对于全世界许多研究者， Novagen 的 pET 系统已成为在大肠杆菌中蛋白表达的首选。该系统成功的一个主要原因是目标基因被克隆到不为大肠杆菌 RNA 聚合酶识别的 T7 启动子之下，因此在加入 T7 RNA 聚合酶之前几乎没有表达发生。克隆到 pET 载体的基因实际上是被关闭的，不会由于产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定。重组质粒转移到染色体上含有一拷贝由 lacUV5 控制的 T7 RNA 聚合酶基因的表达宿主中，并通过加入 IPTG 诱导表达；也可通过 l CE6 感染原始克隆宿主菌来提供 T7 RNA 聚合酶。使用大肠杆菌启动子系统 ( 如 tac 、 lac 、 trc 、 pL) 有困难的许多基因已经在 pET 系统中稳定克隆和表达。 T7 RNA 聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞资源都用于为目标基因表达。诱导后几小时目标产物就可超过细胞总蛋白的 50% 。
早安正能量简单一句话 新开发的 T7 驱动表达技术以 pETBlue TM 系统为代表。 pETBlue 载体包括了 pET 用于表达的优点，在目标基因克隆和质粒 DNA 操作的方面更为方便。
pETBlue TM 系统：新一代 T7 表达载体
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pETBlue 载体代表了新型表达载体，它具备所有广受欢迎的克隆载体的最理想特点和 T7 驱动蛋白表达的完全功能。目标基因以相对于修饰的大肠杆菌 tet 启动子的反义方向插到 lacZ
a - 肽编码区，因此可进行蓝 / 白斑筛选。正确定位于目标基因正义方向上游的 T7 转录和翻译信号使表达成为可能。与标准 pET 载体一样，通过转化 λ DE3 溶原菌并用 IPTG 诱导或通过 l CE6 感染原始宿主菌生产目标蛋白。
优点
· 蓝 / 白斑筛选，便于克隆
· 高拷贝数，质粒 DNA 高产
· 以 AccepTor TM 载体或 perfectly Blunt a 载体形式提供，便于快速 PCR 克隆
· 目标基因无基础水平表达，消除了毒性基因产物相关的质粒不稳定性
· 表达水平与经典 pET 载体相同
· 用 Tuner TM (DE3)pLacI 宿主菌实现真正的表达水平“变阻器”控制。
PET 系统：大肠杆菌中蛋白表达的金字招牌
pET 载体中，目标基因克隆到 T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供 T7 RNA 聚合酶来诱导表达。 Novagen 的 pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括 36 种载体类型、 15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。
优点
· 是原核蛋白表达引用最多的系统
· 在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低
· 真正的调节表达水平的“变阻器”控制
移动流量怎么查· 提供各种不同融合标签和表达系统配置
· 可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌
· 许多载体以 LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆 PCR 产物喂奶姐
· 许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化
阳性 pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆 PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。
pETBlue TM 系统
弟弟别这样T7 驱动的严紧控制表达、蓝 / 白斑筛选、质粒产量高
新颖的 pETBlue TM 系统兼有广受欢迎的蓝 / 白斑筛选载体所具有的通过目测确定重组体和高质粒拷贝数，以及 pET 载体严紧控制的高蛋白表达等特点。蓝 / 白斑筛选通过使用弱组成型大肠杆菌启动子 ( tet ) 驱动 lacZ a - 肽表达而实现，而目标基因表达由相反方向的 T7 启动子驱动。目标序列插入多克隆位点（ MCS ）破坏了 lacZ a - 肽的表达，在 NovaBlue 菌株中当存在 x-gal 时产生白菌落表型，而带有非重组载体的菌落变蓝。由于 T7 驱动的蛋白表达要求插入片段克隆到相对于 tet 启动子的反义方向，因此实际上没有目标序列的基础表达。相对于 pET 载体， pETBlue 质粒上高拷贝 PUC 复制起点增加了质粒产量，为测序、突变和其它质粒操作带来方便。
如果插入序列相对于 T7 lac 启动子为正义方向且符合每个载体的翻译要求， pETBlue 载
体中目标基因可以高水平表达。用两种方法进行蛋白表达：用 l CE6 （ l pL 启动子控制 T7 RNA 聚合酶表达的噬菌体）感染，或转化重组 pETBlue 质粒到宿主菌 Tuner TM (DE3)pLacI 或 Origami TM (DE3)pLacI 中并用 IPTG 诱导。这些宿主菌染色体上带有一拷贝 lacUV5 控制的 T7 RNA 聚合酶基因，并通过相容的 pLacI 质粒提供足够 lac 阻遏蛋白，以确保低水平的未诱导表达。 Tuner 菌株的 lacY 状态使整个培养细胞被均一的诱导，并随 IPTG 剂量诱导有不同的蛋白表达水平。 Origami 菌株能够增强胞质中二硫键形成。
pETBlue-1
pETBlue-1 便于从 5' 端编码开放读码框架的插入片段表达未融合的天然蛋白。该载体 EcoR V (GATATC) 克隆位点位于强 T7 基因 10 核糖体结合位点（ RBS ）附近。含有 ATG 起始密码子或 5' 端具有一个位置合适的 G 核苷酸插入片段成为一个合适的大肠杆菌翻译起始位点。
