锌指结构 ：最普遍的核酸识别元件
赵志虎 马清钧
(军事医学科学院生物工程研究所 北京 100850)
摘要 锌指是最大的 DNA 结合蛋白家族 ，是识别 DNA 最有效 、最成功的一种结构元件 。其模块性结构特点及与核 酸作用的相对简单性 ，使其成为研究蛋白Ο核酸相互作用的理想材料 ，以及人为设计筛选新的核酸结合蛋白的最佳 元件 。
关键词 锌指 ,DNA 结合蛋白 ，蛋白Ο核酸相互作用
Z inc f inger : Th e most common moti f f o r nucle ic acids recognition
ZH AO Zhi ΟHu , MA Qing ΟJ u n
( Institute o f Biotechnology , Beijing 100850 , P. R . C hina )
Abstract Within the know n class of DNA b in d ing proteins , the zinc fing er is the g reatest family and are n ature ′s m ost su ccess 2 fu l d esig ns for DNA Οbinding proteins. Ow ing to the m odu lar n
ature and its simplicity o f interaction w ith nu cleic acids , the zinc fin 2 g er m otif provid es a g oo d candid ate for the stud y of pr otein Οnu cleic acids interaction and the rational d esig n of site Οspecific nu cleic acids b in d ing proteins.
K ey w ords zinc fing ers , DNA binding proteins , protein Οnu cleic acids interaction
或组氨酸的任何序列 ，并且由 Zn 2 + 介导稳定折叠的结构性 元件都可称为锌指 。在这里 ，我们主要是指与 TFIIIA 中的序 列高度同源的结构即 C 2 H 2 型锌指 ，包括早期生长信号诱导 蛋白 K rox20 、原癌基因 G L I 、Wilms 肿瘤抑制基因 WT1 以及转 录因子 S P1 等 4 个亚家族4 ，至于其它富含半胱氨酸 、组氨
酸的序列如有些核激素受体5 、酵母转录因子 G al46
以及某 些反转录病毒蛋白的核衣壳蛋白7 等 ，则不在本综述的讨论
之列 。
锌指 (zinc fing ers , ZFs ) 是指一套相当广泛的蛋白结构元 件 (m otif ) ，其共同的结构特性是通过结
合 Zn 2 + 来稳定一种很 短的可以自我折叠的蛋白结构 ，最初是指在非洲爪蟾转录因 子 TFIIIA 中发现的一段长约 30 个氨基酸的重复序列1 。这 段序列由保守的半胱氨酸 、组氨酸和疏水氨基酸组成 ，其排 列方式为 :ΦΟX ΟC ys ΟX 2 - 5ΟC ys ΟX 3ΟΦΟX 2ΟHis ΟX 2 - 5ΟHis ，其中 X 为 任意氨基酸 ;Φ 为疏水氨基酸 。由于 Cys 、His 是与 Zn 2 + 形成 配位键的理想配体 ，他们推测这段 30 个氨基酸长的序列围 绕处于中心的 Zn 2 + 以及顺序出现的两个 C ys 、His 进行折叠 , 形成一种稳定的“指头”型球状结构 ，而 TFIIIA 正是利用这些 “指头”样结构来“指向”5S R NA 基因内部的调节区 DNA ( 此
