作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(3): 520−525
www.chinacrops/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
E-mail: xbzw@chinajournal
基金项目: 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10A104); 国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2004CB117200) 作者简介: 王凯(1980−), 男, 在读博士生。
*
通讯作者(Corresponding author): 张增艳(1963−), 博士, 研究员, 博士生导师, 主要从事小麦抗病分子生物学与分子育种研究。Tel: 010-********; E-mail:
Received(收稿日期): 2007-06-05; Accepted(接受日期): 2007-09-18.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00520
中间偃麦草SGT1基因的克隆及其抗病功能的分析
王 凯1 杜丽璞1 张增艳1,*
廖 勇1 徐惠君1 姚乌兰1 杨 昆
1,2
邵艳军
2
辛志勇1
(1 中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部作物遗传育种重点开放实验室, 北京100081; 2
河北农业大学生命科学学院, 河北保定 071001)
摘 要: 为了探索中间偃麦草SGT1基因在小麦抗病反应中的应用潜力, 采用RT-PCR 和RACE 方法克隆出中间偃麦草SGT1基因, 命名为TiSGT1。该基因编码蛋白具有SGT1蛋白典型的功能域结构, 与大麦SGT1序列高度同源。通过基因重组技术构建了TiSGT1的高效组成型表达载体, 通过基因枪法将该载体转化到小麦品种扬麦12基因组中。对转基因植株PCR 、Southern 杂交与RT-PCR 分析表明, TiSGT1基因可在T 0、T 1和T 2代转基因小麦中遗传和表达。黄矮病、白粉病抗性鉴定结果表明, SGT1的超量表达可以提高小麦对黄矮病、白粉病的抗性, TiSGT1可以作为小麦广谱抗病性改良的潜在基因资源。
关键词: 中间偃麦草; 白粉病; SGT1; 基因克隆; 小麦; 抗病性鉴定
Isolation and Preliminarily Functional Analysis of SGT1 Gene of Thino-pyrum intermedium
WANG Kai 1, DU Li-Pu 1, ZHANG Zeng-Yan 1,*, LIAO Yong 1, XU Hui-Jun 1, YAO Wu-Lan 1, YANG Kun 1,2, SHAO Yan-Jun 2, and XIN Zhi-Yong 1
(1 National Key Facility of Crop Genetic Resources and Gene Improvement / Key Laboratory of Crop Genetic and Breeding, Ministry of Agriculture / Institute of Crop Science, Chine Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2 College of Life Sciences, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei, China)
Abstract : To understand the role of SGT1 gene in wheat (Triticum aestivum L.) dias resistance, we ud RT-PCR and RACE
methods to isolate SGT1 genes from Thinopyrum intermedium . The SGT1 was named TiSGT1. The deduced TiSGT1 protein pos-ss the typical domains of known SGT1 proteins and shows highly homology with barley SGT1 protein. A highly efficiency expression vector of TiSGT1 was constructed by genetic recombination, and transformed into the wheat cultivar ‘Yangmai 12’ by biolistic particle method. Transformation plants were analyzed by PCR, Southern hybridization, and RT-PCR methods. The results showed that