文章编号:1007-8738(2003)04-400-04
TGF 2βR Ⅱ/Fc 融合蛋白的纯化及其生物学活性鉴定
李圣青1，李焕章1，杨乔欣2，倪殿涛1
(第四军医大学1西京医院呼吸内科,
2
基础部微生物学教研室，陕西西安710032)
收稿日期:2002-12-23; 修回日期:2003-03-27作者简介：李圣青(19702)，女，安徽芜湖人，博士生.
Tel.(029)3375237/3373682
Purif ication and characterization of the
f usion protein TGF 2βR Ⅱ/Fc
L I S heng 2qi ng 1,L I Huan 2z hang 1,Y ang Qiao 2xi n 2
,
N I Dian 2tao
1
1
Department of Respiration ,Xijing Hospital ,2Department of Mi 2crobiology ,Fourth Military Medical University ,Xi ’an 710032,China
Abstract
AIM :T o expre ss the fusion protein TGF 2βR Ⅱ/Fc in large
amounts by using recombinant Bac 2TR Ⅱbaculovirus expre ssion system constructed by our laboratory and to purify and charac 2
terize it.Then ,to verify whether the fusion protein TGF 2βR Ⅱ/
Fc can be able to block the biological activity of cytokine TGF 2
β1.METH ODS :The viral titer was determined by plaque form 2
ing te st.The recombinant baculovirus was amplified by in fecting sf9cells.The fusion protein was purified by FPLC using protein G column.The purified product was analyzed by SDS 2PAGE and the amount of target protein calculated by gray scanning.We st 2ern blot and sandwich E LISA were ud to affirm the expre ssion of the fusion protein.MTT colorimetry was ud to te st whether
the fusion protein can block the inhibition effect of cytokine TG F 2β1
on the growth of L929cells.I t was to verify whether the fusion protein can reduce the fibronectin production in L929cells ac 2
celerated by TGF 2β1by we stern blot.RESU LTS :The titer of
recombinant Bac 2TR Ⅱbaculavirus in the primary culture fluid was 2×1012pfu/L.A fter electrophore sis ,gray scanning analy 2sis showed that the target protein accounted for 10percent of the total protein.We stern blot analysis and sandwich E LISA de 2tection proved that the target protein has been expre sd.The fusion protein could block the inhibitive effect of cytokine TGF 2
β1on the growth of L929cells and fibronectin production in L929cells.CONC L USION :The fusion protein TGF 2βR Ⅱ/Fc can in 2hibit the biological activity of TGF 2β1in vitro.This study will be
