2021年
第41卷第3期
河北大学学板（令然科学版）
Journal of H e b e i UniversityCNatural Science Edition)
2021
Vol. 41 N o. 3
D O I：10. 3969/j. issn. 1000 - 1565. 2021. 03. 013
小球藻病毒P B C V-1编码的C u，Z n-S〇D酶学稳定性
qq共同好友刘建荣、贾红玉2，陈慧慧2，刘晓飞2，康明2
(1.河北大学生物工程技术创新中心，河北保定〇71002;2.河北大学生命科学学院，河北保定071002)
摘要：将小球藻病毒模式株P B C V-1编码的C u,Z n-S O D截短突变体t c v S O D克隆到大肠杆菌表达
栽体p E T23a(+)后，经I P T G诱导在大肠杆菌R o s e t t a(D E3)菌株中表达得到了可溶性t c v S O D重组蛋白•该蛋白具有典型的S O D活性，能强烈抑制邻苯三酚的自氧化作用，最高抑制率为97%，反应体系中酶蛋白终质量浓度为〇. 2 p g/m L时达到最大抑制，由此计算出其比活力为16 050 U/m g. t c v S O D的热稳定性和对蛋白变性剂S D S胁迫的反应与酶蛋白在反应体系中的质量浓度有关.终质量浓度为1 p g/m L时t c v S O D可以耐90 °C、30 m i n以及质量分数2%〜10%的S D S处理而活性保持不变或略有丧失，终质量浓度为0.05和0. 1 p g/m L时则对上述处理非常敏感.0. 05、0. 1、1p g/m L 3种质量浓度的t c v S O D对反应体系中p H4〜12的变化，以及2〜10 m o l/L尿素和1〜4 m o l/L盐酸胍胁迫处理，酶活性保持恒定•实验结果表明t c v S O D 具有较强热稳定性和p H稳定性，对常见蛋白变性剂也有良好抗性，有进一步开发利用的潜能.
关键词：铜锌超氧化物歧化酶（C u，Z n-S O D)；小球藻病毒；热稳定性；p H稳定性；蛋白变性剂抗性
中图分类号：Q502文献标志码：A文章编号=1000 - 1565(2021)03 -0304 -07
Enzymatic stability of Cu,Zn-SOD
encoded by chlorovirus PBCV-1
LIU Jianrong1, JIA Hongyu2, CHEN Huihui2, LIU Xiaofei2, KANG Ming2
(1. Innovation Center for Bioengineering and Biotechnology, H e b e i University, B a o ding
071002,C h i n a；2. College of Life Sciences, H e b e i University, B a o d i n g 071002, China)
A b stract：A truncated copper, zinc superoxide dismuta e n c o d e d b y the type species P当怎么组词
B
C V-1of chlorovirus? t c v S O D,w a s cloned to an Escherichia coli expression vector p E T23a(+)a n d expresd as soluble r e c o m b i n a n t protein in R o s e t t a(
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D E3)under the induction of isopropyl ^-d-l-thiogalactopyranoside (I P T G).T h i s protein could inhibit the auto-oxidation of pyrogallol strongly, a n d the m a x i m a l inhibition of 97% could be achieved w h e n 0. 2 |n g/m L e n z y m e w a s s u p p l e m e n t e d to the reaction system. T h e specific activity of t c v S O D generated f r o m a b o v e experiments w a s 16 050 U/m g.Thermostability and tolerance of the protein to s o d i u m dodecyl sulfate (S D S) w e r e related to its concentration. T h e activity of t c v S O D r e m a i n e d u n c h a n g e d or lost slightly under the treatment of 90 °C for 30 m i n or 2%—10%of S D S w h e n the final concentration w a s 1^g/m L,but reduced m u c h quicker w h e n that were 0. 05 and 0. 1\ig/m L instead.
收稿日期：2020 -09 -ll
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31470192)；河北省自然科学基金资助项B(C2016201180)
第一作者：刘建荣（1963—），女，河北保定人，河北大学副研究员，主要从事生化与分子生物学研究.
E-mail：****************
通信作者：康明（1962—），男，河北昌黎人，河北大学教授，博士，主要从事微生物代谢工程以及病毒宿主相互作用研究.