即所谓 C 2 H 2 型“锌指”
) 。后来的金属结合光谱实验2 证实 了上述观点 ，并且在许多其它参与基因调节的蛋白中也发现 了类似的 、可以结合 Zn 2 + 的结构 。从此所谓的锌指元件在 真核 DNA 结合蛋白中便广为人知 。
自从 1985 年在 TFIIIA 中发现第一个锌指以来 , 目前已 在 560 多种蛋白中发现了 4 100 多种不同锌指序列 ，使得锌 指元件成为所有 DNA 结合蛋白中最庞大的一个家族29 ，有 人甚至估计 ，在整个人类基因组中 ，有将近 1 %的序列即 600 ～700 基因编码含有锌指元件的蛋白3
，因此锌指似乎是识
别核酸的一种普遍性的结构元件 , 成为人们研究蛋白ΟDNA
相互作用的一个理想对象 。
遗憾的是 ，目前“锌指”这个术语已经变得越来越松散 , 几乎完全成了一个拓扑学概念 ，凡是含有一套半胱氨酸和/
1 溶液中的结构与蛋白折叠
在得到完 整 锌 指 结 构 之 前 ,Berg 8 等 人 通 过 计 算 机 模 建 ，根据其它 Zn 2 + 结合蛋白的结构推测 : 在锌指元件中 ,30 个氨基酸残基组成长约 11 个残基的两个反平行的βΟ折叠片 层和一个 9 氨基酸的αΟ螺旋 β, Ο折叠片层转角附近的两个半
胱氨酸 、αΟ螺旋中的两个组氨酸与中间的锌离子配位 ，形成
一种ββα样的“锌指”结构 ，保守的疏水氨基酸则形成一个疏 水核心 ，稳定“锌指”以 外 的 结 构 。后 来 , W rig ht 等9 ,10 通 过 NMR 技术解决了 Xenopus 的多指蛋白 X fin 中的一个锌指的 结构以后 ，才首次证实了锌指元件的上述ββα结构 。
进一步的研究发现 ，在溶液中 ，相邻的锌指之间不存在 相互作用 ，连接两个锌指元件的连接肽 ( l inker ) 处于柔性状 态11 ，这证实了每一个锌指都是一个独立的模块 。而且在 有些锌指中 ，这种ββα结构还需其它的结构因素来起稳定作
用 ，如在酵母的 S W15 和果蝇的 TTK 的第一个锌指中 , 就发 现有一个额外的氨基端βΟ折叠片层存在 。在 S W15 中 ，在这 个βΟ折 叠 片 层 的 氨 基 端 还 发 现 有 一 个 较 短 的 螺 旋 结 但是由于其具有很好的可变性 、柔韧性 ，在使得单独锌指以 正确的取向与 DNA 的大槽结合以及保持一个完整 、合适的 包装间隔上 ，发挥作用 。
在一个多指蛋白中 ，单个锌指的识别特异性 ，可能还受 其所在位臵的影响 。而同一锌指内部 ，氨基酸之间的作用 ,
构12 ,13 。因此这种ββα结构仅仅代表了整个锌指结构元件 的一个很微小的核心部分 。
可能也会间接地影响氨基酸 —碱基间的特异性的识别41 。另外即便对于同一个蛋白 ，在其识别位点中 ，不同碱基对于 特异性识别的影响也不同 。在 Z if268 中 ,AT 碱基特别是位 2 与核酸的相互作用
23 ,24 于旁侧序列时 ，对于其亲和性的贡献尤其重要 。
另一个需要注意的是 ，锌指蛋白具有相当的可塑性 。同 一个锌指蛋白如 Z if268 可识别一套不同的 、相关的 DNA 序 列 ，但锌指蛋白对特定顺式调节性 DNA 元件序列的改变却 具有相当的稳定性 ; 不同的锌指又可识别同一序列 ，但亲和
2. 1 与 DNA 的作用
在许多情况下 ，含有锌指元件的蛋白都会以一种序列特 异性的方式与 DNA 相互作用 ，小鼠转录因子 Z if268 的三个 锌指与 DNA 结合所形成复合物的晶体结构14 ，首次提供了 关于这种相互作用的详细情况 。在这个复合物中 ，锌指位于
DNA 双螺旋的大槽 ，通过αΟ螺旋的 - 1 、+ 3 、+ 6 位氨基酸与 DNA 上的碱基形成特异性接触 。每一个锌指相对于 DNA 的
