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0. 准备工作 2
1. 宏基因组比对 2
2. 宏基因组组装 3
2.1 组装软件：SOAPdenovo 3
2.2 组装软件：Meta-Velvet 6
3 基因预测 6
4 构建基因集 7
0. 准备工作
上机步骤如下：
mkdir ~/Metagenome #新建工作目录
房屋委托书怎么写cd ~/Metagenome #进入工作目录
cp -R /RealBio_Train/Metagenome/01_clean_reads ./ #拷贝数据
1. 宏基因组比对
宏基因组的序列可以通过SOAPaligner比对软件，比对上目标基因组，从而进行物种注释或计算物种丰度。SOAPaligner需要先对目标基因组进行建库，建库命令如下：
2bwt-builder <quence file>
SOAPaligner用法：
soap –a <reads_a> -b <reads_b> -D <index.files> -o <PE_output> -2 <SE_output> -m <min_inrt_size> -x <max_inrt_size>
其他重要参数：
Option | Type | Content |
-r | INT | 匹配到多处时的策略： 0：不显示；1：随机显示一个；2：全部 |
-M | INT | 匹配模式：0：只允许完全匹配；1：允许一个错配； 2：允许两个错配；4：最佳匹配 |
-p | INT | 程序运行的线程个数 |
| | |
上机内容为：
将拷贝得到的reads比对上微生物的基因组。
上机步骤如下：
cd ~/Metagenome #先进入个人目录下的工作目录
mkdir 02_alignment #新建02_alignment目录
cd 02_alignment #进入比对目录
cp /RealBio_Train/Metagenome/02_aligner/soapaligner.sh ./ #拷贝比对脚本
less test01.pm #查看比对结果
less test01.sm #查看比对结果
2. 宏基因组组装
基因组组装是指将测序仪产出的大量的DNA片段（Reads）拼接成原始的待测物种的染色体序列，可以类比为拼图游戏。本手册指导你如何使用SOAPdenovo（2.04）组装软件对鸟枪法测序数据进行组装。
2.1 组装软件：SOAPdenovo
SOAPdenovo的功能是对二代测序数据进行从头组装。使用SOAPdenovo前首先要清楚的是它的组装配置文件，该文件包含以下信息：
Option | Content |
全局配置 | max_rd_len | 记录输入数据的最大读长，并根据这个配置输入缓存大小。 |
文库配置，每个文库需要以[LIB]表明 | avg_ins 教师师德考核个人总结 | 记录当前文库插入片段大小。 |
asm_flags | 用来配置流程中哪些步骤用到当前文库数据： 1，表示当前文库只在构建contig时用到； 2，表示当前文库只在构建scaffold时用到； 3，表示当前文库在构建contig与scaffold时都用到。 |
rank | 配置构建scaffold时当前文库的使用优先级，由于单端的reads不用于构建scaffold，该文库不用设置rank参数。 |
q1/q2，q | 配置当前文库数据路径，q1/q2用于配置双端的reads，q用于配置单端的reads |
| | |
本次上机使用到的完整的配置文件内容如下：
配置文件完成后，即可开始进行组装。组装分四步骤操作。
四个步骤分别是：
1. pregraph，De Bruijn图构建。输入组装配置文件，输出图信息文件，主要参数如下：
Option | Type | Content |
-s | CONFIG | 指定组装配置文件 |
-o | PREFIX | 指定输出文件的前缀，由用户随意设定 |
-p | INT | 指定使用的线程数目。SOAPdenovo使用了多线程技术以充分利用计算机资源，一般取运行机子的cpu核心数目即可，如你的机器是双核一个cpu的，那么可指定为2 |
-K | INT | 指定需要构建De Bruijn图的kmer大小，应根据SOAPdenovo的版本设定。如使用31mer版本，则可取kmer为31，29，27等 |
-d | INT | 指定构建完De Bruijn图后，需要对深度小于多少的kmer进行过滤，一般设置为1 |
| | |
2. 构建contig。输入上一步骤产生的图文件，输出contig序列文件，主要参数如下：
Option | Type | Content |
-g | PREFIX | 输入图文件前缀，应该与上面步骤中的-o参数一致 |
-D | INT | 设定在进行构建contig时，需要对深度低于该设定参数的contig连接边进行过滤。默认取值为1 |
-M | INT 数字分析 | 设定在进行构建contig时，可以先对相似的序列进行合并，参数最大取值为3，表示最大程度合并相似序列；最小取值为0，表示不对相似序列进行合并。这里取经验值2 |
-R | | 选择是否利用reads的相邻kmer信息解决短重复序列，一般选择利用 |
| | |
3.测序数据map回contig序列。在搭建scaffold前，需要先将输入数据比对回contig序列中，输出比对信息。SOAPdenovo在这一步中会将reads打碎成kmer，将一个个kmer比对回contig上，涉及到的参数有：
