专家点评丨两篇Nature长文首次系统揭示内含子的重要功能：帮助酵母应对压力下的生存
撰文丨陈哲 博士
点评丨周宇（武汉大学生命科学学院教授）
责编丨迦溆风水梨
内含子（intron）的存在，是真核细胞蛋白质编码基因与原核细胞最大的区别。在真核细胞基因表达的过程中，需要经过RNA剪接反应将其去除。一般来说，内含子的长度远比编码蛋白的外显子序列长，并且执行剪接反应的酶——剪接体高度复杂，由170多个相关蛋白组成。剪接反应需要高度精准，移码错位一个碱基都会导致编码蛋白的异常【1】。内含子的存在，使得真核细胞在基因表达过程中需要耗费大量的能量和核苷酸去合成、剪除以及降解它，这无疑会增加真核细胞的生存负担。那么内含子的存在对真核细胞有什么好处呢，它本身是否具有功能呢？
早先的研究发现，内含子的存在，能够促进包含它的mRNA的表达，并且部分内含子中编码有snoRNA和miRNA等【2, 3】，但这可能并不足以解释耗费巨大代价而存在的内含子所具
有的积极意义。1月17日，来自加拿大谢布鲁克大学的Sherif Abou Elela团队在Nature上发表了题为Introns are mediators of cell respon to starvation导游欢迎词中国风俗的研究长文，该研究构建了酿酒酵母全部内含子的单独敲除细胞，通过对所有内含子单敲细胞的表型、转录组以及遗传进行整合分析，揭示出内含子自身独立于其编码基因的通用功能——介导细胞对饥饿的应答。另外，来自MIT的 David P. Bartel（HHMI研究员，Whitehead Institute研究员 ）团队在Nature上以“背靠背”的形式发表了题为Excid linear introns regulate growth in yeast的研究长文，发现了酵母中34个“稳定内含子”以剪切后的全长及线性形式存在，可能与ILS剪接体结合，并发现这些稳定内含子受TORC1通路的调控，在压力条件下调控生长速度，提高了酵母的适应性。Nature同期还配发了题为Intron RNA quences promote cell survival的NEWS & VIEWS文章，高度评价了这两项工作。
为了研究内含子自身的功能，Sherif Abou Elela团队选取了酿酒酵母这种只有295个内含子的生物，这使得构建所有内含子单敲的生物个体具有了可行性。实际上，十多年前，Sherif Abou Elela团队就已经开始了这项工作【4, 5】。
通过单敲细胞在YEPD（yeast extract peptone dextro，酵母浸出粉胨葡萄糖）培养基中
的生长表型研究，他们发现，只有5个单敲细胞（敲除295个内含子中的一个）不能生长，另外有5个单敲细胞的生长速率受到了一定影响，也就是说，只有一小部分（10/295）内含子对酿酒酵母在营养丰富的培养基中的生长是必需的。考虑到酵母在自然环境中经常遇到营养匮乏的情况，研究者又进行了单敲细胞与野生型细胞的混合竞争培养，结果发现，到培养的稳定期时，罗曼蒂克消亡史剧情解析大部分单敲细胞被野生型细胞竞争淘汰了，然而补充新鲜培养基后，它们反而又取得了竞争优势。进一步的培养研究发现，在稳定期之前的对数生长期，单敲细胞和野生型细胞的生长模式是相同的。这些结果说明，内含子对于细胞在营养匮乏的稳定期的生存是必须的，而这与内含子所在基因编码的蛋白的功能无关。
通过单敲细胞在不同培养阶段的转录组研究，研究者发现内含子对细胞生长的影响与其细胞内各种mRNA的丰度无关。但是，对野生型细胞不同培养阶段的转录组研究发现，进入稳定期后，细胞内的内含子丰度升高了，这说明营养缺乏会导致未被剪接的mRNA的积累。然而，在单敲细胞中，稳定期仍有较高水平的RNA剪接。以上结果表明，内含子可以抑制稳定期RNA的剪接。接着，通过检测多个内含子同时敲除的细胞，发现内含子之间具有上位效应，这说明不同内含子是通过同一条代谢通路影响细胞在稳定期的生长的。
商品购销合同范本
接着，通过在单敲细胞中外源表达经过不同改造后的内含子基因，研究者发现，即使突变后剪接不能完成，仍然能够使单敲细胞回复野生型的表型。但是仅表达内含子序列本身，并不能恢复单敲细胞的野生表型。进一步的基因结构定位发现，内含子所在基因的5’-UTR与内含子的功能相关，具有抑制单敲细胞在稳定期生长功能的内含子能够与其所在基因的5’-UTR进行配对（下图）。
最后，研究者对内含子在哪个代谢通路上发挥作用进行了研究。单敲细胞的转录组结果显示，内含子敲除后，上调的基因主要是蛋白质翻译和呼吸相关的基因。考虑到蛋白质翻译相关基因中的核糖体基因受到营养敏感的TOR通路的调控，研究者具体分析了TOR通路相关蛋白与内含子单敲细胞表型之间的关系，结果发现内含子的功能处在TORC1通路下游，与TORC1共同调节核糖体基因的表达（下图）学美发。