取向是相同的 ，与 DNA 成反平行 ,N 端靠近 DNA 的 3′端 , C 端靠近 5′端 。每个锌指识别一个连续的三碱基亚位点 ，所有 的碱基特异性接触都位于 DNA 双螺旋的一条链上 。相邻的 锌指单位间不存在蛋白Ο蛋白相互作用 ，每一个锌指的 DNA 识别在很大程度上是相对独立的 。
一些与 Z if268 紧密相关的蛋白如 S P1 ，具有类似的作用 方式 ，但是在 G L I 、TTK 、以及更高分辨率下 Z if268∶DNA 复合
物的晶体结构15 ～18
中却发现了一些不同的情况 。在这些复 合物中 : ①单个锌指单位可以与连续 5 个碱基对的 DNA 单 元接触 ; ② 锌指在结构上虽然具有良好的模块组织特性 ，但 在功能上却具有协同性 ，相邻锌指识别序
列具有一个碱基的 重复 ; ③相邻的锌指单元间可以形成蛋白Ο蛋白相互作用 ，而 且这种作用几乎总是表现为 C 端锌指对前一个锌指的影响 ; ④碱基特异性接触的形成涉及αΟ螺旋内的 、或紧靠αΟ螺旋的 至少 6 个不同位臵上的氨基酸 。而且碱基特异性接触可以 与 DNA 的两条 链 发 生 ; ⑤多 个 锌 指 串 联 , 可 以 识 别 不 对 称 的 、延伸性位点 。
此外 ，虽然许多天然出现的锌指如 Z if268 、G L I 、TTK 、S P1 等偏向于识别富含 G C 的序列 ，但另一些锌指如 CF2 II 19 则 偏向于识别富含 AT 的序列 ，从一级结构上 ，很难区分它们 , 与 DNA 作用的方式上也不存在很大的差别 。但在与碱基接 触的氨基酸位臵上却存在不同 。在 CF2 II 中 , + 6 位与平行 链作用 ，在 Z if268 中 ，则是 + 2 位与平行链作用 。
大多数情况下 ，锌指主要是与 B ΟDNA 的大槽接触 ，但在
TFIIIA 中 ，第四个锌指 ZF4 也与小槽接触并横穿整个双链 ,
将两边相互邻近锌指连接起来20 。
序列依赖的 DNA 构象 ，对特异性识别也有影响 ，尤其是
对于亲和力具有较大的贡献 。在 TFIIIA 中 , Z F4 对亲和性的
巨大贡献 ，就是来源于一个序列特异性的 DNA 构象而非来 源于其独特的序列20 。而且 ，有时锌指蛋白与 DNA 的结合 , 会明显改变 DNA 的结构 ，使之发生一定的弯曲 ，这样 ，大槽 变得更适于锌指的结合21 ,22 。
连接相邻锌指的 linker 对于识别特异性虽然贡献不大 ,
24
茶叶蛋用什么茶叶性不同 。
2. 2 与 R NA 的作用
锌指主要是与 DNA 作用 ，但也可以识别 R NA 。在锌指 蛋白超家族中 ,TFIIIA 是这方面的一个典型例子 。作为一个
DNA 结合蛋白 , 它以 5S rR NA 基因特异的转录因子发 挥 作
用 ；作为一个 R NA 结合蛋白 ，它与 5S rRNA 结合形成一个 7S
R NP 复合物 。这种双重作用是由不同的锌指串分别完成的 , 其中 N 端的三个锌指 ZF1～3 负责高亲和性的 DNA 结合 ，而
ZF4～6 则负责 RNA 的结合20 ,25 ,26 。
在一级结构上 ，并不存在一个简单的 、明显的序列特征 来区分 DNA 结合与 R NA 结合锌指 ，但是 ，很显然“RNA ”锌指 与“DNA ”锌指必然遵循一套不同的原则来识别各自不同的
靶位点 。在 TFIIIA 中 ,DNA 结合锌指主要是与处于 A/ B 型
中间状态 DNA 双螺旋的大槽作用 ，并与其上的碱基进行特 异的接触 ，相反 ,R NA 识别则主要依赖于 5S R NA 复合物的二
/ 三级结构而非一级结构 ，而且磷酸骨架接触在锌指ΟRNA 作
用中起主要作 用 , 最 近 Wrig ht 等 人 通 过 噬 菌 体 显 示 也 已 证 实 ：虽然在 TFIIIA 中 ,ZF 4～6 使用相似的αΟ螺旋识别 R NA ,