the TiSGT1 gene could be inherited from T 0 to T 2 generations, and could be expresd. The results of dia resis-tance test indicated that the over-expression of SGT1 in the transgenic wheat enhanced resistance to barley yellow dwarf virus and powdery mildew, and TiSGT1 could be ud as a potential gene resource for improving broad spectrum resistance of wheat. Keywords: Thinopyrum intermedium ; Powdery mildew; SGT1; Gene cloning; W
heat; Dia resistance test
小麦生长过程中受到许多不同病害的威胁, 如小麦白粉病、赤霉病、条锈病和黄矮病等, 往往给小麦生产带来巨大损失, 威胁粮食生产安全。选育和推广抗病小麦新品种是保证小麦稳产和高产的经济有效途径。由于小麦基因组庞大, 重复序列多, 使小麦抗病(resistance, R )基因克隆进展缓慢, 目前仅有3个被克隆出来[1]。小麦及其野生
近缘植物的多个R 基因被用于小麦抗病性改良, 然而这些R 基因与病原菌致毒基因之间互作方式大多遵循“基因对基因”假说[2], 存在抗性易
“丧失”等潜在危险。因此, 研究小麦及其近缘物种的抗病反应机制、发掘更多可用于抗病育种的基因资源非常重要。
生与死的感悟句子对模式植物抗病机制的研究表明, 植物R 基因产物
第3期王凯等: 中间偃麦草SGT1基因的克隆及其抗病功能的分析521
彷徨什么意思可以与相应病原致毒基因产物直接或间接作用, 引发后续的防御反应[3], 包括局部活性氧积累、细胞程序化死亡和局部发生超敏反应等[3-4]。这些反应一方面限制了病原菌在侵染点的生长和进一步扩展, 同时通过向侵染点附近组织释放调节防御信号的分子, 诱发整个植株的防卫基因表达, 产生系统获得性
抗性。近年研究发现了一些对R基因介导的抗病反应至关重要的基因, SGT1 (suppressor of the G2 allele of skp1)就是其中之一。SGT1最早是在酵母中发现的, 是与发育相关的重要基因[5]。通过基因沉默试验证明, 多种植物的不同抗病反应都需要SGT1参与[6-11], 推测SGT1可能位于不同R基因介导抗病信号途径的集中点上[12]。植物SGT1蛋白具有5个结构域, 包括位于N端重复结构(TPR)、可变区(VR1和VR2)、CS区和位于C端SGS区[6], 其中TPR、CS区和SGS区对于SGT1蛋白发挥功能非常重要。SGT1蛋白以多种方式参与调控植物抗病反应, 如调节R蛋白复合体的积累水平[8], 调控植物的病原侵染点的超敏反应, 还与非宿主抗性密切相关[14]。目前推测SGT1蛋白参与调控植物抗病反应的分子机制: 一是在植株无病原诱导情况下, 与RAR1和HSP90共同调节R蛋白识别复合体(R protein recognition complex)的结构, 使R蛋白识别复合体在植株体内保持一定的积累水平[8], 一些基因沉默试验结果证明了这一推测; 二是在R蛋白识别复合体识别病原无毒(Avr)因子后, 同HSP90或RAR1一起调节R蛋白复合体的构象, 可能由此激发抗病反应信号; 三是降解植物防御反应的负向调节因子, 促进植物防御反应的进行[12]。
中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)是多年生小麦野生近缘植物, 具小麦改良的许多重要有益性状, 包括免疫或高抗小麦白粉病、条锈病、叶锈病、秆锈病、黄矮病、赤霉病等, 其中一些抗病基因已被广泛应用于小麦抗病性改良。但有关中间偃麦草SGT1基因分离及其在抗病反应中的作用至今未见报道。本研究旨在从中间偃麦草中克隆出SGT1基因全长开放阅读框(open reading frame, ORF)序列, 创
造和鉴定SGT1基因超量表达的转基因小麦植株, 并对这些转基因小麦进行抗病性鉴定, 研究在小麦中超量表达的SGT1基因对小麦黄矮病、白粉病抗性的影响, 探索中间偃麦草SGT1基因在小麦抗病分子育种中的应用潜力。
1材料与方法
1.1试验材料
中间偃麦草Z1146由中国农业科学院作物科学研究所李立会研究员惠赠, 由本组保存。小麦品种扬麦12由江苏里下河地区农科所提供。带BYDV-GAV病毒株系的蚜虫由中国农业科学院植物保护研究所病毒组提供。小麦白粉病菌(Blumeria graminis f. sp. tritici)15号生理小种由中国农业科学院作物科学研究所朱振东研究员提供, 小麦白粉病菌混合菌株采自本组温室感病小麦叶片。单子叶高效组成性表达载体pAHC25由本实验室保存。1.2中间偃麦草SGT1基因的克隆