E-mail：****************
第3期刘建荣等：小球藻病毒P B C V-1编码的C n，Z n-S()D酶学稳定性305
In contrary to the thermostability a n d tolerance to S D S,t c v S O D w a s very robust to the treatments of w i d e ranges of p H,urea a n d guanidine chloride. T h e results s h o w n in this paper indicated that t c v S O D has high thermostability a n d pH-stability,a nd is tolerant to veral protein denaturants in w i d e ranges, a n d has the potential to be further explored for application as well.
Key w ords：copper, zinc-superoxide dismuta ( C u,Z n-S O D )；chlorovirus；thermostability；p H-stability；tolerance to protein denaturants
活性氧（reactive oxyg en sp ecies，R()S)既可以由有氧生物在正常代谢活动中产生，又可以在胁迫条件下 产生.生理浓度的R O S有益于生物体本身，并参与信号通路活动以及保护生物免于病原体侵染；但高浓度 R()S会破坏生物大分子及细胞结构[|_3]，但细胞能利用超氧化物歧化酶（superoxide dism utaSeS，S O D S)降 解R O S来降低其造成的破坏[4_5].作为金属蛋白，S O D s能将超氧阴离子转化成较低毒性的过氧化氢和分子态氧从而保护生物有机体免受有毒活性氧破坏[s].根据与酶蛋白结合的用于超氧离子淬灭的金属辅基的不同，S O D s被分成铜锌-超氧化物歧化酶（C u，Zn-S O D)，铁-超氧化物歧化酶（F e-S O D)，锰-超氧化物歧化酶 (M n-S O D)，以及镍-超氧化物歧化酶（Ni-S O D).哺乳动物细胞中C u，Zn-S O D位于细胞质中（S O D1)或位 于胞外空间（S()D3)，M n-S O D位于线粒体（S O D2)[7]；高等植物通常具有位于线粒体的M n-S O D、叶绿体 的F e-S O D、细胞质及细胞分室中的多种类型的C u，Zn-S O D[8]；真核藻类和原生动物细胞通常具有M n-SO D 和F e-S O D，缺乏C u，Zn-SC)D；原核生物具有Mn-S O D和/或F e-S O D，但很多革兰氏阴性细菌具有C u,Zn-SO D[w°].Ni-S O D只存在于数种链霉菌中[11].病毒极少编码S O D s，但几类大型D N A病毒如痘病毒（p o xvirus)、杆状病毒 （baculovirus)、拟菌病毒 （m im iviru s)以及藻类 D N A 病毒 （phycodnavirus)却编 码C u，Zn-S O D状基因.除了藻类D N A病毒和一种昆虫痘病毒外，其他病
毒编码的S O D s并未检测到活性[12u-，藻类D N A病毒科的模式病毒株paramecium bursaria chlorella virus l(P B C V-l)及多数小球藻病毒 属（chlorovirus)同属病毒株都编码C u，Zn-S()D基因；P B C V-1编码的铜锌-超氧化物歧化酶（chlorovirus C u，Zn-S O D，c v S O D)以及其截短 P B C V-1 突变体 truncated chlorovirus SO D (以下简称 t c v S O D)均具有 S O D活性，其基因的表达有可能帮助病毒淬灭宿主产生的R O S，有利于病毒的感染与复制[13].由于SO D s 能降低R O S水平，减少氧自由基对生物有机体的伤害，具有抗肿瘤、抗炎及提高免疫力的作用，使得其在食 品、医药和日化领域的应用受到越来越多的关注[14].本文试图通过测定小球藻病毒株P B C V-1编码的 C u,Zn-S()D截短突变体t c v S O D在不同温度、p H值、蛋白变性剂胁迫条件下的酶活性及酶学稳定性，并进 一步评估其应用潜力.t c v S O D是c v S O D截短了其N-端的第1个内部甲硫氨酸前面的21个氨基酸残基后形成的截短突变体，此突变体与野生型相比在大肠杆菌中具有较高的表达量并具有较强的酶活性[13]，因此 本研究以重组t c v S O D为材料.
1材料与方法
1.1实验材料
大肠杆菌克隆宿主D H5a和表达宿主B L21 R otta(D E3)(N o v a g e n产品）均为本实验室保存，表达质 粒p E T23a(+)(N〇v ag e n产品）为本实验室保存.除特殊标明的以外，本实验所有试剂均购自国药集团.