helpful to the mass production of the fusion protein ,and will fa 2cilitate its further u in the therapy of pulmonary fibrosis.
K eyw ords :transforming growth factor 2beta ;pulmonary fibrosis ;
fusion protein
摘要
目的：用重组Bac 2TR Ⅱ杆状病毒表达系统大量表达融合蛋白TGF 2βR Ⅱ/Fc ，并对其进行纯化及鉴定；验证该融合蛋白是否能够阻断细胞因子TGF 2β1的生物学作用。方法：采用病毒空斑形成试验测定病毒滴度，并对其进行扩增。采用Pro 2
tein G 柱和快速蛋白质液相层析法(FPLC )纯化目的蛋白。采
用SDS 2PA GE 分析纯化后的目的蛋白，并将蛋白电泳条带进行灰度扫描，计算目的蛋白的含量。采用Western blot 和夹心
EL ISA 法，鉴定目的蛋白是否表达。采用M TT 比色法，验证
融合蛋白TGF 2βR Ⅱ/Fc 能否阻断TGF 2β1对小鼠肺成纤维细胞(L929)生长的作用。采用Western blot 技术，验证融合蛋白能否阻断TGF 2β1对L929细胞纤维黏连蛋白(FN )生成的促进作用。结果：本实验室构建并保存的重组Bac 2TR Ⅱ杆状病毒原液内病毒的滴度为2×1012pfu/L 。蛋白电泳后灰度扫描结果表明，目的蛋白约占总蛋白的10%。夹心EL ISA 法和Western blot 分析证明目的蛋白已表达。融合蛋白TGF 2βR Ⅱ/Fc 能够阻断TGF 2β1对L929细胞生长的抑制作用，以及对该细胞FN 生成的促进作用。结论：本室构建的重组Bac 2TR Ⅱ杆状病毒表达系统，能够表达融合蛋白TGF 2βR Ⅱ/Fc ，表达水平为9mg/L 。纯化得到的目的蛋白具有一定的生物学活性，可阻断TGF 2β1对L929细胞生长的抑制作用和对FN 生成的促进作用，为该蛋白的成批生产及在肺间质纤维化基因治疗中的应用奠定了基础。
关键词：转化生长因子2
β；肺间质纤维化；融合蛋白中图分类号:R563.19 文献标识码:A
肺间质纤维化是一种下呼吸道的慢性炎性改变，为临床常见病和多发病。病因已知的肺纤维化预后较好；而病因未知的肺纤维化如特发性肺纤维化(IPF )的预后极差。目前，针对肺纤维化的药物主要有两类：糖皮质激素类和免疫抑制剂类，二者对IPF 的疗效均有限。为适应临床需要，须探索新的治疗方法和途径[1]。转化生长因子2
β(TGF 2β)具有明确的促进肺间质纤维化的作用，是目前研究得比较透彻的一类细胞因子[2,3]。本实
验室已成功地构建了真核表达载体p Ig 2TR Ⅱ，即将TGF 2
βR ⅡcDNA 的胞膜外部分克隆入载体p Ig 。利用载体中人IgG 1的Fc 基因，形成融合基因TGF 2βR Ⅱ/Fc ，并在CHO 细胞中成功地以分泌形式表达[4]。由于该真核表
达载体p Ig 2TR Ⅱ表达量较低，为获得高表达量的融合蛋白，本室又构建了重组Bac 2TR Ⅱ杆状病毒表达系统。通过免疫荧光染色证明，感染重组Bac 2TR Ⅱ杆状病毒的sf9细胞内有融
合蛋白TGF2βRⅡ/Fc的表达，并获得该重组杆状病毒的原液[5]。本研究旨在测定该病毒原液中病毒的滴度，进而扩增病毒；再利用该重组病毒大量感染sf9细胞，收集sf9细胞培养上清液通过Protein G柱以FPLC法纯化目的蛋白。蛋白电泳后，通过灰度扫描测定目的蛋白的含量，并采用Western blot和夹心EL ISA法证明，该融合蛋白可阻断TGF2β1的生物学活性。
1 材料和方法
1.1 材料 TC2100培养基购自GIBICOL BRL公司。sf9细胞为本校微生物学教研室保存。FPLC法蛋白纯化采用的机型为Amersham Pharmacia Biotech,A KTA FPLC U PC900，层析柱为Hi Trap TM Protein G，购自Amersham Pharmacia Biotech AB公司。Western blot中所用抗体均购自博士德公司。野生型杆状病毒(AcNPV)购自Clotech公司。人PTA1/Fc融合蛋白为本校免疫学教研室惠赠。M TT
和分子量蛋白marker均购自华美公司。细胞因子TGF2β1购自基因公司。抗TGF2β1抗体购自R&D Systems公司。
1.2 方法
1.2.1 空斑试验 将sf9细胞接种于6孔板内培养直至全部铺满。将重组Bac2TRⅡ杆状病毒原液按1×10-4～1×10-12的稀释度，以TC2100不完全培养基稀释。弃去6孔板内的sf9细胞培养上清，分别覆盖100μL不同稀释度的病毒稀释液，于27℃孵箱内吸附1h后弃去上清液。在灭菌琼脂糖内，加入等体积预热的TC2100完全培养基，混匀后，取1.5mL 沿6孔板内壁轻轻加入。待琼脂糖凝固后，置湿化的27℃孵箱中培养4d，加入1mL中性红(1g/L)染色，于27℃孵育3h后，吸去多余的染色液，将6孔板倒置于27℃孵箱内过夜。次日进行空斑计数，计算病毒的滴度。pfu/mL=稀释度的倒数×空斑计数×每孔病毒mL数的倒数。
