实时荧光定量PCR (RT-qPCR )由于具备灵敏度高、重
复性好、特异性强及高通量等优点，已经成为研究基因表达
分析的常用方法[1-2]。实时荧光定量PCR 分为绝对定量和相
对定量，在进行相对定量分析时不需要已知量的标准品，因而该方法被经常运用，但该方法需要用内参基因对目的基因进行数据校正，才能获得精确的结果[3-4]。
肌动蛋白基因(ACT )、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPD H )、18S rRNA 、转录延伸因子基因(EF-1α)、多聚泛素酶基因(UBQ )、α微管蛋白基因(TUA )和β微管蛋白基因(TUB )等看家基因在之前的研究中常常被当作内参基因进行使用[5-8]。然而，越来越多的研究表明，在某种试验稳定表达的内参基因，在另一种试验中有可能是变化的[9-11]，而在任何试验条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在[12-13]。如果仅仅根据文献报道使用某个常用的内参基因，不仅可能导致试验结果的不准确性，甚至可能导致结论的错误。因此，本着严谨的科学态度，科研工作者首先必须从众多的内参基因中筛选出在各自试验条件下较为稳定的内参基因。
geNorm 、NormFinder 和BestKeeper 是专门用于筛选内参基因稳定性的软件，但这3种软件的使用方法和分析的侧重点各不一样，为了让相关科研人员快速了解并掌握这
3种软件的使用方法，笔者结合自身使用这些软件的经历,
详细介绍了这3种软件的使用要点，以期为相关科研人员分析内参基因稳定性提供便利。1geNorm 软件1.1软件概述
父亲节母亲节geNorm 软件是Vandesompele 等[14]在2002年编写的专门用于实时荧光定量PCR 中筛选内参基因及确定最适内参基因数目的程序，该程序可以用于筛选任何试验的任意数目的内参基因，并最终挑选出2个或2个以上的内参基因组合来校正数据，可使相对定量的结果更为精确。geNorm 程序通过计算出每个内参基因稳定性的M 值来筛选出稳定性较好的内参基因，判定标准为M 值越小内参基因稳定性越好，反之，则稳定性越差。该软件还可计算引入1个新的内参基因后标准化因子的配对变异V 值，并根据V n /V n+1值
来确定所需最适内参基因的数目。默认的V 值为0.15(该值可以人为稍作调整)，如果V n /V n+1值<0.15，则最适内参基因的数量是n 个；而如果V n /V n+1值>0.15，则最适内参基因的数量是n +1个。1.2操作流程1.2.1
修改Excel 表格安全性级别。若geNorm 软件打开后
不能正常运行时，可能是由于Excel 表格默认宏的安全性级别设置的比较高，这时需要将Excel 表格安
实习的自我鉴定全性级别更改到最低级别。更改方法为点击Excel 表格中的“工具”按钮，然后点击其下拉菜单“宏”的子菜单“安全性”选项，在弹出来的“安全性”对话框中将安全级别设置为最低。
1.2.2计算ΔCt 值。先找到该基因在所有样品中最小的Ct
(Cycle threshold )值(表达量最高)，再用其他样品的Ct 值减
摘要实时荧光定量PCR (RT-qPCR )由于具备灵敏度高、重复性好、特异性强及高通量等优点，已经成为研究基因表达分析的常用方法，但其结果的准确性取决于内参基因。在任何试验条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在，科研工作者为了获得精准的试验结果，首先必须从众多的内参基因中筛选出稳定的内参基因。geNorm 、NormFinder 和BestKeeper 等是专门用于筛选稳定性内参基因的软件，但这3种软件使用方法差异很大，为了让更多的科研人员了解这些软件、节省时间，笔者结合自己的科研经验详细介绍了这3种软件的使用方法，以期为相关科研人员利用这些软件筛选内参基因提供便利。
关键词内参基因；稳定性分析;geNorm ;NormFinder ;BestKeeper 中图分类号S60文献标识码A 文章编号1007-5739(2017)05-0278-04
Analysis Method of Systematically Evaluating Stability of Reference Genes Using geNorm ,NormFinder and BestKeeper
WU Jian-yang 1HE Bing 1DU Yu-jie 1LI Wei-cai 2WEI Yong-zan 2*
(1Basic Education College of Lingnan Normal University ,Zhanjiang Guangdong 524037;2Key Laboratory of Tropical Fruit Biology (Ministry of
Agriculture ),South Subtropical Crops Rearch Institute ,Chine Academy of Tropical Agricultural Sciences )
Abstract Real-time fluorescent quantitative PCR technology (RT-qPCR )is ud for gene expression analysis with high nsitivity ,good repea-tability ,strong specificity ,high throughput ,but the veracity and reliability results depend on whether lect appropriate reference gene or not.However ,no universally applicable reference genes with an invariant expression are available.In order to obtain accurate results ,appropriate reference genes for RT-qPCR normalisation must systematically evaluate the stability of candidate reference genes prior to using in each Norm ,NormFinder and BestKeeper are uful programs to identify appropriate reference genes for RT-qPCR analysis ,but the methods for using the three softwares were different.In order to save the time to understanding the way to u them and provide convenient for new rearchers ,this study described the methods of application.
