颗粒细胞与卵母细胞发育
沈浣
【摘 要】颗粒细胞在卵母细胞发育、成熟中起着重要的营养及信号传导作用,同时卵母细胞对颗粒细胞的分化及发育也起着中心调节作用.研究颗粒细胞的基因表达改变可以对卵母细胞发育的微环境进行评估.颗粒细胞基因差异表达可能与卵母细胞质量有关,有可能通过对颗粒细胞基因表达谱的分析,寻找卵母细胞及胚胎选择的生物标记,以提高体外受精的受精率、胚胎种植率及临床妊娠率,降低流产率.
【期刊名称】《国际生殖健康/计划生育杂志》
【年(卷),期】2012(031)005
半产【总页数】4页(P344-347)
【关键词】卵母细胞;卵泡;受精,体外;转录,遗传
【作 者】沈浣
【作者单位】100044 北京大学人民医院生殖医学中心
【正文语种】中 文
海棠的寓意卵母细胞发育成熟的过程是在由颗粒细胞包绕的环境中完成的，因此颗粒细胞尤其是与卵母细胞之间形成大量缝隙连接的卵丘颗粒细胞，对支持卵母细胞发育成熟、传递内分泌及其他环境信号有至关重要的作用；同时，卵母细胞对颗粒细胞的分化、发育及功能也起着重要的调节作用。Vanderhyden等[1]在大鼠未成熟卵培养的实验中，发现了颗粒细胞对卵母细胞成熟的重要性：将未成熟的卵母细胞与颗粒细胞共同培养，卵母细胞能够成熟，并能获得与常规体外受精（IVF）相近的活胎出生率，而在缺乏颗粒细胞的条件下培养GV期或MⅠ的卵母细胞，则成熟率大为降低。
颗粒细胞与卵母细胞之间的相互依赖关系涉及到一整套复杂多变的双向信号传导系统，研究卵泡发育各阶段的分子及细胞调控机制，了解卵母细胞的发育及成熟过程，有助于理解一些诸如多囊卵巢综合征、卵巢反应不良、卵母细胞成熟障碍等疾病的病理机制，改进诱发排卵、控制性卵巢刺激、未成熟卵母细胞培养等临床方案。颗粒细胞是在人类辅助生殖技术实施过程中被丢弃的细胞成分，但有可能提供了卵母细胞发育及成熟的重要信息，因
此，分析人类颗粒细胞，寻找可能预测卵母细胞质量及胚胎发育潜能的标记，将会给今后胚胎选择方法提供新的思路。
1.1 卵泡发育阶段 从胚胎16周至出生后6个月形成的始基卵泡是由单层梭形前颗粒细胞围绕着停留于减数分裂双线期的初级卵母细胞构成的，所形成的卵泡池是卵母细胞储备的唯一形式。根据卵泡对促性腺激素的依赖程度不同，卵泡的发育可分为3个时期：①促性腺激素非依赖期：始基卵泡经初级卵泡、次级卵泡发育至窦前卵泡阶段，并且自胚胎形成后卵泡即进入自主发育和闭锁的轨道，此过程不依赖于促性腺激素。其机制尚不清楚。②促性腺激素反应期：是窦前卵泡向窦卵泡的过渡期。在促性腺激素及卵泡内部信号的精细调控下，有的卵泡被选择进一步发育，而大部分卵泡则发生闭锁。此期卵泡的生长主要受卵巢内部调节因子如生长因子、细胞因子及性激素的控制。该阶段是决定卵泡闭锁或生长的关键阶段。③促性腺激素依赖期：是早期窦卵泡期后的持续生长期，包括了卵泡募集、选择、优势化和排卵等[2]。
1.2 颗粒细胞的分化和发育 颗粒细胞是卵巢的主要细胞成分，提供卵母细胞发育所需要的物理支持及微环境，在卵泡发育过程中，分化为几种明显不同的细胞成分：从始基卵泡的扁平细胞到排卵前卵泡的柱状细胞到黄体期高度增生的黄体细胞。
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在卵泡发育的早期阶段，前颗粒细胞经过细胞分化和增殖以支持卵母细胞的发育；在卵泡窦腔形成时，颗粒细胞开始分化为2种在解剖和功能上截然不同的细胞成分，内衬在卵泡壁内侧的是壁颗粒细胞（mural granulo cells），主要功能是分泌激素，而围绕在卵母细胞周围的称卵丘细胞（cumulus cells）[3]。