Option | Type | Content |
-s | STR | 输入组装配置文件 |
-g | STR | 输入De Bruijn图文件的前缀，应该与上面步骤1中的-o参数一致 |
-p | INT | 指定多线程运行使用的cpu个数 |
| | |
4.搭建scaffold。输入上步产生的contig文件和原始数据的比对信息文件，SOAPdenovo将根据比对的pair关系信息，搭建scaffold，主要参数有：
Option | Type | Content |
-g | STR | 输入De Bruijn图文件的前缀，应该与上面步骤1中的-o参数一致 |
-F | 可选参数 | 选择是否在搭建完scaffold后对其进行补洞。SOAPdenovo内置有补洞流程，主要思路是把落在内洞中的reads进行局部组装，把装好的序列嵌入到内洞中去，完成补洞工作 |
-u | 可选参数 | 选择是否需要对高深度的contig进行屏蔽后再搭建scaffold。SOAPdenovo默认会对高深度的contig进行屏蔽，以减少重复序列的影响，选择此参数，将不对高深度的contig进行屏蔽 |
-L | INT，可选参数 | 选择选取多长以上的contig进行scaffold搭建。SOAPdenovo默认选取kmer+2 |
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上机内容为：
将上一步得到的clean reads进行SOAPdenovo组装，得到contig。
上机操作的步骤如下：
cd ~/Metagenome #先进入个人目录下的工作目录
mkdir 03_asmbly #新建03_Asmbly 目录
cd 03_asmbly #进入组装目录
mkdir CFG
cp /RealBio_Train/Metagenome/03_asmbly/CFG/test01.cfg CFG/ #拷贝 组装的config文件到当前目录
mkdir shell #新建脚本目录
天津城建大学研究生院cp /RealBio_Train/Metagenome/03_asmbly/shell/test01_Kmer31.sh shell/ #拷贝组装
脚本到脚本目录
mkdir asmble #新建结果目录
mkdir asmble/test01
sh shell/test01_Kmer31.sh #运行组装脚本
less asmble/test01/test01.scafSeq #查看组装结果
ss.o asmble/test01/test01.scafSeq #查看组装统计结果
模仿CFG/test01.cfg，生成test02文件的config文件CFG/test02.cfg，插入片段长度为412；模仿shell/test01_Kmer31.sh，生成关于test02文件的组装脚本shell/test02_Kmer37.sh，kmer值设为37
mkdir asmble/test02
sh shell/test02_Kmer37.sh #运行组装脚本
less asmble/test02/test02.scafSeq #查看组装结果
ss.o asmble/tets02/test02.scafSeq #查看组装统计结果
2.2 组装软件：Meta-Velvet
Meta-Velvet是在原来基因组组装软件Velvet基础上改进的，适合宏基因组数据的组装软件。主要参数如下：
Option | Type | Content |
-cov_cutoff | INT or auto | De Bruijn图中节点过滤参数，节点层数小于该参数即被过滤 |
-ins_length | INT | 插入片段长度，reads长度加上gaps长度 |
-exp_cov | INT or auto 大数的认识测试题 | 基因组覆盖层数，这里选auto |
| 高铁票退票 | |
上机内容为：
将上一步得到的test03样品的clean reads进行SOAPdenovo组装，得到contig。
上机操作的步骤如下：
鸡翅根的做法大全cd ~/Metagenome #先进入个人目录下的工作目录
cd 03_asmbly #进入组装目录
cp /RealBio_Train/Metagenome/03_asmbly/shell/test03_Kmer31.sh shell/ #拷贝组装脚本到脚本目录
mkdir asmble/test03
sh shell/test03_Kmer31.sh #运行脚本
less asmble/igs.fa #查看组装结果
ss.o asmble/igs.fa #查看统计结果
3 基因预测
宏基因组一般使用MetaGeneMark预测contig中的cds（coding quence）序列。
Option | Type | Content |
-a | | 输出基因碱基序列 |
-d | | 输出基因蛋白序列 |
-f | 可选参数 | 选择输出格式：L为lst文件，G为gff文件，一般使用gff文件作为输出格式 |
-k | | 利用RBS序列预测基因起始位点 |
-r | 应用题五年级上册 | 输出RBS序列的打分与间隔序列 |
| | |
上机内容为：
将上一步得到的clean reads进行SOAPdenovo组装，得到contig。
上机操作的步骤如下：
cd ~/Metagenome #先进入个人目录下的工作目录
mkdir 04_gene_predict #新建04_Gene_predict目录
