操作一览
(PT3000-2)
本操作一览仅为实验流程，对于初用者，请在使用操作一览前仔细阅读SMART TM cDNA 文库构建试剂盒(Cat. No. 634901) 的说明书。
A. 第一链cDNA(fs cDNA)合成
1. 在0.5-ml 离心管中混匀以下试剂：
1–3 μl RNA 样本
(对照反应，使用1 μl 的对照RNA)
1 μl SMART™ IV Oligonucleotide
1 μl CDS III/3' PCR Primer
如果总体积<5 μl时，用水补齐至5 μl。
2. 混匀试剂并瞬时离心。
3. 72°C孵育2 min。冰上冷却2 min。市场营销英文
4. 瞬时短暂离心。
5. 向每管反应中加入以下试剂：
2.0 μl 5X First-Strand Buffer
1.0 μl DTT (20 mM)
1.0 μl dNTP Mix (10 mM)
1.0 μl SMARTScribe MMLV Rever Transcripta
10.0 μl 总体积
6. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。
7. 42°C孵育1 hr。之后的LD PCR（步骤B）操作需在冰上进行。
8.引物延伸合成ds cDNA
分别向反应管中加入1 μl 氢氧化钠，68°C孵育30 min，然后进行步骤C。
B. LD PCR扩增合成cDNA
1. 在一个新的0.5-ml 离心管中混匀以下试剂：
2 μl First-Strand cDNA (from Step A.7)
80 μl Deionized H2O
10 μl 10X Advantage2 PCR Buffer
2 μl 50X dNTP Mix
2 μl5' PCR Primer
2 μl CDS III/3' PCR Primer
2 μl 50X Advantage2 Polymera Mix
100 μl总体积见习岗
2. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。
3. 如果需要可以向管中加2滴矿物油，盖上管盖，置于预热(95°C)的PCR仪器
中。
4. 以下程序选择一种进行扩增：
GeneAmp 480 GeneAmp 2400/9600
•95℃ 1 min •95℃20 c
•x cycles*: •x cycles*:
95℃15 c 95℃ 5 c
68℃ 6 min 68℃ 6 min
*参考Table I 中最优循环数的使用。
5. 取5μl产物在1.1% 琼脂糖/EtBr 胶上进行检测，若检测结果与预期不符时，请参考疑难解答指南(说明书的Section VIII)。
6. 然后进入步骤D。
C. 引物延伸扩增ds cDNA
1. 混匀以下试剂：
11 μl First-Strand cDNA (from Step A.8)
71 μl Deionized H2O
10 μl10X Advantage 2 PCR Buffer
2 μl dNTP Mix
2 μl5' PCR Primer
2 μl CDS III/3' PCR Primer
2 μl 50X Advantage 2 Polymera Mix
100 μl 总体积
2. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。
3. 如果需要可以加2滴矿物油，盖上管盖后置于预热(95°C)的PCR仪器中。
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4. 以下程序选择一种进行扩增：
GeneAmp 480 GeneAmp 2400/9600
• 72°C 10 min • 72°C 10 min
• 95°C 1 min • 95°C 20 c
• 3 cycles:• 3 cycles:
95°C 15 c 95°C 5 c
68°C 8 min 68°C 8 min
5. 取5μl产物在1.1% 琼脂糖/EtBr 胶上进行检测，如果结果与预期不符，请参考疑难解答指南(说明书的Section VII)。
D. 蛋白酶K 消化
1. 向0.5-ml 无菌管加入50 μl 扩增后的ds cDNA(2–3 μg) 和2 μl 蛋白酶K (20 μg/μl)。将剩余ds cDNA置于–20°C保存。
