2020年12月
农业机械学报第51卷第12期doi：10.6041/j.issn.1000-1298.2020.12.038
SPI凝胶颗粒制备及其Pickering高内相乳液特性研究
江连洲温家煜王禹涵罗小雪姜思岐隋晓楠
（东北农业大学食品学院，哈尔滨150030）
摘要：制备了大豆分离蛋白（Soy protein isolate,SPI）凝胶颗粒，并使用该颗粒制备了稳定的Pickering高内相乳液。
通过粒径和灼-电位测定、冷冻扫描电镜和光学显微镜观察以及外观分析，以流变特性为指标，对SPI凝胶颗粒和Pickering高内相乳液特性进行研究。结果表明，SPI凝胶颗粒的粒径和灼-电位随pH值的变化而变化，当SPI凝胶颗粒pH值为4.0~5.0时，临近SPI等电点，灼-电位的绝对值最小，此时凝胶颗粒相互聚集，不能成功制备稳定的高内相乳液。在pH值为9.0时，大豆分离蛋白凝胶颗粒紧密结合在一起，呈凝胶网络状结构。在碱性条件下，蛋白质质量分数为1.00%、内相体积分数为78%~82%时，可以制备稳定的Pickering高内相乳液。通过增加内相体积分数，使大豆分离蛋白凝胶颗粒稳定的Pickering乳液体系分布更加均匀，不易发生聚集，形成更加致密稳定的多孔结构，且具有更强的弹性凝胶乳液特性。-
关键词：大豆分离蛋白；Pickering高内相乳液；凝胶颗粒
中图分类号：TS214.9文献标识码：A文章编号：1000-1298（2020）12434848OSID：鱼Fabrication and Characterization of High Internal Pha Pickering Emulsion Manipulated by Gel Particles of Soy Protein
JIANG Lianzhou WEN Jiayu WANG Yuhan LUO Xiaoxue JIANG Siqi SUI Xiaonan
(College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin150030,China) Abstract:High internal pha Pickering emulsions stabilized by food-grade particles have received much attention in recent years.However，the stabilizing mechanism in the continuous pha of high internal pha Pickering emulsions stabilized by proteins is not well understood.Soy protein isolate(SPI)gel particles were constructed and ud to stable high internal pha Pickering emulsion.The SPI gel particles and high internal pha Pickering emulsion were studied with particle size，灼-potential,cryoscanning electron microscopy，optical microscope obrvation，analysis of formation characterization and rheological properties of the emulsions.The results showed that the SPI particle size and灼-potential of gel particles were varied along with the change of pH value.When the pH value of SPI gel particles was
4.0~
5.0,it was near protein isoelectric point,the absolute value of灼-potential was the minimum,and
particles were gathered at this time.It cannot be successful preparation of stable high internal pha emulsion.At pH value9.0，the SPI particles were tightly bound together in a gel network structure.
Under alkaline conditions，high internal pha Pickering emulsion can be stabled with the soy protein concentration of1.00%and the internal pha volume fraction in78%〜82%.By increasing the volume fraction of the internal pha，the Pickering emulsion system stabilized by SPI gel particles was more evenly distributed and less prone to aggregation，forming a finer and denr porous structure to make it more stable.And it had stronger properties of elastic gel emulsion.
