抑制剂对MKN45细胞SP1-mRNA
的表达影响
GAPDH
Fig. 6 Expression of mRNA-SP1 of miR-7 mimic and
inhibitor in gastric cancer MKN45 cells
Note ：A. Compared with the miR-7-NC, expression of SP1 -mRNA in the
w-3'UTR + miR-7-mimic , ***. P <0. 001 ； B. Compared with the
miR-7 -NC , expression of SP1 -mRNA in the w-3' UTR + miR-7 - inhibitor,***. P<0. 001.
NC
miR-7 mimic
图7 miR-7模拟物及抑制剂对MKN45细胞中SP1蛋白
的表达影响
Fig. 7 Expression of SP1 protein of miR-7 mimic and
inhibitor in gastric cancer MKN45 cells
Note ：A. Compared with the miR-7-NC, SP1 protein in the w-3' UTR +
miR-7 mimic, *** . P <0. 001 ； B. Compared with the miR-7-NC , SP1 protein in the w-3 'UTR+miR-7 inhibitor , ***. P <0. 001.
SP1 3讨论
正常情况下,SP1在体内各种细胞中广泛表达 并受机体的严格调控，具有高度保守序列，通过直接
与启动子结合调节基因的表达⑺，目前SP1已被公
认为是促癌蛋白，在调控肿瘤细胞增殖和凋亡过程
中发挥重要作用。已在多种肿瘤类型中得到证实,
在胃癌、胰腺癌和乳腺癌等癌症中则表现为高表达,
且其表达水平与肿瘤的分级和分期、侵袭和转移能 力及患者的生存期和不良预后密切相关，如同一胃
癌患者的胃癌组织中SP1的表达水平显著高于周围 正常组织，且与肿瘤的浸润程度呈正相关⑻；SP1高 表达的胃癌患者的中位生存期显著低于SP1低表达
或不表达的胃癌患者［9］。SP1可以与Smad 蛋白形
成化合物，从而诱导Smad7的转录和过表达，并负
向调节TGF-茁途径，从而影响胃癌细胞的生长、分
化和凋亡［⑹。SP1的异常激活还可以上调肿瘤相 关因子和血管生成因子的表达，从而为肿瘤生长提
供良好的微环境，并促进胃和胰腺肿瘤的增殖、转移 和血管生成〔⑴。SP1被血管内皮生长因子的启动
子募集，因其表达上调，促进了血管内皮的增殖、血
管生成并增加了血管的通透性，从而促进了肿瘤的
生长和转移。已经发现SP1表达的增加与胃癌患者
预后的恶化程度呈正相关〔⑵。同样,miR-7发挥抑
癌基因的作用,miR-7在胃癌细胞中表达低下，可通
过靶向胰岛素样生长因子受体1抑制胃癌细胞的转
移〔⑶。谭海洋等［14］报道miR-7上调可抑制胃癌细神奇催眠术
胞增殖，促进细胞凋亡。当microRNA 与mRNA 存
在互补配对时，降解mRNA 合成新生多肽链，抑制
其翻译，从而调节细胞的增殖、分化、凋亡及肿瘤的
背影图片女唯美
形成和转移等一系列的重要生物学过程［⑸。
本实验通过生物信息学方法预测miR-7的潜在
靶基因，依据算法对miR-7靶分子的样本群进行评
分,Targetscan 的标准是 Contest+<-0. 4 , miRDB 的标 准是>80，通过基因重组和PCR 技术在胃癌细胞中
瞬时转染miR-7，分别从mRNA 和蛋白质水平验证
了 miR-7对胃癌细胞负调控SP1的表达情况。
在本研究中，对胃癌细胞MKN45共转染miR-7
模拟物和抑制剂，miR-7可以在mRNA 和蛋白质水
平抑制细胞内SP1的表达，而转染miR-7抑制剂后
则逆转对SP1的抑制作用。发现miR-7可能是胃癌
细胞中负性调控SP1活性的重要反馈调控机制，并
初步构建psiCHECK2-SP1 3'UTR 荧光素酶报告载
体，通过双荧光素酶报告实验对miR-7负调控SP1 的功能进行验证，以验证miR-7通过调控SP1参与
胃癌发生发展的潜在机制。
本实验扩增出长度为220 bp 的SP1 3'UTR 基
因序列, 并将其连入荧光素酶报告载体, 成功构建了
pisCHECK2-SP1 3'UTR 表达载体。miR-7可能通过
作用于SP1的3'UTR 区域对该基因进行靶向调控,
实现对胃癌细胞发生发展的调节。关于miR-7通过
调控SP1参与胃癌发展的信号传导机制，本课题组微波炉怎么用
将会在后续研究中不断探索。
参考文献：
［1 ］ WIERSTRA I. Sp1 ： emerging roles --beyond constitutive activation
of TATA-less houkeeping genes ［ J ］. Biochem Biophys Res
Commun,2008,372(1)：1-13. DOI ：10. 1016/j. bbrc,2008. 03.
074.
