适于重组CHO细胞培养的⽆⾎清培养基的制备_张⼤鹤
中国⽣物制品学杂志2011年10⽉第24卷第10期Chin J Biologicals October 2011，Vol.24No.10
CHO 细胞表达系统在⽣物制药领域具有重要
的地位，⼤量蛋⽩类药物使⽤该系统进⾏表达。⽆⾎清培养基（Serum-free medium ，SFM ）是在基础培养基的基础上，添加成分完全确定或部分确定的⾎清替代成分发展⽽来的，更适合于⼤规模⽣产。但这些培养基中仍含有动物源成分，具有潜在的危险。因此，开发⽆蛋⽩、⽆动物源的⽆⾎清培养基仍是研究的⽅向。
可乐喷泉本实验室前期开发了适⽤于重组CHO 细胞⽣
长和重组蛋⽩⽣产的⽆⾎清、低蛋⽩培养基SFMC ，该培养基适⽤于培养多种重组CHO 细胞株。本⽂在SFMC 培养基的基础上，分别采⽤铁盐、锌盐和⾮动物来源的蛋⽩⽔解物替代其中的⽜转铁蛋⽩（Bovine transferrin ）、⽜胰岛素（Bovine insulin ）和动物组织⽔解物（Primatone ）这3种动物源成分，开发出了⽆动物源、⽆蛋⽩培养基（Protein-free midium
，PFM ），并在此基础上进⼀步开发出了化学成分确定的培养基（Chemically defined medium ，CDM ），现报道如下。
作者单位：华东理⼯⼤学⽣物反应器⼯程国家重点实验室（上海
200237）．
通讯作者：易⼩萍，E-mail ：xpyi＠ecust．edu．cn
【基础研究】
适于重组CHO 细胞培养的⽆⾎清培养基的制备
张⼤鹤
易⼩萍
张元兴
孙祥明
但使龙城飞将在不教胡马度阴山的意思【摘要】⽬的制备适于重组CHO 细胞培养的⽆⾎清培养基（Serum-free medium ，SFM ）。⽅法在本室制备的⽆⾎清、低蛋⽩培养基SFMC 的基础上，
开发⽀持重组CHO-K1细胞⽣长的⽆动物源、⽆蛋⽩培养基（Protein-free midium ，PFM ，以柠檬酸铁、
硫酸锌和酵母⽔解物替换SFMC 中的转铁蛋⽩、胰岛素和动物组织⽔解物）及化学成分确定的培养基（Chemically defined medium ，CDM ，以PFM 培养基为基础，通过调整和优化氨基酸的浓度和其他部分营养物质浓度制备），评价各种⽆⾎清培养基的适应性、稳定性以及冻存、复苏性能，并分别在125ml 摇瓶和1.4L ⽣物反应器中进⾏培养。结果
CHO-K1细胞在PFM 和
CDM 中⽣长良好，经125ml 摇瓶培养，最⾼细胞密度分别为9.3×106和7.3×106个／ml ，最⼤细胞密度与SFMC 培养基相⽐，分别提⾼了107％和62％。经1.4L 搅拌式⽣物反应器流加培养，PFM 培养基的最⾼细胞密度可达9.8×106个／ml ，培养216h 时，细胞活性仍维持在80％，重组蛋⽩表达量达110.5mg ／L ；采⽤CDM 培养基经流加培养，CHO-K1细胞最⼤密度可达9.5×106个／ml ，但细胞培养时间较PFM 培养基短。结论在SFMC 培养基的基础上，成功开发出培养效果更优的PFM 和CDM 培养基。
【关键词】CHO 细胞；
培养基，⽆⾎清【中国图书分类号】R392-33【⽂献标识码】A 【⽂章编号】1004-5503（2011）10-1152-05
Preparation of Serum-free Medium Suitable for Culture of CHO Cells
ZHANG Da-he ，YI Xiao-ping ，ZHANG Yuan-xing ，SUN Xiang-ming （State Key Laboratory of Bioreactor Engi－neering ，East China University of Science and Technology ，Shanghai 200237，China ）
【Abstract 】Objective
To prepare the rum-free medium suitable for culture of CHO cells．Methods
Non-animal-derived
protein-free medium （PFM
）supporting the growth of recombinant CHO cells was developed by substituting the transferring ，insulin and animal tissue lysate in SFMC ，a rum-free medium prepared by the authors ，with ferric citrate ，zinc sulfate and yeast lysate re－spectively ，bad on which chemically defined med