根据其他植物已克隆SGT1基因的保守域设计引物(sgtF: 5′-GACCTCGACGCAGACATG-3′, sgtR: 5′-CTC (A/C)AGCTTATCCCAGTC-3′)。采用Trizol试剂(天为时代公司)提取接种白粉病48 h的中间偃麦草叶片RNA, 利用TaKaRa公司的反转录试剂盒将纯化的RNA反转录合成第一链cDNA, 以该cDNA为模板, 用sgtF与sgtR扩增出中间偃麦草SGT1基因片段, 然后以此片段设计3′RACE 和5′RACE引物, 按照Invitrogen公司3′RACE和5′RACE 试剂盒的方法分离该基因两端序列, 将这些序列进行拼接, 再设计引
物从cDNA中扩增中间偃麦草SGT1基因全长ORF序列。
同时采用另一种策略克隆中间偃麦草SGT1基因, 即搜索NCBI与GRINGENE数据库中SGT1基因同源的小麦表达序列标签(expresd quence tags, ESTs)序列, 电子拼接这些ESTs得到包括完整ORF的SGT1序列, 设计引物从上述cDNA中扩增中间偃麦草SGT1基因全长ORF序列。
1.3 植物表达载体的构建
利用PCR方法在中间偃麦草SGT1基因ORF序列5′端加上Sma I、3′端加上Sac I酶切位点, 连接到pMD18-T 载体上构建中间载体pTSGT1。用Sma I和Sac I双酶切pTSGT1和pAHC25, 然后用T4连接酶将中间偃麦草SGT1的ORF连接到双酶切后的pAHC25载体上, 即将pAHC25中GUS基因替换为中间偃麦草SGT1基因的全长ORF序列, 建成中间偃麦草SGT1转基因载体pUSGT1。对pUSGT1进行Sma I和Sac I双酶切, 并进行测序分析, 鉴定其正确性。该载体中间偃麦草SGT1基因表达受Ubiqutin启动子控制, 该载体具有1个受Ubiqutin启动子控制的Bar基因表达盒, 可为后续Bialaphos筛选转化再生植株提供抗性。载体结构如图1。
1.4基因枪介导法转化小麦和筛选、分化与植株再生
以扬麦12授粉14 d左右的幼胚为外植体, 接种于SD2培养基, 26℃暗培养诱导愈伤组织。采用基因枪轰
击的愈伤组织[15-17], 经恢复培养及2~3次分化生长和 Bia-laphos筛选, 将再生植株转移到壮苗培养基(1/2 MS＋0. 2 mg L−1 NAA＋0.5 mg L−1 MET)上壮苗, 把苗高7~8 cm且根系发达的转化苗移栽到花盆, 在可控温室生长至三叶期提取基因组DNA。
1.5转基因植株的分子检测
1.5.1 基因组DNA PCR检测用改良的SDS法[18]提取基因组DNA。根据pAHC25载体携带的Bar基因序列设计一对检测Bar基因的特异引物(barF: 5′-AAGCACGG TCAACTTCCGTA-3′, barR: 5′-GAAGTCCAGCTGCCA GAAAC-3′), 扩增产物片段大小为412 bp, 扩增程序为94℃预变性5 min; 94℃ 1 min, 57℃ 1 min, 72℃ 1 min, 40个循环; 72℃延伸10 min。扩增产物在1%琼脂糖胶上进行检测。
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作 物 学 报 第34卷
图1 载体pAHC25、pTSGT1和pUSGT1示意图 Fig. 1 Scheme of pAHC25, pTSGT1, and pUSGT1
1.5.2 Southern 杂交检测 用限制性内切酶Eco R V 消化基因组DNA (25~30 μg), 在0.8%琼脂糖胶上电泳分离, 随后采用碱变性法将消化的DNA 转移至尼龙膜上。采用TaKaRa 公司的Random Primer Labeling Kit
2.0试剂盒标记探针, 预杂交、杂交方法参照文献[19]。
1.5.3 半定量RT-PCR 分析 采用Trizol 试剂提取植株叶片RNA, 利用TaKaRa 公司的反转录试剂盒将RNA 反转
录合成第一链cDNA, 以此为模板, 首先以Actin 基因特 异引物(ActF: 5′-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3′, ActR: 5′-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3′)对各样本进行扩增, 以使模版cDNA 均一化, 然后用引物sgtF 和sgtR 进行半定量RT-PCR 表达分析。 1.6 抗病性鉴定
眼睛视力表
通过接种带BYDV-GAV 株系的蚜虫接种BYDV, 接种3 d 后杀死蚜虫, 接种30、45和60 d 调查黄矮病抗性。
采用活体摩擦结合抖落孢子的方法接种。接种2周后进行苗期抗病性调查, 并于成株期调查成株期抗病性。成株期的抗病分级按照国际小麦玉米改良中心和国家标准GB/T 1798.22-2000“农药田间药效试验标准(一)杀菌剂防治禾谷类白粉病”分为9级。
2 结果与分析
2.1 TiSGT1基因的克隆 从中间偃麦草叶片cDNA 中克隆出SGT1基因的全长ORF 序列, 且两种策略克隆出的SGT1基因全长ORF 序列一致。中间偃麦草SGT1基因命名为TiSGT1(NCBI 注册登录号为EF534375)。TiSGT1基因推导产物为由371个氨基酸组成的蛋白TiSGT1, 具有已克隆SGT1蛋白的典型结构, 包括TPR 区、CS 区、SGS 区和两个VR 区(图2)。用MEGA