Key words:soy protein isolate(SPI)；high internal pha Pickering emulsion；gel particles
束缚读音0引言
Pickering高内相乳液是一种利用水和油部分润湿的固体颗粒充当稳定剂、内相体积分数在74%以上的乳液。与传统的通过大量小分子表面活性剂稳定的高内相乳液相比，通过固体颗粒稳定的
收稿日期：20200901修回日期：20201017
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31671807）
作者简介：江连洲（1960—），男，教授，博士，主要从事粮食、油脂及植物蛋白工程研究，E-mail：***************
第12期江连洲等：SPI凝胶颗粒制备及其Pickering高内相乳液特性研究349
Pickering高内相乳液具有乳化剂用量少、稳定性好、生物相容性好、可塑性强等优势［1］。高内相乳液具有内相比例大、稳定性极佳、模版材料空隙均匀等特性，目前已被应用于食品药品加工［:］，生物组织工程⑶、化妆品［4］等多种领域中。Pickering高内相乳液的颗粒稳定剂包括改性二氧化硅［5］、二氧化钛凝胶颗粒［6］、羟磷灰石［7］，吐温80［8］和微凝胶颗粒⑼等，这些无机材料和化学合成的颗粒在生物安全性、生物相容性和生物降解性等方面具有毒性风险，极大地限制了Pickering高内相乳液在食品医药领域的应用。
大豆分离蛋白（Soy protein isolate，SPI）中蛋白质质量分数在90%以上，氨基酸种类有近20种，并含有人体所必需的氨基酸，具有凝胶性、吸水性、乳化性、起泡性等多种功能性质［10］。在受热时，由于球蛋白自身结构的改变，使埋藏在蛋白分子内的疏水基团暴露出来，可以形成自组装的凝胶颗粒聚集体。由于SPI凝胶颗粒具有亲水亲油性，已被广泛用作各种乳液的稳定剂［11］。
近年来，随着人们对低反式脂肪酸食品的关注，有关采用天然材料稳定的Pickering高内相乳液方面的研究迅速增多。文献［2］研究发现，小麦淀粉稳定的高内相乳液在成为蛋黄酱替代物方面有巨大潜力。文献［12］使用乳清蛋白微凝胶制备的高内相乳液在4益下储存6个月仍能显示出优异的稳定性，但该研究使用的颗粒需要进行化学改性，以提升界面稳定性。文献［13］用己烷作内相，成功制备了由麦醇溶蛋白壳聚糖复合颗粒作为稳定剂、内相体 积分数可高达90%的高内相乳液。此外，许多研究发现，一些食品级颗粒可以成功制备Pickering高内相乳液，如乳清蛋白微凝胶［14］、纤维素凝胶颗粒［15］，淀粉凝胶晶体［16］和花生蛋白微凝胶颗粒［17］等，但这些稳定剂大多需要酸化、糖基化等复杂且费时的修饰，或在制备过程中仍需使用一些有机溶剂（如丙酮等）。因此，繁琐的制备过程和化学材料的残留等问题仍限制了Pickering高内相乳液在食品行业中的应用。
本文主要研究SPI凝胶颗粒在制备Pickering高内相乳液中的作用，以期为食品工业提供一种制备方法更便捷、材料更安全的稳定剂。
1材料与方法
1.1材料与试剂
大豆粉，哈尔滨高新技术有限公司；葵花籽油（市售）；正己烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、邻苯二甲醛（OPA），盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、去离子水等，北京新光化工试剂厂；其他
试剂均为分析纯。
1.2仪器与设备
CJJ6型磁力搅拌器，上海仪电科学仪器股份有限公司；GL25MS型高速冷冻离心机，宁波Scientz生物技术有限公司；PHS25型数显台式酸度计，上海雷磁公司;HH6型数显恒温水浴锅，金坛市富华仪器有限公司；Scientz18N型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司;2500C型高速研磨机，永康市艾泽拉电器有限公司；T10Ultra Turrax型均质器，德国IKA公司；NANO ZS90型粒度与电位分析仪，英国马尔文仪器有限公司；F 4500型荧光分光光度计，日本日立公司；BX53型科研正置光学显微镜，日本奥林巴斯有限公司; Quorum PP310T型低温冷冻系统、Hitachi S 3400N型扫描电子显微镜，荷兰皇家飞利浦公司；MCR302型流变仪，奥地利安东帕公司。
1.3方法
1.3.1SPI的制备