生姜泡水喝的禁忌但是其关键位臵却存在差异 ，对于 R NA 结合 α, Ο螺旋的 - 1 、
+ 2 位尤其重要 。当然要想理解锌指ΟR NA 作用的精确分子
机制 ，还有赖于锌指∶R NA 复合物的晶体结构的解决27 。 2. 3 与 DNA ∶R NA 杂交双链的作用
锌指除了与 DNA 、R NA 作 用 外 , 在 体 外 , 锌 指 还 可 特 异 地与 DNA ∶RNA 杂 交 双 链 作 用 。Berg 28 等 在 1995 年 发 现 ,
S P1 对双链 DNA ∶R NA 的亲和力 ，同对双链 DNA 的没有差别 ,
而一个人为设计的锌指蛋白 ZF ΟQQR ，其对双链 DNA ∶RNA 的 亲和力甚 至 比 对 双 链 DNA 的 还 高 5 倍 。锌 指 蛋 白 与 杂 交
DNA ∶R NA 双链的作用 ，依赖于在杂交双链中 ,RNA 的方向是
与锌指蛋白的氨基端羧基端的走向平行还是反平行 ，而且是 否是序列特异性的 。由于在 DNA 复制 、基因转录 、反转录等
过程中都会出现 DNA ∶R NA 异源二聚体或杂交双链 ，锌指蛋 白与 DNA ∶RNA 杂 交 双 链 的 作 用 , 可 能 具 有 重 要 的 生 理 作
用 。
3 序列特异性的锌指蛋白的设计与筛选
由前面的讨论可以发现, 锌指蛋白是目前已知的最大DNA 结合蛋白家族，事实上也是最大的蛋白家族29 ，这表明在进化上，锌指元件是识别核酸最成功的一个元件。此外, 锌指结构元件还具有以下独特的特点: 结构上相对保守; 与DNA 作用相对简单；识别DNA 序列高度特异，识别特异性又具有相当的可塑性; 良好的模块组织特性; 识别核酸序列的相容性与多样性。而且在许多肿瘤等疾病中，也发现了大量由于染色体移位、倒转等导致的锌指蛋白的再组合30 ，因此利用锌指元件通过模拟与“仿生”，进行DNA 结合蛋白、杂交转录因子的人为设计是可行的和合理的。正是锌指蛋白的这些特性，决定了锌指蛋白是以之为模
板进行改造和设计序列特异的DNA 结合蛋白的最理想的材料，国内外也从各方面对其进行了研究。序列特异性的锌指蛋白的设计与筛选，是我们研究的最终目的，它具有巨大的应用价值，而且也将对我们的理解作一个最严格的检验。3. 1 组合与筛选
早期的突变研究以及序列统计分析31 ,32 发现, 只要维持整个锌指模块的结构框架不变，改变几个关键位臵上的残基，即可以改变整个锌指的序列特异性。而且锌指具有很好的模块组织特性，基于以上认识,1992 年,Berg 等人将三个识别不同序列的单一锌指组合与匹配( mixΟandΟmatch) ，得到了可以识别由三个亚位点组合而成的特异序列的全新锌指蛋
无论是组合与匹配还是噬菌体显示都是基于一个基本的假设即每一个锌指都是一个结构上、功能上的独立单元,
但实际上相邻锌指可以协同作用，识别重复的碱基序列，而且单个锌指所在位臵对其识别作用也有影响15 ～18 ,41 ，因此上述假定是存在一定问题的。为了将上述因素考虑进去，更真实地反应锌指ΟDNA 的作用，利用锌指元件的良好模块组织特性, Pab o 实验室在1997 年又发展了一种“逐步位移”( S tepΟWalking) 的噬菌体显示方法42 ,43 。他们针对一个9～10 b p 的靶位点, 从Z if268 出发, 通过从C 端到N 端逐步突变、筛选，每次添加一个优化后的锌指，直至三个锌指都完全突变。利用这种策略，已经筛选到了针对TATAΟb ox 、核反应元件NRE、p53 结合位点以及其它序列的锌指蛋白，而且有些筛选到的锌指蛋白在序列、特异性、亲和力方面都与天然序列非常相似。由于TATAΟb ox 几乎不含G C 序列，因此该方法具有较好的通用性。但是这种“逐步位移”的噬菌体显示方法，仍然存在不足
