・综述・ 抗真菌药物耐药机制的研究进展
毛琼蕾陈小清房月
近年来，随着抗真菌药、广谱抗生素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂在临床上的广泛应用，条件致病菌感染发生率急剧增加，真菌的耐药性也在不断加重。耐药真菌所致的深部感染，已成为临床治疗失败的一个重要原因，抗真菌研究面临克服真菌耐药性的问题。本文按耐药机制发生的频率，综述相关耐药机制的研究进展。
目前研究认为，真菌耐药性的产生机制主要有以下几种：（1）真菌细胞内药物累积减少；（2）药物靶酶产生增多或靶酶结构改变；（3）靶酶的缺失，导致细胞代谢途径的改变；（4）生物被膜形成；（5）细胞壁的合成障碍；（6）细胞应激反应[1-2]。耐药菌株的各种耐药机制既可以单独起作用，也可以两种或多种机制同时起作用。一般情况下，参与耐药的机制越多，耐药程度越重[3]。
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一、耐药真菌细胞内药物浓度的降低
研究发现敏感念珠菌细胞内唑类药物的浓度约是细胞外药物的浓度的3倍，而耐药菌株胞内唑类药物的浓度反而约为胞外的一半[4]。目前多从两个方面来解释耐药真菌细胞内药物浓度降低的现象：（1）真菌膜通透性减低，使可进入胞内的药物减少。（2）细胞膜上参与药物外排有关的运载蛋白的表达上调，是现在认为许多耐药真菌细胞内药物浓度降低的主要原因。
目前比较明确的与外排泵有关的运载蛋白有两大类，一类是含ATP结合区的ABC转运蛋白超家族（ATP-binding castte transporters，ABCT），其中Cdr1p（candida drug resistance protein）和Cdr2p是对唑类药物产生耐药最主要的ABCT[2]。CDR1为白色念珠菌中最先发现的外排泵基因。大多数对氟康唑耐药的白色念珠菌株中均发现CDR1超表达[5]。Cdr1p的表达使白色念珠菌产生对氟康唑耐药性比Cdr2p的表达影响更大[6]。Cdr2单独破坏株并未显示对唑类药物高度敏感，Cdr1和Cdr2同时破坏株显示对唑类药物高度敏感[7]。研究发现特比萘芬的耐药性也与外排泵有关。白色念珠菌在特比萘芬的作用下，细胞内Cdr1和Cdr2的表达会相应的上调[8]。以前认为菌株对卡泊芬净耐药与外排泵无关，但有文献报道ABCT中Cdr2p的过表达会导致对卡泊芬净耐药[9]。
另一类是通过电化学势能进行被动转运药物的易化扩散载体超家族（major facilitator superfamily，MFS）。研究较明确的与真菌耐药性有关的MFS蛋白主要是Mdr1p。Schubert等[10]研究发现念珠菌中MRR1（multidrug resistance regulator）基因序列单个核苷酸的替换或小框架的缺失，相应的Mrr1p氨基酸
DOI: 10. 3877/cma. j. issn. 1674-0785. 2013. 14. 110
作者单位：110001沈阳，中国医科大学药学院药理学教研室（毛琼蕾、房月）；浙江大学医学院附属第一医院（陈小清）
通讯作者：房月，Email: u.edu 生变化，使MDR1（Multidrug Resistance）的启动子活化，Mdr1p 的生成增加而产生耐药。Morschhäur等[11]也通过全基因组的基因表达分析，研究确定锌簇转录因子MRR1可使MDR1的表达上调，产生对白色念珠菌株的耐药性。
二、药物作用靶酶质或量的变化
真菌改变抗真菌药物靶位蛋白构型的方式主要有2种：（1）改变靶位蛋白与抗真菌药的亲和力。唑类药物作用的靶酶是14-α-去甲基化酶，由ERG11基因编码。ERG11的突变可以改变14-α-去甲基化酶的氨基酸序列，当这种改变足以影响酶分子的空间构型时，酶分子与药物分子间的亲和力可能被削弱，导致菌株耐药[12-14]；烯丙胺类药物作用的靶酶是麦角甾醇合成酶，由ERG1编码。一些对特比萘芬耐药的菌株ERG1上单个碱基对的突变，使麦角甾醇合成酶中的一个氨基酸（L251F/F433S）发生改变，麦角甾醇合成酶的活性就会随之降低，导致对特比萘芬的耐药[15]。这种氨基酸替换现象仅在使用特比萘芬的情况下出现，而使用其他的抗真菌药未出现这种现象[16]。（2）增加靶蛋白数量，使未结合的靶蛋白仍能维持真菌的正常形态与功能。一些菌株ERG11基因的拷贝数增加，14-α-去甲基化酶会过度表达，唑类药物不能完全抑制该酶的活性，较高浓度的唑类药物细胞仍能继续生长而出现对唑类耐药[17-18]。
三、抗真菌药物作用靶点的缺失
真菌代谢通路中一些酶的缺失，使真菌代谢不能完全按照原有的途径进行，而采用旁路途径进行代谢，有些抗真菌药会因此缺乏原有的作用位点而失去对真菌的作用。