参照文献［18］的制备方法。将大豆粉首先在45益溶于正己烷（液料比3mL/g）脱脂2ho将脱脂的大豆粉晾干后溶于去离子水中（液料比15mL/g）萃取2h，用1mol/L NaOH将pH值调节至&5并搅拌2ho然后将混合物在9000g,4益下离心20min 以除去不溶物，并用1mol/L HCl将上清液pH值调节至4.5后静
置30min，然后将上清液在6000g, 4益下离心20min。收集沉淀物，随后用0.1mol/L HCl将pH值调节至7.0o将沉淀物冷冻干燥后，获得干基蛋白质质量分数为90.2%的大豆分离蛋白。
1.3.2SPI凝胶颗粒的制备
将冷冻干燥的SPI粉末溶解于去离子水（液料比20mL/g）中，并搅拌2ho然后将悬浮液在4益下储存12h，以使蛋白质完全水化。使用0.01mol/L HCl或NaOH将悬浮液的pH值调节至7.0，并在80益的水浴中缓慢搅拌30min。然后将悬浮液自然冷却至室温（20益）即形成由SPI自组装的凝胶颗粒凝胶。用T10-Ultra Turrax型均质器以10000r/min 的速度破碎凝胶3min，使凝胶颗粒分散得更加均匀。
1.3.3SPI凝胶颗粒的粒径和灼-电位
利用NANO ZS90型粒度与电位分析仪对所有样品进行粒径分布和灼-电位测定，参照文献［19］的方法稍加修改。为了研究pH值（3.0~10.0）对SPI 凝胶颗粒的粒径和灼-电位的影响，并避免多个凝胶颗粒的相聚集影响测量，将样品用不同pH值的0.01mol/L缓冲溶液稀释100倍后测量粒径，稀释
350农业机械学报2020年
1000倍后测量电位。
1.3.4SPI凝胶颗粒表面疏水性分析
表面疏水性指数H。根据文献［20］的方法稍加修改，使用ANS荧光探针测定蛋白质的表面疏水性。将不同pH值的SPI凝胶颗粒用0.01mol/L磷酸缓冲溶液稀释样品，使最终质量浓度为0.04〜0.2mg/mL；同时使用pH值7.0的磷酸缓冲溶液配制ANS储备液(8.0mmol/L)。取4mL各稀释样品加入15滋L ANS溶液，振荡混合均匀后静置10min，使用荧光光度计在激发波长为370nm、发射波长为470nm下测量混合物的荧光强度。以荧光强度对蛋白质质量浓度(mg/mL)的初始斜率(通过线性回归分析计算)制图用作表面疏水性指数计算。
1.3.5SPI凝胶颗粒微观结构观察
参照文献［21］的方法并稍作修改。使用Hitachi S3400N型扫描电子显微镜对SPI凝胶颗粒进行微观观察。将一滴SPI凝胶颗粒样品置于载物台上，并用液氮冷冻。随后在真空条件下，将样品转移至-160益的制备室(Quorum PP310T型低温冷冻电镜制备系统)中，并用刀片横切样品。然后将样品在-100益下升华15min。最后，将样品表面喷涂上金，并转移至扫描电子显微镜的冷冻室内拍摄图像，冷冻室温度控制在-140益。
1.3.6Pickering高内相乳液的制备
将新鲜制备的SPI凝胶颗粒分散在去离子水中，使分散液中蛋白质质量分数为1.00%。通过滴加0.01mol/L HCl或NaOH将分散液的pH值分别调节至4.5,7.0和9.0。然后使用T10Ultra Turrax型均质器
以10000r/min对SPI凝胶颗粒分散液均质1min。
为了研究乳液形成时的内相体积分数对乳液结构的影响，在上述SPI凝胶颗粒分散液中滴加体积分数为10%、30%、50%、70%、78%、80%、82%的葵花籽油，用T10-Ultra Turrax型均质器于6000r/min均质2min，形成乳液，当内相体积分数大于74%时，形成Pickering高内相乳液。
1.3.7Pickering高内相乳液微观观察
使用光学显微镜观察乳液的微观结构。将一滴乳液和Pickering高内相乳液放入显微镜载玻片上，小心地使用盖玻片固定并确保内部没有气泡。图像以40倍放大率拍摄。
砚的读音参照文献［19］的方法并稍作修改。使用冷冻扫描电子显微镜对Pickering高内相乳液进行观察。将一滴乳液样品置于载物台上，并用液氮冷冻。随后在真空条件下，将样品转移至-95益的制备室中，并用刀片横切样品。然后将样品在-100益下升华15min。最后，将样品表面喷涂上金，并转移至扫描电子显微镜的冷冻室内拍摄图像，冷冻室温度控制在-170益。
什么然有什么
1.3.8Pickering高内相乳液流变测量
参照文献［2］的方法，使用旋转黏度计测量乳液的流变行为，在25益下椎板之间的间隙设置为0.80mm。在扫频模式下，设定恒定应变为0.5%，在0.1〜10Hz频率下测量Pickering高内相乳液的弹
性模量和黏性模量。
1.4数据统计分析
所有测量至少进行3次，结果表示为平均值土标准差。利用SPSS Statistics24软件对数据进行ANOVA和Duncan检验(p<0.05)统计分析。