ium （CDM ）was developed by optimizing the concentrations of amino acids and partial other nutrient substances in PFM．Both PFM and CDM were evaluated for suitability ，stability as well as frozen and resuscita－tion performances ，and cultured in 125ml shake flask and 1.4L bioreactor．Results
CHO-K1cells grew well in both PFM and
CDM．After culture in 125ml shake flask ，the maximum densities of CHO-K1cells in PFM and CDM were 9.3×106and
7.3×106cells ／ml ，which incread by 107％and 62％as compared with tho in SFM respectively．However ，after fed-batch culture in 1.4L stirring bioreactor ，the maximum density of CHO-K1cells in PFM reached 9.8×106cells ／ml．Meanwhile ，the activity of cells was still 80％after culture for 216h ，and the expression level of recombinant protein reached 110.5mg ／L．The maximum den－sity of CHO-K1cells after fed-batch culture in CDM reached 9.5×106cells ／ml ，while the time for culture was shortened compared with that in PFM．Conclusion PFM and CDM which were more suitable for culture of CHO cells were successfully developed on the basis of SFMC．
【Key words 】CHO cells ；Medium ，rum-free
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1152··
DOI ：10.13200/j.cjb.2011.10.37.zhangdh.017
1.材料与⽅法
1.1细胞株
重组CHO-K1细胞株（表达AAFP抗过敏蛋⽩）由上海富莼科芯⽣物技术有限公司提供。
1.2主要试剂
基础培养基、新⽣⽜⾎清（NCS）和脂类混合物购⾃GIBCO公司；转铁蛋⽩、胰岛素、维⽣素和HRP 标记的⽺抗⼈IgG购⾃Sigma公司；各种微量元素和氨基酸购⾃ACROS公司；葡萄糖分析试剂盒和尿素氮检测试剂盒购⾃捷门⽣物技术有限公司；乳酸检测试剂盒购⾃南京建成⽣物⼯程研究所；⽺抗⼈IgG Fc购⾃Fitzgerald公司；SFMC为本实验室⾃制，系在基础培养基DMEM／F12（1∶1）的基础上，添加转铁蛋⽩、胰岛素、葡萄糖、氨基酸、维⽣素、脂类混合物和各种微量元素制备⽽成。
1.3⽆动物源PFM成分的优化
1.3.1铁盐替代⽜转铁蛋⽩：以柠檬酸铁（Ferric citrate）作为转铁蛋⽩替代物，向接种密度（5×105个／ml）相同的细胞培养物中添加终浓度分别为1、4、16、64mmol／L的⽆菌柠檬酸铁浓缩液，传代7次后，培养72h，检测细胞密度。
1.3.2锌盐替代⽜胰岛素：以硫酸锌（Zinc sulfate）作为⽜胰岛素替代物，向接种密度（5×105个／ml）相同的细胞培养物中分别添加终浓度为0、1、2、4、16mg／L的⽆菌硫酸锌浓缩液，传代7次后，培养72h，检测细胞密度。