pETBlue-2
pETBlue-2 提供了载体编码的 ATG 起始密码子和多种下游克隆位点。 MCS 5' 和 3' 端两套各三个重叠平末端酶切位点便于将任何插入片段克隆到读码框中。在载体确定的读码框中，这些酶产生的平末端终止于密码三联体的不同位置。因此只要插入方向正确，任何插入片段可克隆到经过合适平末端酶切割的载体的读码框中。而且，任何不含内部终止密码子的插入片段都可与 C- 末端 HSV.Tag a 表位和 His.Tag a 序列克隆到同一读码框中。
pETBlue TM PCR 克隆试剂盒
方便地将 PCR 扩增 DNA 直接克隆到 pETBlue 载体中
除了含有未切割质粒的 pETBlue TM 系统， Novagen 还提供可立即插入 PCR 产物的 pETBlue 载体。已有两种试剂盒： AccepTor TM 载体试剂盒能够插入带单个 3' -dA 突出的 DNA ，如非校对 DNA 聚合酶 ( 如 Taq DNA 聚合酶 ) 的扩增产物；而 perfectly Blunt a 克隆试剂盒设计用于克隆任何末端形式的插入片段。
在 pETBlue-1 AccepTor 载体中表达插入基因的引物设计：
pETBlue-1 ：用 5' 端 ATG 开始的正义引物进行扩增，能够确保在大肠杆菌中有效合成蛋
白的 RBS 和翻译起始位点之间的最适距离。目标序列羧基端引物设计没有限制。
Met---
正义引物 5' -ATG XXX ---
品牌组合反义引物 无限制
pET 系统概述
pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由 Studier 等开发的 T7 启动子驱动系统， Novagen 的 pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。
控制基础表达水平
pET 系统提供 6 种载体 - 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。
宿主菌株
对党的祝福质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有 T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（ λ DE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在 λ DE3 溶原菌中， T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有 pLysS 和 pLyE 时调控会更严紧。 pLys 质粒编码 T7 溶菌酶，它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。 pLysS 宿主菌产生低量 T7 溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的 λ DE3 溶原菌。
三个火枪手2有 11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为 BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失 lon 和 ompT 蛋白酶。 B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。 BLR 为 recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株 (AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。 Origami TM 和 OrigamiB 菌株为 trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。 Origami 和 OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的 Rotta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的 tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。
其它菌株背景包括 K-12 菌株 HMS174 和 NovaBlue ，象 BLR 一样为 recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在 F 附加体编码的高亲和力 lacIq 阻遏蛋白， NovaBlue 为一个有用的严紧型宿主菌。此外， Novagen 提供了 λ DE3 溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。表达高毒性基因或制备新的 λ DE3 溶原菌的另一替代方法是通过 l CE6 感染提供 T7 RNA 聚合酶。虽然不如用 IPTG 诱导 λ DE3 溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。
高严紧性 T7 lac 启动子
除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性， pET 系统中 T7 启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：普通 T7 启动子和 T7 lac 启动子。 T7 lac 启动子在启动子区下游 17bp 处含有一个 25bp 的 lac 操纵序列。该位点结合 lac 阻遏蛋白能够有效降低 T7 RNA 聚合酶的转录，这样提供了在 λ DE3 溶原菌中抑制基础表达的第二种基于 lacI 的机制（除了抑制 lacUV5 ）。含 T7 lac 启动子的 pET 质粒还具有它们自己的 lacI ，确保足够的阻遏蛋白结合到操纵基因位点上。