2结果与分析
2.1SPI凝胶颗粒粒径分析
如图1所示，在pH值为4.0和5.0时,0.01%的SPI凝胶颗粒分散液为不稳定的悬浮液，形成了肉眼可见的聚集体，所以不能通过NANO ZS90型粒度与电位分析仪准确测量该pH值条件下SPI凝胶颗粒的平均粒径，测得其聚集体的粒径为3443.0〜4502.0nm。SPI凝胶颗粒平均粒径随pH值的变化差异显著(p<0.05)。当pH值为3.0时，平均粒径为258.6nm。当pH值在6.0〜10.0时，SPI 凝胶颗粒粒径依次为170.7,248.8、268.5、302.7、305.2nm，呈逐渐升高趋势，但整体变化并不明显。该粒径范围与其他作为高内相乳液稳定剂的蛋白颗粒大小研究结果相似，如文献［22］发现明胶颗粒的平均粒径为235.9nm，文献［17］发现花生蛋白颗粒的粒径为40〜150nm。在碱性条件下,SPI凝胶颗粒粒径较大。因为该颗粒是一种微凝胶颗粒，具有一定程度的吸水和溶胀能力［23］，所以粒径的轻微增加应
为SPI颗粒的吸水性引起的，而非颗粒间聚集。本试验中的SPI凝胶颗粒平均粒径大于文献［24］报道的大豆蛋白凝胶的流体动力学直径(141.0〜158.0nm)。该差异是由于本试验制备SPI凝胶颗粒时蛋白质质量分数(5%)较高，是文献［24］的2倍。蛋白质浓度对热诱导蛋白质聚集产生自组装凝胶颗粒有着重要影响［25］O在较低的蛋白质浓度下，球状蛋白质之间的热诱导相互作用往往发生在分子内而不是分子间。随着蛋白质浓度的增加，SPI形成分子间相互作用，并最终形成蛋白质凝胶。所以蛋白浓度对其形成的热凝胶颗粒粒径存在一定影响。2.2SPI凝胶颗粒灼-电位分析
SPI凝胶颗粒灼-电位随pH值变化。在pH值低于5.0时观察到SPI凝胶颗粒呈现正电性(pH 值为
第12期江连洲等：SPI凝胶颗粒制备及其Pickering高内相乳液特性研究351
3.0时灼-电位为22.32mV,pH值为
4.0时灼-电位为9.33mV），这是因为SPI颗粒表面引入带正电的氨基。当pH值超过
5.0时，由于羧基的去质子作用，SPI凝胶颗粒趋于带负电，在pH值为5.0~10.0时，灼-电位依次为-3.17、-20.00,-28.25, -24.20、-2
6.94、-30.83mV，在pH值为
橙子简笔画
7.0~ 10.0时变化并不明显。本研究中观察到SPI凝胶颗粒的灼-电位随pH值变化的趋势与文献［26］的结果相似。SPI凝胶颗粒对pH值变化非常敏感，当灼-电位绝对值较小时，凝胶颗粒表面所带的同性电荷较少，减小了静电排斥作用。进而降低了分散液稳定性，使体系中蛋白分子倾向于相互聚集，这与图1和粒径变化中观察到的结果一致。当SPI凝胶颗粒的灼-电位趋近于零时,pH值约为4.5，与SPI的等电点（pH值为4.5）相近，因此SPI凝胶颗粒的制备工艺对SPI的等电点几乎没有影响。当pH值大于5.0时,SPI凝胶颗粒灼-电位的绝对值逐渐增大，并在碱性条件下逐渐趋于稳定。因为在碱性条件下SPI凝胶颗粒表面同性电荷增多，同性电荷间的相互排斥使蛋白质溶液更稳定，减弱了蛋白颗粒分子间的相互作用，促进SPI凝胶颗粒作为Pickering高内相乳液的稳定剂。
2.3SPI凝胶颗粒表面疏水性分析
蛋白质的表面疏水性指数H。是影响蛋白颗粒表面相关功能的重要参数。在pH值为3.0~6.0时, SPI颗粒表面疏水性指数很高，依次为15762.00、16768.40,10183.00,4409.80,H0在等电点附近（pH值为4.0~5.0时）出现最大值。由图1和表面疏水性指数H对比可知,spi蛋白凝胶颗粒的表面疏水性与溶解度呈负相关。蛋白质的溶解度取决于蛋白质分子的亲/疏水平衡，这种平衡主要取决于暴露于蛋白质分子表面的氨基酸组成。在氨基酸侧链残基中，疏水性残基通过疏水键于蛋白质分子中心相互结合，形成疏水区域；而亲水性残基排列于能够与水分子接触的蛋白质分子外侧，形成亲水区域［:7］。当pH值从7.0增加到10.0时,SPI凝胶颗粒的疏水性维持在较低水平,H0依次为1541.26, 697.56,831.00,673.90，
且pH值在8.0~10.0间SPI颗粒的表面疏水性指数相差较小，表明蛋白质倾向于折叠，这导致疏水残基被掩埋，阻止了蛋白质颗粒疏水区的暴露，从而抑制了SPI凝胶颗粒的疏水性。文献［28］研究发现，肉类蛋白热凝胶颗粒在不同pH值下的疏水性趋势与本文结果一致。文献［29］的研究表明在中性pH值下SPI的表面疏水性指数为55.32o与其相比，本研究的SPI凝胶颗粒的H。明显高于其他研究。其原因可能为热处理诱导SPI折叠，导致更多疏水性基团迁移到分子外部。因此，疏水相互作用和电荷间排斥作用可能是蛋白质粒子排列形态不同的原因［30］。