3.1软件分析TiSGT1、大麦SGT1(AAL33610)、
图2 推导中间偃麦草SGT1蛋白与大麦SGT1蛋白同源性比较
Fig. 2 Alignment of deduced TiSGT1 protein quence and HvSGT1 protein quence
第3期
王 凯等: 中间偃麦草SGT1基因的克隆及其抗病功能的分析
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图3 TiSGT1、HvSGT1、OsSGT1、NbSGT1、AtSGT1a 和AtSGT1b
氨基酸进化树分析
Fig. 3 Phylogentic tree analysis of amino acids of TiSGT1, HvSGT1, OsSGT1, NbSGT1, AtSGT1a, and AtSGT1b Hv: barley; Os: rice; Nb: tobacco; At: Arabidopsis
梦见出国了水稻SGT1(AAF18438)、烟草SGT1(AAW82048)、拟南芥SGT1a (AAL33611)和SGT1b(AAL33612)之间的同源性(括号中为蛋白序列NCBI 登录号)。结果表明, TiSGT1与HvSGT1同源性最高, 为97.32%。
2.2 表达载体的构建
用Sma I 和Sac I 两个限制性内切酶酶切、回收含酶切位点的目的载体片段和TiSGT1基因片段、用T 4DNA 连接酶连接, 将TiSGT1全长ORF 序列替换pAHC25中GUS 基因。经测序分析后, 选出构建正确的TiSGT1单子叶表达载体, 命名为pUSGT1, 用于下一步基因枪转化。
2.3 转TiSGT1基因植株的获得与分子检测
用包裹pUSGT1载体的金粉微粒子弹轰击扬麦12的幼胚约4 000个, 获得T 0代再生植株201株, 利用Bar 基
因引物进行PCR 检测、筛选, 获得PCR 检测阳性(图4-a)的转基因植株24株, 转化率为0.60%。
对转基因T 1代13个株系93个单株进行Bar 基因的PCR 分析, 检测到阳性植株70株(图4-b), 证明TiSGT1基因已经从T 0代传递到T 1代, 在T 1代中转基因的分离比符合3∶1( χc 2=0.0036<χ0.052)。对T 2代转基因植株进行Bar 基因的PCR 检测结果表明, T 1代转基因纯合株系的T 2代植株中均检测到Bar 基因, T 1代杂合株系的T 2代转基因植株中Bar 基因检测的阳性与阴性比基本符合3∶1 (图4-c), 证明TiSGT1基因已经从T 1代传递到T 2代，可能以单拷贝形式存在。
选取不同T 1代株系中PCR 检测阳性单株, 进行TiSGT1基因的Southern 杂交分析。由于小麦基因组中
含有与TiSGT1高度同源的SGT1基因, 而Bar 基因和TiSGT1基因共同存在于同一表达载体pUSGT1上, 所以采用Bar 基因片段作为Southern 杂交探针。由于
Bar 基因探针序
图4 转TiSGT1基因小麦T 0 (a)、T 1 (b)和T 2 (c)植株的PCR 检测及T 1植株的Southern 杂交
Fig. 4 PCR test of TiSGT1 transgenic T 0 (a), T 1 (b), and T 2 (c), and Southern analysis of T 1 plants (d) in wheat
列内部不含Eco RV 酶切位点, 因此Southern 杂交结果中杂交带数可以表示外源TiSGT1在转基因小麦植株基因组 中的拷贝数。Southern 杂交结果表明, TiSGT1在3个阳性株系中的整合位点相似, 均以单拷贝存在(图4-d), 与遗传分析结果吻合。
半定量RT-PCR 分析T 2代中PCR 检测阳性的单株SGT1基因表达情况。结果表明, 转基因阳性植株中SGT1转录水平明显高于未转基因的对照植株 (图5)。 2.4 转基因植株的抗病性鉴定
PCR 检测阳性的转TiSGT1基因T 1代植株(13个株系共93个单株)和未转基因植株, 同时接种携带BYDV-GA V 株系的蚜虫和小麦白粉病菌15号小种, 进行抗病性鉴定。结果表明, 14株转TiSGT1基因T 1代植株在全生育期免疫、高抗黄矮病、白粉病, 而阴性对照扬麦
花灯制作方法12则感黄矮病、白粉病。
图5 转基因T 2代阳性植株的转录表达半定量分析
Fig. 5 Semi-quantitative RT-PCR result on expression level of
transgenic T 2 plants
PT-PCR 的特异引物为SGT1和Actin 。1: 扬麦12; 2~7: T 2代转基因单株,
其中泳道7为图4-d 中泳道4所用材料的后代。
The specific primers for RT-PCR are SGT1 and Actin . 1: Yangmai 12; 2–7: T 2 individuals of transgenic plant, and the material in lane 7 is the progeny
of that in Fig. 4-d.
