论著文章编号:100025404(2002)1121316204人红细胞膜DAF的亲和纯化及活性研究
郑 萍，邹 强，周 伟，谢佩蓉，李 华，郭 波 (第三军医大学基础医学部全军免疫学研究所，重庆400038)
提 要：目的 获得纯化并具有生物学活性的人红细胞膜促衰变加速因子。方法 经胰蛋白酶消化、正丁醇抽提及DE32离子交换色谱和抗体亲和层析等步骤从人红细胞膜影中分离纯化人红细胞膜DAF。以S DS2PAGE及免疫印迹实验检测纯度及抗原特异性，以C3转化酶体外组装实验及促衰变加速活性实验检测其补体抑制活性。结果 400ml人全血最终可得纯化DAF约420μg，回收率达26%；比活性为415×105U/mg；纯化产物在S DS2PAGE中表现为70×103的单一蛋白条带，并在免疫印迹实验中可与抗人DAF单抗特异性结合。在生物学活性实验中，纯化产物既可促进C3转化酶的衰变，也可抑制C3转化酶的形成。结论 采用本方法可获得纯化的具有生物学活性的人促衰变加速因子。
关键词：促衰变加速因子；分离纯化;C3转化酶
中图法分类号:R329.24;R331.141;R392111 文献标识码:A
Immunoaffinity purification and activity of decay2accelerating factor from human ery2 throcytic membranes
ZHE NG Ping,Z OU Qiang,ZH OU Wei,XIE Pei2rong,LI Hua,G UO Bo(Institute of Immunology,Third M ilitary M edical University,Chongqing400038, China)
Abstract:Objective T o purify decay2accelerating factor(DAF)with biological activity from human erythrocyte membrane.Methods Hu2 man DAF was purified from human erythrocyte ghost by trypsin digestion,butanol extraction,quential chromatography on DE32and immunoaffinity chromatography.The purity of purified protein and its reactivity with antibody to human DAF was investigated by S DS2PAGE and Western blotting. The effects of purified DAF on asmble and decay of C3converta were als o tested.Re sults Approximately420μg purified DAF was obtained from400ml human whole blood with26%activity recovery and4.5×105units/mg specific activity.On S DS2PAGE,the purified protein showed a single band and gave an apparent Mt.about70×103.Western blotting showed that m onoclonal antibody to DAF could bind purified protein specifi2 cally and als o inhibit the asmble and accelerate the decay of classical pathway C3converta.Conclusion This method can be ud to purify DAF with biological activity from human erythrocyte membrane.
K ey w ords:decay2accelerating factor;is olation;C3converta
儿童急性荨麻疹
补体系统在抵抗外来微生物入侵方面发挥着重要作用[1]，但活化的补体系统也有可能导致自身组织细胞的损伤。为防止此种情况发生，与血清相接触的细胞表面通常表达有多种膜上补体调控蛋白。其中最重要的两个分子即是作用于C3/C5转化酶的促衰变加速因子(Decay2accelerating factor,DAF)和作用于攻膜复合物的C D59[2]。目前国外已构建表达人DAF分子的转基因猪作为异种器官移植的器官来源，并在动物实验中证实[3]，猪的器官表达人DAF分子后，超急性排斥反应的发生率明显降低。通过基因工程方法构建可溶性的DAF、含DAF的多种补体调控蛋白嵌合分子以及DAF的突变体也具有巨大的应用潜力。