这项研究揭示了内含子自身独立于其编码基因的通用功能——介导细胞对环境营养物质的应答，而这可能是内含子在真核细胞的进化过程中被保留下来的一个重要原因。虽然积累的内含子能够通过竞争有限的剪接体从而抑制细胞整体的RNA剪接【6】，但是TORC1通路如何抑制剪接体而导致内含子的积累这一重要问题在这项研究中并没有得到解决。2017
年底，美国威尔康奈尔医学院的John Blenis团队在Cell上发表的研究工作发现，mTORC1-S6K1-SRPK2通路能够通过磷酸化SR蛋白从而调控RNA的可变剪接，影响脂肪生成相关基因内含子的留存【7】。在高等真核细胞中有大量的SR家族蛋白，虽然剪接体在真核细胞中高度保守，但是低等的酿酒酵母却缺乏SR家族蛋白，目前只有一个RNA剪接相关的SR蛋白被报道【8】。所以John Blenis团队的工作并不一定能够用于解释酿酒酵母在营养匮乏条件下如何通过TORC1通路导致细胞内含子的积累，这还需要进一步的研究。
对于另一项来自David P. Bartel团队的工作来讲，该研究同样发现内含子具有独立于其编码基因的功能，即通过TORC1通路调控酿酒酵母细胞的生长。与Sherif Abou Elela团队的发现不同，David P. Bartel团队鉴定的介导TORC1通路的内含子是被切下来的线性内含子，不具有内含子以外的序列，并且具有此功能的内含子的个数也更少。这可能是由于两组研究人员采用的研究方法的不同导致的，Sherif Abou Elela团队采用的是系统的反向遗传学手段进行全面的检查和鉴定，而David P. Bartel团队首先采取的是正向的研究手段，然后反向验证，这可能导致其发现的不够全面。虽然这两项研究工作的结果不完全一致，但是他们都共同发现了内含子具有其自身的功能。
古诗七言
图片引自Nature News & VIEWS，2019
高等真核生物基因中的内含子结构远远要比酿酒酵母复杂的多，以往的工作主要围绕内含子影响其所在基因的功能进行探讨，而这期Nature上的两项针对内含子自身功能的研究工作，为我们进一步认识内含子的生物学功能和意义打开了一扇新的窗口。
原文链接：
1、/articles/s41586-018-0859-7
2、/articles/s41586-018-0828-1
专家点评
世界七大爱情圣地周宇（武汉大学生命科学学院教授）
内含子在真核生物中普遍存在，是区别于原核生物的一个重要特征。在高等生物中，内含子已被报道可以在多个层面调控基因表达。内含子的主要作用是通过可变剪接产生不同外显子组合进而翻译出不同的蛋白，提高了蛋白质组的复杂性。内含子区域的增强子（enhancer）等调控元件可以直接调控基因的转录。内含子区域的RNA元件如5’ss可以抑
制转录的提前终止。内含子剪接过程中组装的EJC复合物可以促进mRNA的出核转运和在细胞质的翻译以及通过NMD途径介导RNA降解。Splicing过程中剪切出来的内含子通常被认为是基因表达的副产物，会被快速降解。但有些内含子可以加工出多种非编码RNA，比如miRNAs、snoRNAs、中科大单革研究组发现的EIciRNAs、以及上海生化研究所陈玲玲研究组发现的ciRNA、sno-lncRNA 和SPA lncRNA等。
来自Bartel和Eela实验室的最新研究同时发现内含子的存在有助于酵母更好地应对压力条件下的生存。Bartel等通过non-PolyA RNA-q在处于平台期生长的酵母中发现了34个“稳定内含子”（stable intron），这些内含子以剪切后的全长及线性形式存在，可能与ILS剪接体结合，其共有的一个显著特征是分枝位点与3’剪接位点的距离很短（小于30nt）。进一步发现这些稳定内含子受TORC1通路的调控，在压力条件下调控生长速度，提高了酵母的适应性。Elela等则通过系统地敲除内含子检测突变株在饥饿条件下的存活率，发现酵母中大多数内含子可以帮助其在饥饿条件下的生存，而这种作用与内含子的宿主基因功能无关。有趣的是，这些内含子的作用依赖于5’UTR以及5’UTR与内含子形成的RNA二级结构。并进一步揭示这类内含子介导了核糖体相关蛋白（RPGs）表达的抑制，促进了营养缺失条件下酵母的存活。两篇论文都表明这些内含子可能通过quester剪接复合体影响
含有内含子基因的表达，特别是RPGs的表达，从而调控了酵母的生长。一个区别在于Bartel发现的稳定内含子是剪切出来作为独立的线性分子，而Elela发现内含子以RNA前体形式（依赖5’UTR），通过竞争的方式发挥ceRNA的作用影响了剪接体，两者的具体作用机制均有待进一步阐明。