卵丘细胞表达许多与颗粒细胞相同的基因，但其转录组学也有一些独有的与其特有功能相适应的特征。例如在鼠类晚期窦卵泡的卵丘细胞表达Slc38a3，编码共轭钠中性氨基酸转运体，而在壁颗粒细胞则没有或很少表达，这可能与卵丘细胞起着支持卵母细胞发育的作用、需要在两者之间进行氨基酸转运的功能是相适应的[4]。另外，在小鼠早期窦卵泡，卵丘细胞抗苗勒激素（AMH）表达水平也远高于颗粒细胞，通过抑制卵泡刺激素（FSH）起到抑制始基卵泡募集、调节卵泡发育的作用[5]。
2.1 颗粒细胞对卵母细胞的营养作用 卵冠丘复合体在许多基础代谢过程中要利用葡萄糖，卵泡在发育过程中需要足够的能量供应、合成核酸和嘌呤以维持细胞稳态。但卵母细胞本身利用葡萄糖的能力相对较弱，大部分的能量来自卵丘细胞对葡萄糖的利用，经过糖酵解作用，向卵母细胞提供中间代谢产物如丙酮酸盐[6]。
穿透透明带的胞浆突起在颗粒细胞、卵丘细胞和卵母细胞表面形成了大量的缝隙连接，氨基酸、核苷酸等低分子底物由颗粒细胞和卵丘细胞通过缝隙连接进入卵母细胞，进一步合成大分子物质，如核糖体和mRNA。由于颗粒细胞内没有血管，这一缝隙连接网络的营养支持及大分子转运功能对卵母细胞尤其重要。
2.2 颗粒细胞对卵母细胞的信号传导作用 除营养作用外，缝隙连接还是卵母细胞与颗粒细胞之间传递局部及内分泌信号的关键方式。卵母细胞特异性缝隙连接亚单位Connexin-37基因缺陷的雌性小鼠表现为缺乏成熟卵泡、排卵障碍、卵母细胞发育停留在减数分裂恢复前，从而造成不孕[7]。
排卵前卵泡发生的一个关键事件是卵母细胞减数分裂的恢复。Pinctus和Enzmann在1935年报道，将哺乳动物的卵母细胞从卵泡环境中移出后其能自发地恢复减数分裂。Eppig[8]认为，是卵丘细胞产生的cAMP维持了卵母细胞的减数分裂。在黄体生成激素（LH）峰前卵丘细胞广泛增生，随后LH峰发动瀑布效应，促进卵丘颗粒细胞产生透明质酸，扩展颗粒细胞间的空间，并将其包裹在黏液中。排卵前卵丘细胞的增生和扩张是颗粒细胞分化特有的特征，在排卵中起重要作用，抑制透明质酸的合成可明显降低小鼠的排卵率。LH高峰信
号是由缝隙连接介导，由卵丘细胞向卵母细胞的单向信号传导，足以启动卵母细胞的成熟。继之，卵丘细胞与卵母细胞之间的联系随着突起的消退而中断。
临床上的一些研究也发现，卵丘细胞凋亡异常升高与卵母细胞形态异常、成熟障碍、受精异常、囊胚形成欠佳等IVF不良结局有关[9]。虽然不清楚究竟是卵母细胞的异常引起了颗粒细胞的凋亡，还是颗粒细胞的凋亡影响了卵母细胞的发育，但这些观察进一步确定了卵母细胞与颗粒细胞的相互依赖关系，提示颗粒细胞的功能正常对卵母细胞的发育及成熟是必需的。
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2.3 卵母细胞对颗粒细胞分化发育的调节作用 颗粒细胞和卵母细胞之间的通讯是双向的。事实上，在哺乳动物，卵母细胞对卵泡细胞功能起着中心调节作用。卵母细胞分泌的可溶性生长因子（oocyte creted factors，OSF），包括转移分化因子9（GDF-9）和骨形成蛋白15（BMP-15），对颗粒细胞和卵丘细胞的分化、增生、凋亡和黄素化起着广泛的调节作用[10]。GDF-9和BMP-15属于转化生长因子β（TGF-β）超家族，很早期在卵母细胞特异表达，在促进卵泡生长发育经过初级卵泡阶段起到关键作用，卵母细胞缺乏GDF-9表达可引起小鼠的不育，表现为颗粒细胞增生低下，卵母细胞发育异常，卵泡不能发育越过初级卵泡阶段。
在IVF中被丢弃的颗粒细胞提供了一个很好的研究卵泡微环境的工具，通过检测颗粒细胞基因表达模式的变化，可以反映细胞在某一特定时刻对卵泡微环境发生的应激反应，进一步溯源卵母细胞发育的相关信息。