为比较嵌合分子和DAF突变体比活性的差异，并深入了解DAF分子结构与功能之间的关系，必须获得天然DAF分子的纯品。为此，我们曾采用胰蛋白酶消化、正丁醇抽提以及离子交换层析与凝胶过滤层析相结合的方法，分离纯化人红细胞膜DAF。在获得抗人
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30080032)；重庆市科委重点攻关项目(2000)
作者简介：郑 萍(1962-)，女，四川省南充市人，高级实验师，主要从事补体生物学方面的研究。电话:(023)68752238
收稿日期:2002207201；修回日期:2002209216DAF的单抗后[4]，考虑到亲和层析在分辨率和回收率方面具有的独特优势，本研究又以抗人DAF单抗制备亲和层析柱，替代凝胶层析柱分离纯化人红细胞
膜DAF，获得了更理想的分离纯化效果。
1 材料和方法
沟通的重要性及意义111 主要试剂
健康人全血采自本校附属西南医院血站;P MSF购自E1Merck,TPCK处理的胰蛋白酶购自S igma公司。C NBr活化的Sepharo4B购于Phamacia公司。10000NMW L超滤离心管购于Millipore公司。豚鼠血清1∶30稀释于40mm ol/L E DT A2明胶2巴比妥缓冲液(E DT A2G VB)作为C32C9，以下称C2E DT A。
112 抗体
抗人DAF单抗DG9由本室制备和纯化[4]。鼠抗人血型糖蛋白A的单抗pep80由波兰科学院Duk教授惠赠。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(HRP2IgG)，购自中山生物制品有限公司。
113 亲和层析柱的制备
按产品说明书将纯化的DG9单抗30mg与3g C NBr活化的Sepharo4B偶联制备亲和层析柱。
114 人红细胞膜DAF的分离纯化
11411 红细胞膜影的制备 400ml人全血经P BS磷酸缓冲
6131第24卷第11期
2002年11月
第 三 军 医 大 学 学 报
ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE
Vol.24,N o.11
N ov.2002
盐溶液离心洗涤除去血浆及白细胞，加至10L膜影液中(5mm ol/L P B,pH715，含1mm ol/L E DT A,1mm ol/L P MSF),4℃搅拌过夜，以溶破红细胞。采用Pellicon超滤系统(Millipore)洗涤膜影并去除血红蛋白，最后浓缩至200ml。
11412 胰蛋白酶消化 参照文献[5]方法，膜影中加入胰蛋白酶于4℃消化过夜(胰蛋白酶与膜影蛋白的质量比为1∶20)，膜影液离心洗涤3次。
11413 正丁醇抽提 于消化的膜影中加入正丁醇至终体积为20%,4℃搅拌30min。10000×g离心30min。吸取水相部份，加入固体NaCl至终浓度为40mm ol/L，以T ris调节pH至810。重复抽提1次。
11414 离子交换层析柱色谱分离 50ml正丁醇抽提蛋白直接加至已充分平衡的DE32(1615cm×113cm)离子交换柱，封闭2h后，以200ml平衡液(20mm ol/L T ris2HCl;40mm ol/L NaCl; pH810)淋洗，除去未结合的蛋白质。接着进行线性梯度洗脱(40～420mm ol/L NaCl,20mm ol/L T ris2HCl,pH810)。流速1ml/ min。分部收集,015ml/管。逐管检测洗脱液中促衰变加速(Decay2accelerating,DA)活性、蛋白浓度及离子强度，并将具有DA活性的组份合并。
11415 亲和层析 合并后的样品于P BS中透析平衡除盐后，缓慢加至经充分平衡的亲和层析柱,4℃留存3h时。以P BS充分淋洗，在紫外检测仪监视下以3m ol/L K C NS洗脱，合并洗脱的蛋白峰，随即用10000NMW L超滤离心管更换缓冲液为P BS系统(0102m ol/L P B,pH710,0104m ol/L NaCl)。浓缩后测定蛋白浓度及DA活性。
115 DA活性检测
按文献[6]方法制备豚鼠血清功能C1、C2及含有人C4分子的溶血中间体E AC4。取最适用量的C1与E AC4共同孵育形成E AC14，随即加入最适用量C2孵育5min，以形成经典途径C3转化酶E AC4b2a。将倍比稀释的待检样品(75μl)与75μl的E AC4b2a(1×108/ml)于30℃继续孵育15min，加入150μl的C2 E
DT A，于37℃孵育60min，测定溶血率(Y)，并换算成每个细胞表面的C3转化酶平均有效溶血位点数(Z)，计算C3转化酶的衰变率。公式如下:
Z=-ln(1-Y)
0衰变百分率=(Z C-ZE)/Z C×100%
Z C：对照孔有效位点数;ZE：检测孔有效位点数
将导致30%衰变率所需的样品量定义为1个活性单位(U)。116 蛋白浓度测定
按常规Lowry法进行，以BS A为标准品。