2. 混匀试剂并瞬时离心。
3. 45°C孵育20 min，瞬时离心。
4. 加入50 μl Deionized H2O。
5. 再加入100 μl 酚：氯仿：异戊醇，轻柔地连续颠倒1–2 min。
6. 14,000 rpm 离心5 min。
7. 将最上层液体(上清液) 转移到0.5-ml干净的管。
8. 加入100 μl 酚：氯仿：异戊醇，轻柔地连续颠倒1–2 min。
9. 14,000 rpm 离心5 min。
10. 将最上层液体(上清液) 转移到0.5-ml干净的管。
11.加入10 μl 3 M醋酸钠, 1.3 μl 糖原(20 μg/μl)和260 μl室温95% 乙醇，立即进行14,000 rpm 室温离心20 min。
12. 小心去除上清液。
13. 100 μl 80%乙醇清洗。
14. 空气干燥(~10 min)来挥发残留的乙醇。
15. 加入79 μl Deionized H2O 重悬DNA颗粒。
E. SfiI 酶切
1. 在0.5-ml离心管中混匀以下试剂:
79 μl cDNA (Step D.15)
10 μl 10X Sfi Buffer
10 μl SfiI Enzyme
1 μl 100X BSA
100 μl总体积
2.混匀并在50°C 孵育2 hr。
3. 加入2 μl 1%二甲苯腈蓝，混匀。
F. CHROMA SPIN TM-400 cDNA分选
1. 标记16个1.5-ml离心管，按顺序摆放在管架中。
2. 准备CHROMA SPIN-400纯化柱：
a. 室温放置CHROMA SPIN 纯化柱1 hr。然后颠倒数次混匀胶质。
b. 赶走纯化柱中的气泡，使用1000-μl 移液器轻柔地重悬胶质。去除底盖让液体滴落。
c. 将纯化柱放置在环形支架上。
d. 借助重力将柱中存储液排干(胶质的顶端应该处于柱外表面1.0-ml标记处。)
e. 流速~1滴/40–60 c，每滴体积~40 μl。
观美人3. 当存储液排干后，加入700 μl 柱纯化缓冲液并将其排干。
4. 向胶质中央加入~100 μl SfiI消化后的cDNA和二甲苯腈蓝混合液(Step E.3 above)。
5. 当样本被胶质完全吸收后再进行下一步骤。
6. 向胶质中央加入100 μl缓冲液清洗纯化柱。
7. 排干缓冲液，胶质表面不能有液体残留。当无液体滴落时，再进行下一步骤。
8. 将步骤1中离心管放置在纯化柱下方，使标记1的管对准纯化柱下方液体出口处。
9. 加入600 μl 缓冲液后立即使用管1–16分别收集连续的1滴液体（每管~35 μl）。
10. 从16管中各取3 μl 在1.1% agaro/EtBr gel上150 V.电泳10 min检测分析。将最能代表实验样本cDNA大小范围的头3-4滴所对应管中的样本合并到一管。
11. 向管中加入以下试剂：
1/10 vol. Sodium Acetate (3 M; pH 4.8)
1.3 μl Glycogen (20 mg/ml)
2.5 vol. 95% ethanol (–20°C)
12. 前后轻柔地摇晃管使试剂混匀。
下划线怎么加13. –20°C或干冰/乙醇中放置1 hr。
14. 14,000 rpm室温离心20 min。
15. 小心吸掉液体。
16. 短暂瞬时离心。
17. 小心洗掉液体，然后空气干燥~10 min。
18. 加入7 μl Deionized H2O重悬DNA颗粒。
G. cDNA 连接载体
1. 标记3个0.5-ml 离心管，并向管中分别加入表(Table II)中所列试剂。混匀并瞬时离心。
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2. 16°C孵育过夜。
3. 分别进行λ-phage 包装。
4. 对文库进行滴度测定(Section H)。3个连接体系可获得1–2x10e6个单克隆。未扩增的文库在4°C 可保存2 weeks。
5. [可选]如果文库<1–2x10e6克隆，可将剩余的cDNA进行连接载体。使用表中cDNA和载体比例重复连接反应能够收获最好的结果；也可以根据cDNA的使用量来扩大体系来做连接。再进行包装反应和滴度测定实验。若这时候滴度还是低的话，请参考说明书中Section VIII的疑难解答指南。