唑类药物通过抑制14α-去甲基化酶的活性，使羊毛固醇不能转换为14-去甲基羊毛固醇，从而阻断麦角固醇的合成。羊毛固醇在14α-还原酶的催化下生成14-甲基类固醇，后者在由ERG3基因编码的△5，6-去饱和酶催化下生成14-甲基-3，6-二醇。麦角固醇的缺乏和14-甲基-3，6－二醇的堆积抑制了真菌的生长。部分真菌由于ERG3基因的突变，△5，6-去饱和酶失活，使14-去甲基类固醇在细胞内积累，它能部分替代麦角甾醇的功能，维持真菌细胞生长，从而对唑类耐药[5,19]。
氟胞嘧啶类药物主要通过细胞内胞嘧啶脱氨酶（cytosine deamina，CD）和尿嘧啶磷酸核糖转移酶（uracil phosphoribosyl transfera，UPRT）转化成氟尿嘧啶脱氧核苷（floxuridine，FUDR），FUDR进一步磷酸化可结合到RNA上，抑制蛋白质的合成。另外，5-FU经一系列转化可抑制胸苷酸合成酶，干扰DNA的合成[20]。真菌对氟胞嘧啶的天然耐药多是由于编码胞嘧啶脱氨酶的基因FCY1的突变，真菌缺失CD或UPRT，使FC不能转化为FUDR[21]。
四、生物被膜形成绩效英文
生物被膜是指微生物分泌于细胞外的多糖蛋白复合物，将自身包裹其中于生物表面形成的膜状物。膜内菌细胞的形态常与浮游菌不同，且对药物的敏感性差，其耐药机制可能与下列
因素有关：（1）胞外聚合物基质形成膜屏障；（2）对生物膜中的细胞营养限制而使菌株生长缓慢；（3）表面诱导性耐药基因的表达；（4）抵御机体的免疫防御[22-25]。细胞被膜的产生，使许多真菌对目前临床应用的包括两性霉素B和唑类药的大多数抗真菌药具有高度耐受性，是导致临床上许多真菌感染难以根除的重要因素。
五、细胞壁的改变
细胞生长和形态改变过程中，细胞壁的合成和修护受到严密的调控，细胞壁在许多抗真菌药物的刺激下会产生适应性改变而耐药[26]。在棘白菌素类药物的作用下，耐药真菌的部分受体Wsc1和Mid2会介导细胞壁出现相应的反应。Wsc1作为一个专一的传感器和激活剂，激活压力信号肽Slt2，通过补救途径，使细胞壁重新合成[27]。细胞壁组分的变化是多烯类药物耐曲霉菌的机制之一。两性霉素B通过对细胞壁的作用，限制念珠菌在指数生长期的生长，其耐药性产生于细胞壁葡聚糖的变化。酵母菌对两性霉素B耐药性产生于细胞壁几丁质含量低时。
六、细胞应激反应
抗真菌药通过降低真菌对环境变化的敏感性，来发挥药物的毒性作用。而有些真菌通过大量的信号传导通路，产生一定的生理机制适应环境的变化。一些真菌在应激条件下，可产生细胞应激基因。近年研究发现，与氧化应激反应有关的基因有YHB1、AOX1、AOX2、CTA1、SOD2和GSH1等。其中，Y
HB1编码黄素血红蛋白，它在酿酒酵母受到氧化刺激后保护细胞免受损伤。AOX1和AOX2编码交替氧化酶，SOD2编码超氧化物歧化酶，CTA1编码过氧化物过氧化氢酶，GSH1编码谷胱甘肽合成酶，这些基因都是白色念珠菌调节氧化还原状态的重要基因[28-29]。
真菌在有唑类药物的环境中，其电信号通路会发生相应的改变。真菌暴露在含灰黄霉素和噻康唑的培养基中，会有相同的酯酶表达，这种现象可能是细胞内的一种非特异的应激反应，也可能参与细胞内的解毒，导致真菌对唑类药物耐药[30-31]。Yu 等[32]报道了将红色毛癣菌暴露在低于最低致死浓度的AmB时，编码细胞应激相关蛋白的基因表达会上调，并表达一些蛋白，如Hsp70，Hsp104，泛素，氧化应激蛋白（谷胱甘肽合成酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶），同时，AmB也会抑制其他相关应激反应蛋白的表达。这一现象提示细胞在应激条件下存在复杂的耐药机制。
真菌的耐药机制除上面提到的外，还与药物的药代动力学，宿主的免疫机能，合并其他感染等诸多因素有关，而且不断有难以解释的现象和新的机制被发现。要全面准确地阐明真菌耐药机制，有待进一步深入细致的研究工作。近年来一些医药工作者试图采用联合用药方案，运用抗菌增效剂克服真菌的耐药[33]。今后新型抗真菌药物的研究方向可致力于对已有先导化合物进行优化，深入研究各类药物与靶点的作用机制和耐药机制，同时应用真菌基因组学、分子模拟技术和组合化学技术等新方法、新技术研究，以开发出新一代低毒、高效、广谱的抗真菌药物[34-35]。
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（收稿日期：2013-05-20）
（本文编辑：梁雷）
毛琼蕾，陈小清，房月. 抗真菌药物耐药机制的研究进展［J/CD］. 中华临床医师杂志：电子版，2013，7（14）：6660-6662.