之处。目前已经有证据表明在Z if268 、TTk 等中, C 末端锌指会影响前一个锌指的DNA 识别41 ,15 ～18 ，因此在突变顺序上应该是C 端的锌指首先突变，进行选择，然后保持其在C 端的位臵不变，再将中间的锌指突变、筛选，最后对N 端的锌指进行突变，整个过程应该是采用将Z if268 的三个锌指由C 端到N 端的锌指逐步替换( S tep Replacing) 的方法, 才更为合理。
3. 2 计算机辅助设计前面所提到的工作都是在由三个锌指
组成的多指蛋白
上进行的，而仅仅由三个锌指组成的蛋白，最多也只能识别9～10 个碱基对的序列, 如此短的序列, 其
特异性在大多数情况下，都达不到要求。为了利用现有锌指元件，设计可以识别更长序列的DNA 结合蛋白，不同实验室又采取了计算机辅助设计的方法。根据所使用的最基本元件，除了锌指以外，是否含有其他结构，又分为两种不同策略。
其一是单独使用锌指元件，通过多个锌指元件的串联，达到序列特异性的要求。根据一个锌指大致识别一个三碱基对的基本规律，如果蛋白结构域的周期与DNA 双螺旋的周期相匹配，六个锌指串联就可以识别一个18 b p 的连续序列，从而达到要求。正是采用上述策略,Barb as44 等人选择不同锌指常用的TG EK P 这样一个连接肽, 成功地将两个三锌指蛋白串联成一个六锌指蛋白，该六锌指蛋白可以序列特异性地识别一段连续的18 b p 序列，而且其与活化、抑制区融
白33 ,34。这次实验的成功首次表明利用那些识别亚位点已知的单一锌指元件组合，人为设计可以识别由有限亚位点组成的特异序列的含有锌指元件DNA 结合蛋白是完全可能的。
通过单一锌指的组合与匹配，虽然可以得到识别新序列的锌指蛋白，但它必须依赖于我们对锌指ΟDNA 结合作用的极为详尽的了解，而且识别亚位点已经知道的天然锌指元件也毕竟是少数, 我们的最终目的是希望得到可以识别所有64 个三联体密码的同功锌指, 利用这些锌指进行组合、配对，得到可以识别更广特异性序列的锌指蛋白。
正是基于以上考虑, K lug 、Pab o 等几个不同实验室在1994 年底、1995 年初几乎同时报导了利用噬
菌体显示技术来研究锌指蛋白的结合特异性的实验35 ～39 。他们将单一锌指识别螺旋中可能参与碱基接触的氨基酸有限随机化，然后呈现在噬菌体的表面，筛选针对特定DNA 序列的单一锌指突变体。利用上述方法，得到了许多识别不同三碱基亚位点的同功突变体。在此基础上, K lu g40 通过突变体的组合与匹
配，筛选到了一个可以识别并特异结合白血病人染色体上cΟ AB L 与BC R 基因融合位点9 b p 的全新三锌指蛋白，该蛋白在胞内可以特异性地与融合位点结合, 阻断p190 ABLΟBC R 融合蛋白的产生，表现良好的抗肿瘤潜能。尤其值得指出的是，该蛋白所识别、结合的序列位于一个基因的编码区而不是常见的调控区，这说明利用锌指蛋白在调控特定基因的表达方面具有广泛的适应性，既可针对非编码的调控区，从转录的水平上进行调节，又可针对编码区，从转录、翻译水平上进行调控。合后，可以特异性地活化、抑制含有靶位点的基因的转录。后来Pomeran tz 和Pab o45 等人利用同样的方法，也得到了一个可以识别18 b p 的六锌指蛋白。而且他们还发现，如果使用的linker 比经典的“TG EK P”稍长，整个融合蛋白的DNA 结合亲和性会有很大的提高。
18 b p 的连续序列，对于目前已经知道的任何一个基因组来说，都可以满足其序列特异性要求(418 = 68 ×109 ) ，而且这么长的连续序列，既可以是位于基因内部的编码区，也可以是位于基因外部的非编码区，具有相当的广泛性。因此上