6. 为了提高文库的稳定性，首先将步骤G.4中包装反应物合并，然后参照步骤J对文库进行扩增。扩增后的文库4°C可放置6–7 months，或在–70°C (in 7% DMSO) 可放置1年。
社会实践感悟H. 测定未扩增文库的滴度
1. 从存储培养板板中选取单个宿主菌株，接种到50-ml含15 ml LB/malto/MgSO4液体培养基的实验管。37°C震荡(140 rpm)孵育过夜。当OD600 o=
2.0时，5,000 rpm离心5 min收集菌体。弃上清，用7.5 ml 10 mM MgSO4.重悬菌体。
2. 准备90-mm LB/MgSO4 固体培养板，37°C预热培养板。
3. 使用1X lambda dilution buffer(稀释度=1:5-1:20)稀释未扩增细胞裂解物。
4. 向过夜培养的200 μl XL1-Blue中加入1 μl 稀释后的噬菌体，37°C作用10–15 min。
5. 加入2 ml 融化的LB/MgSO4 顶层琼脂，快速混匀，立即铺于90-mm 37°C预热的LB琼脂板上。
6. 将培养板室温冷却10 min，37°C 倒置培养6–18 hr。
7.记数菌斑，并计算噬菌体滴度(pfu/ml):
I. 鉴定重组率
星空物语
通过感染合适的宿主菌株(例如，E. coli XL1-Blue)和蓝白斑筛选，可鉴定含有插入片段的噬菌体。参照未扩增文库滴度测定的步骤(Step.H)来进行蓝白斑筛选，步骤中还需增加的实验是：在铺板噬菌体+细菌混合物时，向融化的顶层琼脂中加入IPTG 和X-gal。2 ml融化的顶层琼脂使用50 μl IPTG、50 μl X-gal存储液。为了获得500–1,000菌斑/90-mm板，将培养板在37°C 孵育6–18 hr。白斑和蓝斑的比例可以快速直观的估算重组效率。成功的连接实验的重组率为80%。如果您获得的重组率小于这个值，请参考说明书Section VIII的疑难解答指南。
[可选]SMART™ PCR cDNA 文库的PCR插入片段筛选
检测连接效率，推荐使用Clontech的Advantage 2 cDNA PCR Kit和λTriplEx LD-Inrt Screening Amplimers 检测cDNA插入片段。cDNA 和λTriplEx2载体的有效连接会产生80% 以上的重组子。
J. 文库扩增
文库扩增实验中需要多少培养板取决于文库有多少单克隆需要扩增。目标是每150-mm 板上有6–7x10e4 克隆(或菌斑)，那么，一个1x10e6克隆的文库就需要20个培养板。
1.从存储培养板中挑选单个克隆，接种到15 ml LB/malto/MgSO4液体培养基中，37°C震荡(140 rpm)培养过夜，当OD600=2时，5,000 rpm离心5 min收集菌体，弃上清，然后用7.5 ml 10 mM MgSO4重悬菌体。
2. 准备一定数量的LB/MgSO4 固体培养板。
3. 准备一定数量的4-ml 管，分别加入500 μl 细菌和每150-mm板有1 x 10e5菌斑的细胞裂解物。
4. 37°C水浴15 min。
5. 分别每管加入4.5 ml 融化的LB/MgSO4 松软顶层琼脂。
6. 快速混匀，将细菌+噬菌体混合物快速均匀地铺到LB/MgSO4 固体培养板上。
7. 室温冷却10 min。37°C 孵育6–18 hr，或者直到菌斑融合。
8. 向每个培养板中加入12 ml 1X lambda dilution buffer，4°C 存储过夜。这些菌斑融入1X lambda dilution buffer，形成一个扩增后的文库溶菌产物。
9. 室温震荡(~50 rpm)孵育1 hr。
10. 将lambda phage溶菌产物转移到无菌烧杯混匀，然后转入50-ml无菌带有螺旋帽的管中。
11. 再加入10 ml氯仿，漩涡震荡2 min。
12. 使用Beckman J2-21离心机，7,000 rpm (5,000 x g)离心10 min。将上清液转入新的50-ml 无菌的管，盖紧盖子后4°C保存。
13. 检测扩增后文库的滴度(Section K)。
14. 扩增后的文库在4°C 最多保存6 months。需要长期保存时(至少1年)时，要每ml文库中加入终浓度为7% DMSO，然后将文库–70°C保存，并且避免反复冻融。