1.2 tcvSO D基因克隆与表达载体构建
根据G e n B a n k的P B C V-1的c v S O D序列，从N-端第1个内部甲硫氨酸密码子开始设计5’端引物.1对 扩增引物序列设计为a245r N d e I F r w:C C G C A T A T G A C C A A G A A C A C A T C T T C A T T G,a245r X h o I R e v: G A C C T C G A G A C A A A A G T T T T C T T T G G C A T A.上述弓|物由奥科鼎盛生物科技有限公司合成.tcvSO D P C R产物利用Phanta Super-Fidelity D N A聚合酶（V a z y m e)获得，扩增条件如下：模板95 °C预变性30 s, 95 °C变性15 s，59. 3 °C退火15 s，72 °C延伸60 s,30个循环，补齐延伸10 m in.P C R产物经质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳分离，B io m ig a胶回收试剂盒纯化，T a k a r a Q.c u t限制性内切酶iV心/与X/i c J消化，再与 同样经Nc/d与X/i o l消化的大肠杆菌表达载体PE T23a(+)连接；连接产物转化大肠杆菌克隆宿主D H5a，经扩增、酶切验证、测序分析，确定t c v S O D基因插人到表达载体而获得重组质粒PE T23a(+)-tCv S〇d.
306河北大学学报（自然科学版）第41卷
1.3 t f v S O D的表达与纯化
重组质粒p E T23a(+)-tcvS〇d导人蛋白表达宿主B L21 R〇Setta(D E3)，以不含质粒的宿主菌为对照，经 0•4 m m o l/L的I P T G诱导、细胞破碎、N i-N T A resin (N o v a g e n产品）吸附，结合/裂解缓冲液（50 m m o l/L
N a H2P04»300 m m o l/L N a C l, 10 m m o l/L imidazole,pH8.0 )、洗漆缓冲液（50 m m o l/L N a H2P(),，300 m m o l/L N a C l，20 m m o l/L im idazole，p H8.0〉、洗脱缓冲液（50 m m o l/L N a H2P04，300 m m o l/L
N a C l，250 m m o l/L im idazole,pH 8.0)纯化，最终将t c v S O D收集于含体积分数50%甘油的洗脱缓冲液中.用分离胶质量分数12%的S D S-P A G E检测t c v S O D的表达与纯化结果.
1.4 t c v S O D活性检测
参照M a r k lu n d的邻苯三酚自氧化法并加以修改[1115].
1.4. 1邻苯三酚自氧化速率测定
将 999 p L 50 m m o l/L T ris-H C l缓冲液，1m m o l/L二乙三胺五乙酸.p H8.2,25 °C下平衡 20 min 后 迅速加人1 # 45 m m ol/L邻苯三酚溶液（用10 m m o l/L H C1配制），邻苯三酚终浓度为0.045 m m ol/L，在320 n m处进行3 m i n的时间扫描.通过计算斜率A A/ A?得到自氧化速率尺，单位为32。/m in，其中A 为吸光度，？为扫描时间.此方法得到/?= 0.022/m in，落在M a r k lu n d建议的用于间接测定S O D活性的邻 苯三酚自氧化速率0. 015〜0. 025/m i n内[15].
1.4.2 t c v S O D活性测定与邻苯三酚自氧化抑制曲线绘制
在总体积为1m L反应体系中混合50 m m o l/L T ris-H C l缓冲液（含1m m ol/L的二乙三胺五乙酸，pH 8.2)和不同质量浓度的t c v S O D蛋白，25 °C平衡20 m i n后，加人1丨儿的45 m m d/L邻苯三酚溶液，320 n m处扫描3 m i n以获取R值，并通过调整t c v S O D加人量达到对邻苯三酚自氧化速率的最大抑制.在此条件下，S()D对邻苯三酚自氧化速率达到最大抑制水平的50%作为S()D的1个活性单位，也可同时计算 S O D的比活性[16].
抑制率=(H s) / R,,X100
S()D单位活力（U/m L)=(尺。-心）/ (R,,X50%)X1/V X N,
S O D比活力（U/m g)=单位活力（U/m U/蛋白样品质量浓度（m g/m L),
式中尺。为320 n m处邻苯三酚自氧化速率；K S为添加样品S()D后邻苯三酚自氧化速率；V为加样体积（单 位为m L);N是样品稀释倍数.
1.5 酶学稳定性实验
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将纯化的t c v S O D适当稀释，测试在各种胁迫条件下反应体系中t c v S O D质量浓度分别为0. 05、0. 1、1M g/m L时的相对酶活性.