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对PCR检测阳性的转TiSGT1基因T2代植株接种病毒BYDV-GAV株系。结果表明, 其中有96株高抗黄矮病, 阴性对照扬麦12感黄矮病; 接种小麦白粉病菌混合小种鉴定的结果表明, 113株转基因植株苗期抗白
粉病、成株期中抗(平均感病指数为3级), 阴性对照扬麦12苗期和成株期均高感白粉病(成株期达9级)。结合RT-PCR分析结果发现, 转TiSGT1基因T2代植株中SGT1转录表达量高的株系均表现出对黄矮病、白粉病抗性的提高, 说明SGT1超量表达的转基因小麦株系提高了对黄矮病、白粉病的抗性。
3讨论
近年来, 新的RT-PCR、RACE、电子克隆技术和小麦EST序列的快速发展, 为小麦及其近缘植物基因全长cDNA序列的分离克隆提供了便利条件。我们利用小麦EST序列、采用RT-PCR、RACE与电子克隆技术两种策略所克隆的TiSGT1基因ORF的序列一致, 说明在中间偃麦草中SGT1是比较保守的。另外, TiSGT1与小麦SGT1的ORF相似性为96.47%, 编码蛋白相似性为96.29%, 二者同源性较高, 所以小麦的ESTs可以用于设计、克隆中间偃麦草中同源的信号调控基因, 有利于进一步发掘中间偃麦草中的有益基因资源。序列分析还发现, SGT1蛋白序列中各结构域之间的同源性存在较大差异, 其中SGS、TPR、CS结构域的同源性较高, 而可变区的同源性最低, 这种同源性差异可能与它们对于SGT1功能的重要性有关。
本研究中采用TiSGT1同时存在于一个转基因载体上的bar基因进行转基因小麦中目标基因的分子检测, 其主要原因, 一是小麦基因组中也有SGT1基因, 并且以三拷贝形式存在[21], 小麦SGT1基因的核酸序列与目标基因(TiSGT1)核酸序列相似性高达98%, 难以直接用TiSGT1的序列进行分子检测的结果准确
痔疮中药配方判断TiSGT1的转化和整合到小麦基因组中的情况; 二是TiSGT1、Bar基因同时存在于一个转基因载体上, 二者相距仅1.9 kb, 遗传分离可能性极小, 它们通过基因枪同时转入小麦的概率也非常高, 所以可以用Bar基因通过PCR、Southern分析的结果检测转基因的阳性率和在小麦基因组中整合情况, 可靠性应该比较高。
大量研究结果表明, 多种植物对真菌型、细菌型和病毒型病原的不同抗病反应都需要SGT1参与。推测SGT1可能位于不同R基因介导抗病信号途径的集中点上, 对调节植物抗病反应具有“广谱作用”。研究表明, SGT1基因是多个大麦抗白粉病基因MLA介导的抗白粉病途径中的重要信号开关之一, 但不同的MLA基因对SGT1表达的需求量有所不同。MLA6介导大麦对白粉病抗性, MLA6对SGT1的需求量高于MLA1对SGT1的需求量[7-8,20], 说明SGT1表达水平必须达到某一阈值时, 才能使植株R蛋白介导抗性表达, 所以推测在植物体内增加SGT1的表达量可能会增加植株抗病能力。李为民等[22]将海岛棉GbSGT1基因在烟草中超量表达, 使烟草对赤星病抗性得到增强。这一结果证实了上述推测的可能性。VIGS试验证明, SGT1是小麦Lr21介导的条锈病抗性反应所必要的元件[10]。本研究表明, TiSGT1基因超量表达的转基因株系提高了小麦对黄矮病、白粉病的抗性, 增加了小麦抗病广谱性。暗示SGT1可能是中间偃麦草和小麦一些抗病基因介导的抗病途径中的重要信号元件。
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