述实验的成功，在人类基因治疗、以及转基因动物、植物靶基因的特异性调控方面具有广泛的应用前景。含有锌指元件以及其它位点特异性DNA 结合元件的杂
交蛋白的计算机辅助设计，这是另一个吸引人的策略，这方面的工作主要集中在Pab o 和S harp 实验室。他们通过计算机模建，将Z if268 的锌指区与OctΟ1 的H D ( h ome od omain) 、酵母T A T A ΟB ox 结合蛋白TBP 对接，构建了两个融合蛋白ZFH D1 、TBP/ ZF ，两个蛋白均表现良好的胞内、胞外活性46 ～48 。
由于TBP 与TATAΟB ox 的结合，是前起始转录复合物形成的第一步，而且对于许多启动子，这又是一个转录活化的限速步骤，许多转录活化区、抑制区等效应物, 正是通过与TBP 或与TBP 结合的蛋白的相互作用来发挥其转录调节效应的，此外, TBP 还与其它基础转录因子如TFIIA 、II B 、IIF 、R NA pol II 相互作用，因此TBP/ ZF 融合蛋白的产生在调节基因的表达方面无疑具有相当的普遍性。此外, 由于TAT AΟBox 与锌指蛋白结合位点之间的间隔可以通过调节锌指蛋白与TBP 间连接肽的长度来改变，而锌指的特异性可以通过噬菌体显示等组合技术进行改变与筛选，因此这种融合蛋白有可能导向任何目的启动子，从而特异性地调节内源性基因的表达。
我们知道，序列特异性，除了长度上的要求外，序列本身的特殊结构如对称性、重复等，也可进一步提高该序列的特异性，而有些天然转录启动子的顺式调控元件就常常具有一定的重复性与对称性。要
识别这样的序列，自然情况下，还常常存在的一种解决方法就是使用一个二聚体蛋白来识别一段重复序列。利用这种自然存在的组合策略, 1998 年, Pomeran tz 和Pab o 设计了融合蛋白ZFG D1 ，其中含有Z if268 的ZF1 、ZF2 以及G A L4 的蛋白二聚化结构域的一部分。结果发现融合蛋白ZFG D1 可以识别一段由13 b p 分割的两个6 b p 的对称序列，而这6 b p 序列完全由锌指决定49 。由于该蛋白的DNA 结合特异性、亲和性主要是由锌指部分决定，而锌指的结合特异性又是可以改变的，因此锌指与G A L4 以及其他能够介导蛋白Ο蛋白间相互作用的元件的融合，有可能通过同源、异源二聚体的形成，识别任何一段DNA 序列。而最近发现，有些锌指本身就介导蛋白与蛋白间的相互作用50 ，因此这种方法的普遍性、通用性就更加明显了。
3. 3 从头设计由于锌指元件是一个特征十分明确的蛋白结
构性元件,
借助His 、C ys 与锌离子的螯合配位以及疏水性氨基酸形成的一个小的极性核心，这段约30 个氨基酸长的序列可以很稳定地折叠成一种ββα结构。30 个氨基酸，是目前已知的最小的稳定性结构元件的极限，因此很早就引起了蛋白设计人员的极大兴趣，希望能从头合成具有上述锌指结构短肽，但是直到最近才有成功的报道。
1996 年, S tru thers 和I mperriali51 等人设计了一段多肽，其中含有DΟ氨基酸，发现该多肽即使没
有锌离子的参与，也能稳定折叠。在蛋白的从头设计方面, 这是一个巨大的进步，因为在此以前，还没有发现一个只有23 个氨基酸的短肽可以稳定折叠。这充分说明，锌指元件这种高级结构在进化上是具有相当的优越性的，至少在自然之子从2023 多种可能中唯独选择这种结构来稳定折叠这方面是如此。
1997 年Dahiyat52 等人更进一步, 他们设计了一个名为FS DΟ1 的多肽, 全部使用天然氨基酸, 在没有锌离子的情况下，也能稳定折叠，并且其疏水核心比天然锌指蛋白Z if268 的ZF2 还要大,NMR 表明其三维结构与Z if268 中ZF2 的十分相似。FS DΟ1 是目前已知在没有二硫键、金属离子、或其它亚单位等热动力学上的辅助因素作用下，能够稳定折叠的最小蛋白。