3.1 氧化应激 氧化应激是卵泡微环境的一个重要组成部分。8-羟基脱氧鸟苷是氧化应激时DNA的氧化产物，研究发现，颗粒细胞中8-羟基脱氧鸟苷含量增加与IVF时卵母细胞受精率低下及胚胎质量差有关[11]。颗粒细胞可以产生抗氧化物质，保护卵母细胞免受活性氧的损害。超氧化物歧化酶（SOD）是抗氧化物质的一种。Matos等[12]发现，高龄妇女颗粒细胞内SOD降低，而高水平的SOD活性与IVF成功妊娠是相关的。另一种有抗氧化作用的物质是谷胱甘肽S转移酶，可将有害的代谢产物分解为可溶性易于排出的形式，保护细胞免受活性氧的伤害。Ito等[13]的研究认为，谷胱甘肽S转移酶theta 1（GSTT1）可以作为年龄相关不孕的指标。应用人颗粒细胞样肿瘤KGN[14]的体外研究也观察到FSH及双氧水均可使KGN的GSTT1上调[13]，因此认为高龄妇女颗粒细胞的GSTT1是上调的。
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3.2 卵泡微环境与卵母细胞染色体异常 颗粒细胞转录组学研究发现，与卵母细胞染色体异常有关的颗粒细胞基因表达有其特征性差异，受影响的基因包括与细胞压力有关的通路，
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如低氧及营养缺乏，这提示在非整倍体与卵泡不良微环境之间存在相关性；有关激素反应的基因表达也有异常，潜在表明了非整倍体概率增加与高龄妇女激素异常之间的关系；以及凋亡相关通路基因表达异常。提示卵泡微环境可能在卵母细胞染色体异常的起源中发挥作用，而这是导致卵母细胞失能的主要原因[15]。
鉴于颗粒细胞在卵泡内的中心信号传导作用以及促卵母细胞成熟的作用，研究者们试图通过研究颗粒细胞的基因表达来寻找能够预测卵母细胞活力及IVF妊娠结局的标记。
Gasca等[16-17]使用基因芯片筛查人卵母细胞及颗粒细胞发现，在细胞周期监控、DNA修复过程中具有潜在意义的基因，包括BARD1，RBL2，RBBP7，BUB3和UB1B的适当表达可能与卵母细胞的质量有关。在反复IVF失败的患者中也发现，虽然胚胎形态正常，但颗粒细胞基因表达紊乱，受影响的基因包括参与减数分裂、细胞生长和凋亡的基因。
Assou等[18]报道了颗粒细胞BCL2L11上调（参与凋亡），PCK1下调（参与糖异生作用）及NFIB下调（转录因子）与胚胎形态学及妊娠结局有关，认为这3个基因可以作为预测妊娠的标记物。
Feuerstein等[19]采用实时聚合酶链反应（PCR）对颗粒细胞的6个基因进行了研究，选择的基因包括受LH峰诱导的基因（STAR，COX2和AREG），卵母细胞脂代谢相关基因（SCD1和SCD5）以及缝隙连接相关基因Cx43。在减数分裂恢复后，除了Cx43之外，其他基因表达均增加。卵母细胞的核成熟与颗粒细胞中STAR，COX2，AREG，SCD1和SCD5表达增加有关。与发育能达囊胚期的胚胎比较，不能发育至囊胚期的胚胎的卵丘细胞中这些基因的表达降低，故认为这些基因能预测胚胎发育潜能。
其他的有预测意义的研究还包括：①与优质胚胎有关的基因：PTGS2、HAS2、GREM1表达增高。②与早期卵裂有关的基因：CCND2，CXCR4，GPX3，CTNND1，DHCR7，DVL3，HSPB1，TRIM28涉及了细胞低氧状态及卵母细胞成熟延迟（CTNND1）。③通过商业化基因芯片比较IVF后妊娠与未妊娠妇女的颗粒细胞，发现CDC42、3bHSD、SERPINE2、FDX1、CYPA191表达改变与妊娠明显相关[15]。