117 S DS-PAGE及免疫印迹实验
按照文献[7]方法，采用Laemmli法，于10%的聚丙烯酰胺凝胶中进行S DS2PAGE。经S DS2PAGE电泳分离的人红细胞膜影及纯化蛋白转移至NC膜，封闭后，加入鼠抗人DAF单抗IC6培养上清(1∶1)，以鼠抗人血型糖蛋白A的单抗作为对照,37℃孵育1h。漂洗后，加入HRP2G AMIgG(1∶500),37℃继续孵育1h。最后以42氯212萘酚显色。
118 生物学活性检测
11811 纯化产物对C3转化酶组装的影响 将不同用量的纯化产物与E AC4于30℃孵育15min后，随即加入最适用量的豚鼠功能纯C1和C2，孵育5min，补加150μl的C2E DT A，于37℃孵育60min，测定每管溶血率(Y)，并换算成每个细胞表面的C3转化酶平均有效溶血位点数(Z)。以淋洗蛋白作为对照。11812 纯化产物对C3转化酶衰变率的影响 参照方法115制备经典途径C3转化酶E AC4b2a，然后加入不同用量的纯化产物于30℃继续孵育，分别于10、20、30、40和50min取出150μl，补加150μl的C2E DT A，于37℃孵育60min，测定每管溶血率(Y)，并换算成每个细胞表面的C3转化酶平均有效溶血位点数(Z)。以DG VB缓冲液作为对照。
2 结果
211 DAF的亲和层析纯化
人红细胞膜影经胰蛋白酶消化、正丁醇抽提，透析除去正丁醇，经DE32分离，见图1,DA活性峰位于蛋白峰的上升支。收集合并有活性的洗脱管，透析后直接上样到DG9-Sepharo4B亲和层析柱，结合，淋洗，再以3m ol/L的K C NS洗脱，结果形成两个蛋白峰，见图2。分别收集、超滤、更换为P BS缓冲液体系，测定其蛋白质浓度及DA活性，结果400ml全血可纯化产物约420μg,DA活性回收率达26%，见表1。而本实验室既往采用离子交换与凝胶过滤色谱分离方法,DA活性回收率仅为10.4%
。
图1 DE32分离纯化DAF
Fig1 Isolation and purification of DAF w ith DE
32
图2 D G9亲和层析柱纯化DAF
Fig2 Purification of DAF by D G92Seph aro4B column
表1 DAF分离纯化过程中比活性的改变
T ab1 Ch anges of specific activity during isolation of DAF
S tep
免费彩铃怎么弄T otal activity
(U)
Protein
(mg)
S pecific activity
mac删除软件(U/mg)
Purification
e fficiency
Activity
recovery(%) Butan ol extract713×1058988131100.0 DE32311×1058138274174215 DG92Sepharo4B119×1050142415×1055562610
7131
第11期 郑 萍，等.人红细胞膜DAF的亲和纯化及活性研究
212 纯化产物的鉴定
21211 纯化产物分子量和纯度鉴定 所得纯化产物样品经
S DS -P AG E 分离，在70×103
处可见单一蛋白条带，见图3
李白和杜甫合称什么。
1:Human rum;2:M t 1marker ;3:Erythrocyte gh ost ;4:Purified DAF
图3 SDS 2PAGE 鉴定DAF 纯度
Fig 3 Purity identify of DAF w ith SDS 2PAGE
213 纯化DAF 的抗原性鉴定
为确定洗脱液中DAF 的抗原特异性，将浓缩后的洗脱液经
S DS -P AG E 电泳后，转移至NC 膜，行免疫印迹实验。结果显示，纯化的DAF 可与抗人DAF 单抗IC6上清特异性在70×103处形成单一蛋白条带，而不与抗人血型糖蛋白A 单抗pep80反应，见图4。提示所得DAF 纯品中不含血型糖蛋白A ,S DS 2P AG E 实验中70×103蛋白条带为人的DAF 分子。此外，纯化DAF 可与3株针对不同SCR 的抗DAF 单抗反应，提示纯化DAF 具有天然分子的正确折叠构象(结果略)
。
1:Erythrocyte gh ost +IC6;2:Erythrocyte gh ost +pep80;3:Purified DAF +IC6;4:Purified DAF +pep80
图4 DAF 的免疫印迹分析
Fig 4 A nalysis of DAF w ith W estern blot
214 纯化产物的生物学活性鉴定
将纯化产物与溶血中间体E AC4共同孵育，然后加入C1和
C2体外组装C3转化酶，以观察纯化产物对C3转化酶组装的影响，结果发现，加入纯化产物后，红细胞表面形成的C3转化酶有效溶血位点数明显减少，且呈剂量效应关系，见图5。若先体外组装C3转化酶，然后与纯化产物混合，结果发现，与DG V B 对照
组相比，加入纯化产物后,C3转化酶的衰变过程明显加快，且随