1.2.2 病毒的扩增 扩增毒株时，以MOI值为0.01～0.1感染单层培养的sf9细胞，用下面的公式计算病毒原液的需要量：病毒原液需要量(mL)=待用的MOI值×待感染的细胞总数/待用病毒的滴度。感染后48h收集病毒，病毒约可扩增100倍。
1.2.3 目的蛋白的FP LC法纯化 程序选择：流速1m L/min，洗脱体积5m L，平衡体积5m L，再平衡体积5m L，上样体积10m L。采用紫外分光光度计测定纯化蛋白的含量，按下面公式计算蛋白浓度：
蛋白浓度(mg/m L)=A280×1.452A260×0.74。1.2.4 纯化蛋白的SDS2PA GE和Western blot鉴定 首先作纯化蛋白的SDS2PA GE，再将蛋白转移至NC膜上进行Western blot。一抗为兔抗人TGF2βRⅡIgG，二抗为羊抗兔IgG2HRP，用DAB显色。以AcNPV病毒感染的sf9细胞上清纯化液和正常培养的sf9细胞上清纯化液作为阴性对照。。由于培养sf9细胞使用的是含100mL/L胎牛血清的TC2100完全培养基，胎牛血清中含有免疫球蛋白成分，在用protein G 层析柱进行FPLC纯化sf9细胞培养上清中的目的蛋白时，收集到的目的蛋白中会有免疫球蛋白的污染，因此，蛋白电泳后须做灰度扫描，以确定融合蛋白的含量。
1.2.5 TGF2βRⅡ/Fc融合蛋白表达的检测 采用夹心EL ISA。用1mg/L的兔抗人TGF2βRⅡIgG包被。实验孔加入重组Bac2TRⅡ杆状病毒感染的sf9细胞培养上清。以TC2 100完全培养基为空白对照孔，以人PTA1/Fc融合蛋白为阴性对照。二抗为HRP标记的羊抗人IgG Fc片段,OPD显色。在EL ISA检测仪上，于490nm处，以空白对照孔调零后，测定各孔的A值。若大于阴性对照A值的2.1倍以上即为阳性。
1.2.6 M TT实验 按1×103个细胞密度将L929细胞在96孔板内传代培养。除阴性对照组不加任何试剂外,TGF2β1组分别加入1.25μg/L～0.01μg/L倍比稀释的TGF2β1，共8个孔。TGF2β1+TGF2βRⅡ/Fc组，每孔需另加入1.25mg/L的TGF2βRⅡ/Fc;TGF2β1+抗体组，每孔需另加入1.25mg/L 的抗TGF2β1IgG。于37℃、50mL/L CO2孵箱培养3d，每孔加入5g/L的M TT20μL，用EL ISA检测490nm
处的A值。
1.2.7 纤维黏连蛋白的检测 按1×105/L细胞密度将L929细胞在25cm2细胞培养瓶内传代培养，使细胞铺满瓶底。除阴性对照组不加任何试剂外,TGF2β1组加入1μg/L的TGF2β1, TGF2β1+TGF2βRⅡ/Fc组另加10mg/L的TGF2βRⅡ/Fc。在37℃、50mL/L CO2孵箱培养2d。取细胞培养上清，进行Western blot检测纤维黏连蛋白(FN)的表达[6]。样品内加入等体积的2×SDS还原型加样缓冲液，于沸水浴中加热5min 后上样。电泳后将蛋白转膜并染色，一抗为兔抗小鼠FN抗体，二抗为羊抗兔IgG2HRP，用DAB显色。
2 结果
2.1 病毒滴度测定及扩增 采用空斑计数法测定病毒原液的滴度为2×1012pfu/L。将病毒原液稀释至1×109pfu/L，以MOI值0.1感染一定数量的sf9细胞。感染48h后收集病毒上清，该病毒上清液约扩增为1×1011pfu/L。
2.2 目的蛋白的FPLC法纯化 采用MOI值5，大量感染sf9细胞,72h后收集细胞培养液约40mL，经FPLC法纯化。经紫外分光光度计法定量为9.1mg，即每100mL细胞培养液中可纯化到9.1mg的目的蛋白。
2.3 蛋白电泳结果及灰度扫描结果 蛋白电泳结果如图1所示，还原型融合蛋白M r为65000。灰度扫描表明其约占纯化后总蛋白量的10%(图2)。另外两条带分别是胎牛IgG 的重链和轻链。因此，每100mL细胞培养上清内可获得融合蛋白0.9mg。对照分别为经纯化和未纯化的正常sf9细胞培养上清和AcNPV感染上清
。
图1 融合蛋白TGF2βRⅡ/Fc的SDS2PA GE分析
Fig1 SDS2PA GE analysis of the fusion protein TGF2βRⅡ/Fc 1:Unpurified culture supernatant of normal sf9cells;2:Unpurified culture supernatant of sf9cells infected with AcNPV;3:Purified culture super2 natant of normal sf9cells;4:Purified culture supernatant of sf9cells in2 fected with AcNPV;5:Purified culture supernatant of sf9cells infected with recombinant Bac2TRⅡbaculovirus;6:Protein marker.