2.4SPI凝胶颗粒微观结构分析
可通过冷冻扫描电子显微镜观察SPI凝胶颗粒在不同pH值下的微观结构。本研究选取3个具有代表性的pH值，即等电点（pH值为4.5），中性点（pH值为7.0）和中等碱性点（pH值为9.0）进行pH值对SPI凝胶颗粒微观结构影响的分析。如图2所示，可以观察到单个的SPI凝胶颗粒均具有球形外观，直径为70~250nm。在不同的pH值条件下，SPI凝胶颗粒处于不同的聚集状态。当pH值为4.5时，由于此时处于等电点，SPI凝胶颗粒间静电斥力降低，具有较强的范德华力［:1］，因此颗粒形成了较大的圆形聚集体。当pH值为7.0时，颗粒以条带型相联，形成一些椭圆形的聚集体。当pH值为9.0时，几乎所有颗粒都被交联且紧密融合在一起，形成较为均一的微凝胶网络状结构。SPI
凝胶颗粒融合
352农业机械学报2020年
无人机拍照(a)pH値为4.5(b)pH值为7.0(c)pH值为9.0
图2大豆分离蛋白凝胶颗粒冷冻扫描电镜图像
Fig.2Cryo-scanning electron microscopy analysis of soybean protein isolate gel particles
的凝胶网络状结构可以共同作用于水/油界面，对
Pickering高内相乳液进行稳定。
2.5Pickering高内相乳液外观观察
由图3可以看出，不同pH值条件下得到的SPI
凝胶颗粒制备的Pickering高内相乳液具有不同的
状态。当pH值为4.5和7.0时，乳液形成了聚集
体或絮凝物，出现了明显的相分离情况，表明在此
pH值条件下无法制备出稳定、均一的高内相乳液。当pH值为9.0时‘Pickering高内相乳液外观均匀统一，结构细腻，呈乳白色，表明在碱性条件下制备的SPI凝胶颗粒更有利于稳定Pickering高内相乳液。
如图4所示，为了进一步研究内相体积分数对形成乳液外观稳定性与微观结构的影响，在pH值为9.0的
条件下制备了蛋白质质量分数为1.00%、内相体积分数不同的Pickering乳液。当内相体积分数为10%〜70%时，此时乳液不能被称为高内相
霸气的网名女生(a)pH值为4.5(b)pH值为7.0(c)pH值为9.0
图3不同pH值的大豆分离蛋白凝胶颗粒稳定的
Pickering高内相乳液
Fig.3High internal pha Pickering emulsions stabilized by
soybean protein isolate gel particles of different pH values
乳液。该乳液体系出现明显的分层现象，并且随着油相浓度的增加，上层乳白色絮状层增厚。当内相体积分数不断增加至82%时，形成了稳定的高内相乳液。其表面呈奶油状，细腻均一，较为黏稠，流动性差，在常温下放置14d仍未出现相分离现象。
1()%(b)30%(c)50%(d)70%(e)78%(f)80%
图4大豆分离蛋白凝胶颗粒稳定的不同内相体积分数的Pickering乳液
(g)82%
Fig.4Pickering emulsions with different internal pha volume fractions stabilized by soybean protein isolate gel particles
2.6Pickering高内相乳液光学显微镜观察
SPI凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液的40倍光学显微镜下微观结构如图5所示，由图5可知，所有由pH值9.0的SPI凝胶颗粒稳定的高内相乳液微观结构均呈现圆形液滴状，液滴粒径在5〜50滋m之间，变化较大。当内相体积分数小于70%时，液滴随机分散分布，随着内相体积分数的增加，形成高内相乳液后，液滴处于更紧密的填充状态，排列整齐，相互连接，形成一个致密的网络状油滴体系。随着内相体积分数的增加，乳液的液滴尺寸逐渐减小，表明较高的内相体积分数有利于形成更稳定的凝胶状结构，这与文献［31］的试验结果一致。
2.7Pickering高内相乳液冷冻电镜观察
如图6所示，用冷冻电镜对SPI凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液进行了表征，有利于更清晰直观地了解高内相乳液的微观结构。所有的油滴都被包裹在由SPI凝胶颗粒构成的三维网状结构中。SPI凝胶颗粒在油滴表面形成的紧密填充层为Pickering高内相乳液整体充当空间屏障,
换qi
增强液滴大班教育随笔