1.3.3⾮动物源蛋⽩⽔解物替代动物组织⽔解物：向接种密度（5×105个／ml）相同的细胞培养物中分别添加终浓度为0、
0.25、0.5、1g／L的⽆菌酵母蛋⽩⽔解物或⼤⾖蛋⽩⽔解物浓缩液，传代7次后，培养72h，检测细胞密度。
1.4⽆动物源PFM的评价
将SFMC中的转铁蛋⽩、胰岛素和动物组织⽔解物分别按1.3项优化的浓度⽤柠檬酸铁、硫酸锌和酵母⽔解物替换，制成PFM。将SFMC中培养的CHO-K1细胞以1×106个／ml的密度直接接种⾄PFM中，每隔48h传代，观察其⽣长情况。使⽤含10％DMSO，不添加任何⾎清和蛋⽩的PFM冻存CHO-K1细胞并复苏，评价其适应性、稳定性以及冻存、复苏性能。
1.5⽆动物源、⽆蛋⽩、化学成分确定的CDM培养基的制备和评价
以PFM培养基为基础，通过调整和优化氨基酸的浓度和其他部分营养物质的浓度，制备⽆动物源、⽆蛋⽩、化学成分确定的CDM培养基，将CHO-K1细胞以1×106个／ml直接接种⾄CDM，每隔48h传代，观察其⽣长情况。使⽤含10％DMSO，不添加任何⾎清和蛋⽩的CDM冻存CHO-K1细胞并复苏，评价其适应性、稳定性以及冻存、复苏性能。
1.6CHO-K1细胞在各种⽆⾎清培养基中的培养
将复苏后的CHO-K1细胞以5×105个／ml接种于125ml摇瓶中，分别以SFMC、PFM和CDM培养基，于37℃，5％CO
2
，125r／min条件下振摇培养，观察细胞⽣长、代谢和重组蛋⽩表达情况。
1.6.1细胞计数：⽤⾎球计数板进⾏细胞计数，并⽤台盼蓝拒染法测定细胞的存活率，每个样品计数3次，取平均值作为细胞数。
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1.6.2葡萄糖、氨和乳酸浓度的测定：分别采⽤葡萄糖分析试剂盒、尿素氮检测试剂盒和乳酸检测试剂盒测定葡萄糖、氨和乳酸浓度，操作均按试剂盒说明书进⾏。
1.6.3⽬的蛋⽩的检测：采⽤ELISA法检测⽬的蛋⽩的含量。⽺抗⼈IgG Fc抗体经碳酸盐缓冲液（pH9.6）1∶2000稀释后，以100µl／孔加⾄酶标板，4℃过夜；PBST洗板3次，加⼊1％BSA／PBST，200µl／孔，37℃封闭2h；PBST洗板3次，分别加⼊标准品和样品，各100µl／孔，37℃孵育1h；PBST洗板3次，加⼊HRP标记的⽺抗⼈IgG（1∶20000稀释），100µl／
孔，37℃孵育1h；PBST洗板3次，加⼊TMB底物，室温避
光显⾊15min；加⼊H
唐朝衣服2
SO4终⽌反应，检测A450值。
1.7CHO-K1细胞在⽣物反应器中的流加培养
复苏CHO-K1细胞，接种于PFM或CDM中，于37℃，5％CO2，125r／min振摇培养。以对数⽣长期的细胞作为种⼦，接种⾄含PFM或CDM培养基的1.4L搅拌式⽣物反应器（Bioflo110）中，采⽤流加培养模式培养重组CHO细胞，初始培养体积为600ml，培养温度为37℃，搅拌转速为90r／min，通
过添加CO
2
和7.5％NaHCO
3
控制培养pH值为7.2，通过环形供⽓装置进⾏⽓体供应，通过空⽓、氮⽓、氧⽓控制溶氧（DO）为50％，流加营养物质主要包括氨基酸、维⽣素、⽆机盐和糖类化合物。实时检测细胞密度和细胞⽣长、代谢及重组蛋⽩表达情况。
2.结果
2.1⽆动物源PFM成分的优化
2.1.1铁盐替代⽜转铁蛋⽩：试验结果显⽰，采⽤柠檬酸铁替代转铁蛋⽩可提⾼细胞密度，培养72h 后，添加16mmol／L柠檬酸铁的培养基活细胞密度最⾼，是SFMC的1.2倍，见图1。表明柠檬酸铁作为⼀种弱离⼦螯合剂，完全可以取代SFMC中转铁蛋
⽩的运输作⽤，同时也可为细胞⽣长提供充⾜的铁离⼦。
图1在⽆转铁蛋⽩SFMC 中添加不同浓度的柠檬酸铁对细胞⽣长的影响
Fig 1.Effect of different ferric citrate concentrations on cell growth in SFMC without bovine transfferrin
2.1.2锌盐替代⽜胰岛素：试验结果显⽰，采⽤硫
酸锌替代⽜胰岛素可提⾼细胞密度，添加1mg ／L 硫酸锌的培养物在培养72h 时活细胞密度最⾼，是SFMC 的1.1倍，见图2。表明硫酸锌可以替代SFMC 培养基中的胰岛素蛋⽩，并可满⾜细胞进⾏⽣命活动的⽣理需求。
图2在⽆胰岛素SFMC 中添加不同浓度的硫酸锌对细胞⽣长的影响
Fig 2.Effect of zinc sulfate at various concentrations in insulin-free SFMC on cell growth