温度：在总体积为1m L反应体系中混合50 mmol/L Tris-H C l缓冲液（含1mmol/L的二乙三胺五乙酸，pH 8.2)，适量的tc v S O D蛋白，调整酶蛋白终质量浓度为0.05、0. 1、1pg/m L，分别在4、25、37、42、55、65、75、90 °C条件下保温30 m in，加人1p L45 mmol/L邻苯三酚溶液,320 n m处扫描3 m in进行相对酶活测定.
p H值：在总体积为1m L反应体系中分别混合50 m m ol/L柠檬酸盐缓冲液（pH 4，PH 6)、T ris-H C l 缓冲液（pH 8)和甘氨酸-N a()H缓冲液（pH 10)，均含有1m m ol/L的二乙三胺五乙酸，均加人适量的tcv-S O D蛋白，调整酶蛋白终质量浓度为〇.05、0. 1、1M g/m L,25 °C保温30 m in，以不加酶的反应体系为对照，加人1y L的45 m m ol/L邻苯三酚溶液，与1.4.2相同条件下测定酶活.
变性剂：在总体积为丨m L反应体系中将50 mm ol/L Tris-H C l缓冲液（含丨mmol/L的二乙三胺五乙酸，只8.2)，分别与相应的变性剂（质量分数2%，4%，6%，8%，10%的503;2、4、6、8、1〇111〇1/1的尿素；1、2、3、4 mol/L的盐酸胍）混合，加人适M的t c v S O D蛋白，调整酶蛋白终质量浓度为0. 05、0. 1、1fxg/m L，25 °C保温 30 m in.以不加酶的反应体系为对照，加入1p L的45 mmol/L邻苯三酚溶液，与1.4.2相同条件下测定酶活.
2结果与分析
2.1 t c v S O D的大肠杆菌异源表达
与人（G enB ank登录号N P_000445. 1，下同）、牛（N P_ 777040. 1 )及黑腹果绳（C A A35210. 1)的
淘客良品第3期刘建荣等：小球藻病毒P B C V-1编码的C u.Z n-S O I)酶学稳定性307
C u,Zn-S()D相比，以小球藻病毒P B C V-1编码的C u.Zn-S O D具有32个N-端冗余氨基酸残基，功能不详，其中第22位是甲硫氨酸.以P B C V-1基因组
D N A为模板，以其编码的C u，Zn-S()D N-端22位甲硫氨酸作为起始密码子设计引物进行截短的S O D突变体t c v S O D基因扩增，得到1条约500 bp D N A条带，与预期的 489 b p产物相符（图l a).将t c v S O D的P C R产物与载体P
E T23a(+)同时用和酶切处理、连 接、转化大肠杆菌克隆宿主D H5a，挑取单菌落培养并用B i o m ig a质粒提取试剂盒提取质粒D N A，经酶切鉴 定确定t c v S O D片段插人到了载体合适位点（图l b)，最终对t c v S O D阳性克隆测序确定了插人片段的正确性•经测序验证的p E T23a(+)-t c v s o d转化大肠杆菌外源蛋白表达载体B L21R o s e tta(D E3)，用终浓度为0. 4 mmol/L的I P T G诱导t c v S O D蛋白表达，并以B L21 R o s e tta(D E3)空菌作为阴性对照.对诱导后的菌体细胞进行破碎离心、重组蛋白N i-N T A凝胶纯化和S D S-P A G E鉴定，发现重组t c v S O D蛋白主要存在于细胞的可溶性组分中，经N i-N T A凝胶结合、洗涤、洗脱得到大小约18 k u的6X H is-t c v S O D重组蛋白 (图1c).经BC
A蛋白浓度测定试剂盒（Solarbi〇产品）测定重组蛋白浓度，用洗脱液将重组蛋白稀释到适当浓度并掺人终体积分数为50%的甘油备用.
h收获良多
a. PBCV-1 Cu,Zn-S()D 截短突变体489 bp tcvSOD 编码区的PCR 扩增.1. 489 bp tcvSOD 编码区，M. DNA marker ladder (康为世纪产品，下同）；b•重组质粒pET23a( + )-tcvsod的+双酶切鉴定.1. 489 hp tcvSO D插人片段和3 666 bp 载体；c.tcvS O D表达的SD&P A G E分析.1、3、5、7、9依次为对照菌Rotta (D E3)的上清液、沉淀、流穿、洗涤、洗脱样品，2、4、6、8、10依次为重组菌Rotta (DE3) /pET23a(+)-tcvstx丨的上清液、沉淀、流穿、洗涤、洗脱样品；M.蛋白分子质量标记.