锌指元件的从头设计的成功, 具有多方面的意义。首先，这又一次从一个侧面表明，锌指元件这种高级结构，在进化上是非常成功的，其成为最大的DNA 结合蛋白———也是最大的蛋白家族绝不是偶然的，研究锌指蛋白庞大超家族的进化历史，具有重要意义。此外，还表明完全有可能利用一段短肽模拟、替代单个锌指元件的作用，在拓展新的识别元件和识别特异性方面，这无疑又是一个颇具前景的方向。
总之，利用锌指元件进行序列特异的DNA 结合蛋白的设计，无论是在长度上，还是在序列的特殊结构如对称性上, 都可以满足特异性要求，而且，既可以针对基因的编码区，又可以针对基因的非编码区，
具有广泛的通用性，因此如果将其与不同的效应区融合，在基础研究以及临床应用方面将具有广泛的应用前景。
新年小报内容
如与不同的转录活化、抑制区结合，可以构建杂交转录因子，实现基因表达的开关、上下等调节，用于特异基因的表达调控，为解决基因治疗、转基因动、植物有机体中组织特异
性表达这一“瓶颈口”提供新的途径。此外还有可能与病理、转化细胞中特异性的异常DNA 结合，用于肿瘤、感染性疾病等的基因诊断、预防和治疗，提供新的治疗性药物。如与重组酶结合，可以进行位点特异性重组；与限制性内切酶结合, 可以构建识别8 b p 以上长序列的杂交限制性内切酶, 这在基因图谱分析方面具有重要意义, 目前也已有成功的报道53 ～55 。此外，由于许多限制性内切酶在真核体系也可发挥作用56 ，因此含有锌指元件的杂交限制性内切酶可用于疾病的诊断、预防、治疗等方面。
4 今后的研究方向与展望
有关锌指的核酸识别特异性, 虽然进行了相当深入研究，但是还有许多问题未得到解决。
首先，在结构方面，谈到锌指蛋白ΟDNA 特异性结合，几乎总是涉及特异性与亲和性两个方面，因此有必要在锌指蛋白中严格区分DNA 特异结合区与亲和性贡献区，但是目前的工作仅仅集中在DNA 特
异结合区上，这实际上是对蛋白ΟDNA 作用的一个极大的误解。因为只有在特异性与亲和性之间达到一种平衡，锌指蛋白在体内才能有效的发挥作用, 一味地强调特异性而忽略亲和性，是十分片面的。亲和性贡献区、特异性结合区的区分还将在整个转录因子中，带来功
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能性结构域概念的彻底变革。此外，锌指与DNA 的识别结
合作用是一个详尽的结构进程，因此只有建立合适的模型与
方法，研究其在溶液中尤其是生理条件下的动态变化过程,
揭示整个过程的动力学规律，才能真正反映其在生理条件下
的作用特点。
其次，对锌指识别核酸的复杂性，也注意不够。虽然锌
指与DNA 作用是通过αΟ螺旋伸入DNA 的大槽实现的，但是
单独αΟ螺旋甚至锌指都不能完成序列特异的DNA 识别作
用α,Ο螺旋以外的其它部分，在整个识别过程中到底起什么
作用，目前还未见这方面的文献，而识别作用中氨基酸与磷
酸骨架的接触、Linker 序列以及DNA 结构尤其是局部构象如
扭曲等在识别中的作用，也未得到很好的研究。
锌指蛋白家族的进化，是又一个颇具吸引人的方面。通
过锌指蛋白家族的进化历史的研究，揭示锌指超家族的演化
进程，将为整个蛋白元件的进化模式提供一个重要的参考基
准，最终将有助于利用不同蛋白元件进行蛋白的理性设计。
可以预期，随着人类基因组计划的进行与完成，锌指蛋白家
族成员会进一步扩大，人们对其核酸作用机制、体内生理功
能的认识也会加深，最终将在整个含锌蛋白的研究方面开辟
一个新的领域。
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