小白鹭
2.4 纯化蛋白的Western blot 分析 如图3所示，仅纯化的
重组Bac 2TR Ⅱ杆状病毒感染上清染色后有目的条带；纯化的正常sf9细胞培养上清及纯化的AcNPV 病毒感染上清染色后均呈阴性
。
恋父情结
图2 SDS 2PA GE 后纯化蛋白的灰度扫描
Fig 2 Gray scanning of the purified proteins after SDS 2PA
GE
图3 纯化目的蛋白的Western blot 分析
Fig 3 Analysis of purified target protein by Western blot
1:Protein marker ;2:Purified culture supernatant of normal sf9cells ;3:Purified culture supernatant of sf9cells infected with recombinant Bac 2TR Ⅱbaculovirus ;4:Purified culture supernatant of sf9cells infected with AcNPV.
2.5 融合蛋白TG F 2βR Ⅱ/F c 表达的鉴定 夹心E L ISA 法结果显示重组Bac 2TR Ⅱ杆状病毒感染上清组A 值为1.08±0.02；人
PTA1/Fc 组A 值为0.42±0.03。实验证明，该融合蛋白是
以分泌形式表达，且融合蛋白的2个功能区域能够分别被抗TGF 2βR Ⅱ和抗hIgG 1Fc 段抗体所识别，表明融合表达载体的构建是成功的。
2.6 TG F 2βR Ⅱ/Fc 对TG F 2β1效应的阻断作用 TGF 2β虽然在体内可促进许多种成纤维细胞的生长，但在体外单层培养的情况下，一般是抑制它们的生长[6]。M TT 比色法证明，在体外单层培养的情况下,TGF 2β1可抑制L929细胞生长；而在加入TGF 2βR Ⅱ/Fc 和抗TGF 2β1抗体时，这种抑制作用消失(图4)。
2.7 TG F 2βR Ⅱ/Fc 对FN 生成的阻断作用 纤维黏连蛋白是一种α2球蛋白,M r 约为440000，由1条
稍长的α链
(220000～235000)和1条β链(210000～215000)通过C 端
两对二硫键相连而成。实验证明,TGF 2
β可促进L929细胞生成FN ；而在加入TGF 2βR Ⅱ/Fc 时,FN 的生成明显减少
(图5)
。
图4 融合蛋白TGF 2βR Ⅱ/Fc 对TGF 2β1生物学效应的阻断
作用
Fig 4 Counteraction to the biological activities of TGF 2β1by the
fusion protein
Group A :TGF 2β1alone ;Group B :TGF 2β1and TGF 2βR Ⅱ/Fc ;Group C :TGF 2β1and anti 2TGF 2β1
IgG.
图5 TGF 2βR Ⅱ/Fc 对TGF 2β1促进L929细胞生成FN 的抑
制作用运动中枢
Fig 5 Inhibitory effect of TGF 2βR Ⅱ/Fc on FN production in
L929cells accelerated by TGF 2β1
1:Protein marker ;2:Culture supernatant of normal L929cells ;3:Culture
supernatant of L929cells treated with TGF 2β1;4:Culture supernatant of L929cells treated with TGF 2β1and TGF 2βR Ⅱ/Fc.