图 1 P B C V-1编码的t c v S O D基因的克隆与大肠杆菌异源表达
Fig. 1Cloning and heterologous over-expression of tcvSOD encoded by Chlorovirus PBCV-1 in E scherichia coli
2.2 tcvSO D对邻苯三酣自氧化的抑制
采用M a rkltmdU5]的抑制邻苯=酚自氧化间接测定S O D活性的方法检测t c v S O D酶活性.此方法的原理是邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化，产生多种具不同吸收峰的中间产物且有超氧阴离子的参与，
中间产物产量与邻苯三酚自氧化速率呈正相关.S O D通过降解超氧
阴离子抑制邻苯三酚自氧化，因此监测中间产物吸光度的改
变来表示S O D对邻苯三酚自氧化的抑制，最终间接推测出
S O D的酶活性.用320 r im处吸光度检测邻苯三酚自氧化产生
弹簧弹性势能公式
的中间产物[1~8]，具体见实验方法1.v SO D对邻苯三酚
自氧化有明显的抑制作用（图2)，抑制率最高可达97%；在tcv-
S()D质量浓度为0.2 fzg/m L时达到最大抑制.按前述S O D酶
活力单位定义计算得到t c v S O D比活力为16 050 U/mg.
2.3 t c v S O D热稳定性和酸碱稳定性
将反应体系中的t c v S O D质量浓度分别调整到0. 05、0.1、1p g/m L，在 4、25、37、42、55、65、75 及 90 °C 下保温30 m i n后测定S O D活性，结果表明，当反应体系中t c v S O D
图 2 t cvSOD对邻苯三酚自氧化反应的抑制曲线Fig. 2 Inhibition curve generated by tcvSOD toward
the auto-oxidation of pyrogaliol
308河北大学学报（ft 然科学版）第41卷-0.05 (ig/mL -0.1 ng/mL -1 ng/mL 0.05 |ig/mL
0.1 ng/mL
1 jig/mL c (盐酸胍)/(m 〇m
-a - 0.05 ng/mL -# 0.1 (ig/mL * 1 ng/mL 0 20 40
60 80 100 0 2 4 6 8 10 12 14代
p H 值
图3 UrvSO 丨）的热稳定性（a )与酸碱稳定性（b)Fig. 3 Therm(>-stability (a) and pH-stahility (b) of tcvSOD
2.4不同蛋白变性剂对tcvSOI )活性的影响
鉴于S ()D 在医药和食品等领域有广泛的应用前景，体外检测S ()D 在各种变性剂胁迫下的酶活稳定性 就显得十分必要.在本文实验条件下，终质量浓度1 ;x g /i n L 的t c v S O D ，其活性在质量分数2%〜8
% S D S 作 用下维持稳定，质量分数10% S D S 导致酶活性的轻微丧失；酶质量浓度0. 1 p g /m L 和0. 05 p g /m L 时对 S D S 处理非常敏感，残留酶活性降到20%以下；质量分数10% S D S 处理下酶活性几乎完全丧失（图4a ).与 S D S 处理相反，3种不同质量浓度的t c v S O D 对2〜10 m o l /L 尿素（图4b )与1〜4 m o l /L 盐酸胍（图4c )处
图4变性剂对tcvSOD 酶活性的影响
Fig. 4 Effects of protein denaturants on the enzymatic activity of tcvSOD 4 6
m ；(SDS)/%1012 6 X 1c (尿素)/(m (>l • L-1)
12质量浓度为1 f x g /m L 时，酶活性从4〜75 °C 保持恒定，在90 t 处理30 m i n 后略有下降；而酶质M 浓度为 0. 1和0.05 /ig/m L 时，酶活性从42 °C 开始下降，到90 °C 时几乎完全失活（图3a ).推测温度较高时低质量 浓度t c v S O D 更容易丢失螯合的C u 2+和Zn 2从而迅速丧失活性，但这一推断有待实验证明.上述结果证明， 在合适的质量浓度下t c v S O D 具有相当高的热稳定性.变换p H 值从4〜12，质量浓度1 y g /m L 与0. 1 M g / m L 时t c v S O D 活性维持不变，质量浓度0.05 p g /m L 样品只是在pH 12时活性略有降低，表明t c v S O D 在 较大p H 值范围内具有稳定性（图3b ).
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学历情况说明