着纯化产物用量的增加，促衰变效应越明显，见图6
。
图5 纯化DAF 对C3转化酶组装的影响
Fig 5 E ffects of purified DAF on the asmble of C3
converta
图6 纯化产物的促衰变活性
Fig 6 Decay 2accelerating activity of purified protein
3 讨论
由于亲和层析法具有较高的分辨率和蛋白活性回
收率，因而各实验室在获得抗原的单抗后，通常会建立抗原的亲和层析分离法，以简化抗原的分离纯化步骤并提高产率。但是，单纯依靠亲和层析一种方法，在大多数情况下很难获得高纯度的蛋白质，因而蛋白质的前期处理仍然是十分重要的。此外，在未经处理的蛋白质混和物中往往含有一些不可溶性的杂质及有机溶剂，会严重阻塞价格昂贵的亲和层析柱，缩短其使用寿命，因而必须加以避免。在DAF 的分离纯化中，如果以亲和层析柱替代离子交换柱和凝胶柱，正丁醇抽提液中含有的正丁醇及残留脂类就会使亲和层析柱在使用1～2次后即不可使用。有鉴于此，我们以亲和层析柱替代凝胶过滤柱，保留了离子交换柱高吸附容量与低成本的优势，同时克服了凝胶过滤柱中样品被极大稀释的缺点，取得较好的分离效果。400ml 人全血最终可得纯化DAF 约420μg ，回收率达26%，比活性达415×105U/mg ，高于我们曾采用的DE32与凝胶柱相结合的方法。对所得样品的纯度及免疫原性的鉴定结果表明，所得纯化产物在
8
131 第 三 军 医 大 学 学 报 第24卷
S DS2PAGE中表现为70×103的单一蛋白质条带，分子量与文献报道相符，且该条带可与抗人DAF的单抗特异性结合。在功能活性实验中，纯化产物既可抑制C3转化酶的组装，也可促进C3转化酶的衰变。上述结果表明，采用上述技术路线，可获得具有生物学活性的人红细胞膜DAF纯品。
由于亲和层析中的洗脱步骤是在非生理条件下进行，因而是影响靶蛋白回收率的关键环节。与单抗结合的抗原能否被洗脱，是否会在洗脱过程中失活，均因抗原抗体的不同而情况各异。在本实验中，我们先曾采用亲和层析中较普遍使用的pH218的甘氨酸2HCl洗脱液，结果洗脱液中回收的DA活性显著低于上样样品中的总活性，提示甘氨酸2HCl洗脱液不能将DAF有效洗脱或易导致DAF的失活。后换用3m ol/L K C NS，取得理想的洗脱效果。
烽火镇参考文献:
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1999.888-8971
(编辑 王 红)
文章编号:100025404(2002)1121319201个案与短篇畸形子宫妊娠10例临床分析
C linical analysis on10cas of pregnancy w ith deformity of uterus
王晓峰，夏华琼，吴国华 (重庆市涪陵中心医院妇产科，重庆408000)
畸形子宫临床上较常见，可分为双子宫、双角子宫、中隔子宫、单角子宫、残角子宫。畸形子宫妊娠在诊治中有一定困难，处理不当，可导致严重后果。现将我院近10年诊治的10例畸形子宫妊娠，并探讨误诊原因和并发症，报告如下。
1 临床资料
我院从1989-1999年共收治畸形子宫妊娠10例，年龄23～30岁，平均年龄2515岁。不全中隔子宫7例，完全中隔子宫1例，残角子宫2例。其中9例均有生产史，多次人流史,3例有引产史。4例行剖腹探查，其中2残为例角子宫妊娠(1例妊娠至42周),1例人流穿孔,1例多次人流失败。
2 讨论
2.1 误诊原因
本组10例病例术前均未能作出子宫畸形诊断，误诊原因如下:①未询问既往有无阴道、宫颈畸形病史，双子宫常合并阴道、宫颈畸形，如双阴道、阴道不全纵隔、双宫颈等。②宫腔操作时
作者简介：王晓峰(1955-)，女，重庆市涪陵区人，主治医师，主要从事妇产方面的研究。电话:(023)72223057
收稿日期:2002203211；修回日期:2002206230未仔细探查宫腔。③人流术后未仔细检查吸刮组织，如漂浮检查有无绒毛，或将刮出物送病理检查。④忽略相关检查，如怀疑畸形子宫，可经B超引导下探宫腔，必要时作宫腔镜、腹腔镜检查。
2.2 并发症
①人流漏吸;②人流子宫穿孔;③反复引产失败;④宫内死胎:⑤子宫内膜异位症;⑥早产;⑦子宫破裂。
总之，畸形子宫类型各异，合并妊娠后诊断常有困难，可造成处理失误，甚至严重并发症，诊断需结合病史、妇科检查、宫腔探查，以及B超检查，必要时可作宫腔镜、腹腔镜最后确诊。确诊后再做手术及处理，以免造成病人痛苦。
关键词：子宫/畸形；妊娠
中图法分类号:R714.422 文献标识码:B
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(编辑 张大春)
9131
第24卷第11期2002年11月
第 三 军 医 大 学 学 报
ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE
V ol.24,N o.11
N ov.2002