3 讨论
由于sf9细胞是用TC 2100完全培养基而培养的，采用
protein G 层析柱以FPLC 纯化时，目的蛋白中必然有胎牛血
清的污染。若要避免污染，可将sf9细胞用无血清培养基培养，这样便有利于TGF 2βR Ⅱ/Fc 融合蛋白的纯化。TGF 2βR Ⅱ/Fc 为糖基化蛋白，由Fc 片段内绞链区的半胱氨酸形成链间二硫键结构，因而该融合蛋白以二聚体形式存在，大大增强了其与TGF 2
β的结合力[7]。带有hIgG 1Fc 尾的融合蛋白在实验中有许多优点：如可方便地通过protein A 或protein
G 纯化；用抗人Fc 片段抗体标记物可识别融合蛋白的Fc 片
段，从而可鉴定融合蛋白识别的组织和细胞。另外，目前已有大量商品化的与人IgG Fc 片段相配套的二抗可供选择；融合蛋白中的Fc 片段可使目的蛋白易于进行同位素标记及酶标记；带Fc 片段的融合蛋白的表达量要明显高于单独的目的蛋白。采用瞬时转染的方法，利用p Ig 载体表达融合蛋白的产量约为1mg/L [8]；而采用重组Bac 2TR Ⅱ杆状病毒表达系统，融合蛋白的产量约为9mg/L 。因此，杆状病毒表达系统的效率，要明显高于质粒瞬时真核转染的表达效率。纯化的目的蛋白用Western blot 和夹心E L ISA 法鉴定证明，表达产物
(下转第405页)
3 讨论
NAP2含有302个氨基酸残基，通过结构预测分析已知其具有7次跨膜结构，故推测它属于G蛋白偶联
受体家族的成员。已知多种趋化因子受体属于G蛋白偶联受体。到目前为止,NAP2的配体尚属未知，其作用及作用机制目前也不清楚。我们发现,NAP2可调控转录因子NF2κB的活性，激活IL212启动子，并诱导IL212合成。NAP2激活NF2κB转录因子启动子和IL212启动子的功能，均可被IκBαDN所抑制。NAP2稳定表达的J774细胞中,NF2κB的活性也高于对照组。根据本实验的结果推测,NAP2可诱导IL212合成，而且IL2 12的合成又受NF2κB转录因子的调控。
尽管NF2κB转录因子启动子区和IL212启动子区的基因序列具有同源性[3]，但NAP2激活IL212启动子却有特异性，而用其它同样具有NF2κB启动子基因同源序列的启动子(IL212)的荧光素酶实验，并未观察到此启动子可被NAP2激活的现象。当NF2κB被激活时，起抑制作用的IκBα便被磷酸化并降解，游离的NF2κB二聚体即移位入细胞核内，作用于相应基因的启动区。IκBαDN可抑制IκBα的降解，故可阻断NF2κB的激活。本研究发现，当有IκBαDN存在时,NAP2激活IL212启动子的能力降低，说明NAP2是通过NF2κB转录因子来调控IL212的合成及分泌的，这一发现，为进一步研究NAP2的功能及作用机制奠定了基础。许多炎性刺激因子, (细菌，病毒等)可通过Toll样受体激活NF2κB，启动巨噬细胞中IL212的合成及分泌[4,5]。NAP2是否可通过参与这一经典途径?还需进一步证实。由于NF2κB信号转导途径和经典的Toll样受体转导途经之间存在交叉调控[6]，因而NAP2也有可能通过NF2κB上游信号转导途径发挥作用。至于NAP2这一G蛋白偶联受体通过什么上游信号转导途径介导NF2κB 的活化?仍需要进一步的研究。
I L212在辅助性T细胞的分化成熟中发挥着重要作用，并参与炎性反应[1]。同时有证据表明，其参与感染性肠炎的病理过程[2]。本研究证明,NAP2在巨噬细胞中可诱导I L212的合成，提示其有可能成为今后治疗炎性反应性疾病的靶分子。
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(上接第402页)转笔怎么转
具有相应的生物学活性。肺间质纤维化的特点之一，就是肺成纤维细胞的大量增生和细胞外基质的堆积，后者包括Ⅰ型胶原和FN等大分子糖蛋白的生成增加[9]。本实验在细胞水平证明，融合蛋白TGF2βRⅡ/Fc能够阻断TGF2β1对L929细胞生长的抑制作用，以及TGF2β1对L929细胞FN生成的促进作用，为肺间质纤维化的基因治疗提供了一定的实验依据。
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