2.1.3⾮动物源蛋⽩⽔解物替代动物组织⽔解物：试验结果显⽰，添加0.5g ／L 酵母⽔解物的培养物在培养72h 时活细胞密度
最⾼，优于⼤⾖蛋⽩⽔解物的培养效果，与动物组织⽔解物培养效果相当，见图3。表明酵母⽔解物完全可代替动物组织⽔解物促进细胞⽣长。
2.1.4⽆动物源PFM 的评价：试验结果表明，CHO-
建行存款利率K1细胞株可以直接从SFMC 培养基中转移⾄PFM
中，不需要进⾏适应即可良好⽣长，并可连续传代，平均活细胞密度保持在4×106个／ml 以上，见图4。CHO-K1细胞经PFM 冻存、复苏后，细胞活性维持在
90％以上，经过4次传代后即可恢复正常⽣长，见图5。同样使⽤该培养基冻存CHO-K1细胞后进⾏复苏，培养结果相同。
图3不同浓度的⾮动物源蛋⽩⽔解物对细胞⽣长的影响Fig 3.Effect of non-animal-derived protein lysate at various concentrations on cell growth
图4CHO-K1细胞在PFM 中的⽣长
Fig 4.Growth of CHO-K1cells in PFM
图5CHO-K1细胞在PFM 培养基中冻存和复苏效果Fig 5.Frozen and resuscitation of CHO-K1cells cul－tured in PFM
活细胞密度（×105个／m l ）
6010203040500
1234567891011121314151617181920
代次
活细胞密度（×105个／m l ）
01416SFMC
柠檬酸铁浓度（mmol ／L ）
64051015202530354045
2
硫酸锌浓度（mg ／L ）
活细胞密度（×105个／m l ）
510152025303540
1
4
16
SFMC
活细胞密度（×105个／m l ）
蛋⽩⽔解物浓度（g ／L ）
510152025303540活细胞密度（×105个／m l ）
代次
601020304050700
开心丁香
细胞活性
（％）
2.2CDM 的评价
试验结果表明，CDM 培养基能⽀持CHO-K1细胞的⾼密度⽣长，同样能⽀持CHO-K1细胞的连续传代培养、冻存和复苏，见
图6和图7，最⾼细胞密度可达7.3×106个／ml ，见图8。2.3CHO-K1细胞在各种⽆⾎清培养基中的培养
试验结果显⽰，CHO-K1细胞在SFMC 、PFM 和CDM 培养基中的最⾼密度分别为4.5×106、9.3×106和7.3×106个／ml
，PFM 和CDM 培养基的最⼤
细胞密度与SFMC 培养基相⽐，
分别提⾼了107％和62％，表明SFMC 中的蛋⽩完全可以被微量⾦属元素
替代，微量⾦属对细胞⽣长的刺激作⽤优于蛋⽩；细
胞在3种培养基中的代谢⽔平基本⼀致，
乳酸和氨的累积均处于较低⽔平；细胞在PFM 和CDM 培养基中
的最⾼蛋⽩表达量均超过SFMC 培养基。见图8。2.4CHO-K1细胞在⽣物反应器中的流加培养
CHO-K1细胞采⽤PFM 经搅拌式⽣物反应器中流加培养，最⾼密度可达9.8×106个／ml ，培养216h 时，细胞活性仍维持在80％，重组蛋⽩表达量达110.5mg ／L ；采⽤CDM 培养基经流加培养，CHO-K1细胞最⼤密度可达9.5×106个／ml ，但细胞培养时间较PFM 培养基短。
活细胞密度（×105个／m l
）
6010203040500
1234567891011121314151617181920
代次
图8CHO-K1细胞在不同培养基中的代谢、⽣长和重组蛋⽩表达情况
Fig 8.Metabolism ，growth and recombinant protein expression in CHO-K1cells in various media
图6CHO-K1细胞在CDM 中的⽣长情况Fig 6.Growth of CHO-K1cells in CDM
图7CHO-K1细胞在CDM 中的冻存和复苏效果
Fig 7.Frozen and resuscitation of CHO-K1cells cultured in CDM
活细胞密度（×105个／m l ）
■PFM
▲CDM □SFMC
100
敬业奉献60102030405070800
90024487296120144
时间（h ）细胞活性（％）
■PFM ▲CDM □SFMC
100时间（h ）0
24
48
72
96
120144