Key words reference gene ;stability analysis ;geNorm ;NormFinder ;BestKeeper动态感
寒暄语利用geNorm 尧NormFinder 和BestKeeper 软件进行内参基因稳定性
分析的方法
吴建阳1何冰1杜玉洁1李伟才2魏永赞2*
晦气的近义词(1岭南师范学院基础教育学院，广东湛江524037;2农业部热带果树生物学重点实验室，中国热带农业科学院南亚热带作物研究所)
基金项目
海南省自然科学基金(20163107)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1630062016009)；现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-33)；湛江市非资助科技攻关计划项目(2016B01106)；岭南师范学院青年项目(QL1514)；湛江师范学院青年项目(QL1116)。
作者简介吴建阳(1986-)，男，江西南城人，硕士，讲师。研究方向：植
物栽培与分子生物学。*通信作者
收稿日期2016-12-29
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图2Excel 中加载NormFinder 软件后的菜单栏
去最低Ct 值，从而得到ΔCt 值，该值≥0。1.2.3
计算2-ΔCt 值。获得每个样品每个基因的ΔCt 值后，利用Excel 中的函数计算出相应样品相应基因的2-ΔCt 值，该值就是每个候选内参基因的相对定量数据，也是进行geNorm 软件分析时要用到的数据。
1.2.4制作Excel 表格。在利用geNorm 软件分析时是将已经处理好的各个候选内参基因的相对定量数据保存在一个新的Excel 表格中，再把Excel 表格导入geNorm 程序中。而这个Excel 表格中对于基因和样品的排列位置是有特定要求的，要求规定第一列为试验的样品(样品数量至少在2个以上，样品数
量越多结论越可靠)，第1行为欲筛选的内参基因，第1列第1行的单元格必须是空的，其他单元格的数据是在步骤1.2.3中计算得到的基因相对表达量的数值。1.2.5内参基因稳定性和合适内参基因数目的确定。关闭所有Excel 程序，启动geNorm 程序，点击菜单栏中的“Load input data ”按钮导入已经在步骤1.2.4中制作的Excel 表格,
点击软件中的“Calculate ”按钮，软件初步计算后再点击“Automated analysis ”按钮，便可得到候选内参基因稳定性折线图，见图1(a )，该图最左边基因的M 值最高，是稳定性最差的基因(H3基因)，右边基因的M 值依次较左边基因的M 值低，稳定性依次增强，最右边基因的M 值最低，是稳定性最好的2个基因(CYP 1和Fe-SOD 2基因)。点击菜单栏
中的“Print or Save report ”按钮，从弹出来的对话框中选中“save output to fi ”选项便可把每个候选内参基因的M 值导出到一个Excel 中。再次点击“Automated analysis ”按钮便可得到最适数据归一化内参数目的柱形图，见图1(b )，可根据每个柱形图上面的V 值来确定试验所需的最适内参基因数目，判定标准为当V n /V n+1<0.15时，则最合适内参基因的数量是n 个；而如果V n /V n+1>0.15时，则最合适内参基因的
数量是n +1个，所以该试验条件下的最适内参基因数目是2个，因为V 2/3=0.135<0.15。再次点击菜单栏中的“Print or Save report ”按钮，从弹出来的对话框中选中“save output to
fi ”选项便可把所有的V n /V n+1值导出到一个Excel 中。2NormFinder 软件2.1软件概述
NormFinder 是Claus 等[15]在2004年编写的用于筛选稳
定性内参基因的另一种程序，该程序计算原理与geNorm
程序相似，也是先获得内参基因表达稳定值，再根据稳定值大小来筛选出最合适的内参基因，判定标准为表达稳定值最小的内参基因为最合适的内参基因。NormFinder 程序不但可以比较候选内参基因的表达差异，还可以计算样品组间的变
异，但该程序只能筛选出一个最合适的内参基因[16]。2.2操作流程2.2.1
在Excel 表格中插入NormFinder 软件。先打开一个
Office 2003版的Excel 表格，在菜单栏中单击“工具”下拉菜单中的“加载宏”选项，通过“加载宏”对话框中的“浏览”按钮找到NormFinder 软件存放的位置，点击“确定”按钮，将
NormFinder 软件功能加载到Excel 中，加载成功后在Excel 菜单栏中会多一个NormFinder 按钮(图2)。2.2.2计算ΔCt 值。计算方法与步骤1.2.2一致。
2.2.3计算2-ΔCt 值。计算方法与步骤1.2.3一致。2.2.4制作Excel 表格。进行NormFinder 分析是在Excel 表格中进行的，但Excel 表格中基因和样品的排列位置与进行geNorm 软件分析时有所不同。利用NormFinder 分析时,
Excel 表格中第1列为欲筛选的内参基因，第1行为试验中的样品，第1列第1行的单元格必须是空的，其他单元格的数据是步骤2.2.3中计算得到的基因相对表达量的数值。 2.2.5
内参基因稳定性的确定。步骤2.2.4处理好后单击
Excel 菜单栏“NormFinder ”按钮下拉菜单的“NormFinder ”选项，便弹出对话框，如图3所示。单击“Select input date ”后面的按钮，就可以利用鼠标在Excel 表格中选定数据区域，选定区域后再次回到图3界面，然后单击“Go ”按钮，便可获得各个基因稳定性M 值，同时稳定性最好的基因(Best gene )会单独显示出来，如图4所示最稳定的基因为RPL 2。
注:a 为候选内参基因表达稳定性;b 为最适数据归一化内参基因数目的确定。
图1geNorm 软件分析结果
a
b
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图4NormFinder
软件分析结果
图3NormFinder 软件对话框
3BestKeeper 软件3.1软件概述
BestKeeper 是Michael 等[17]编写的针对内参基因和目标
基因表达量分析的程序，该程序最多只能比较100个样品中10个内参基因和10个目标基因的表达水平。通过该程序计算可以获得每个基因之间产生配对的相关系数(r )、标准偏差(SD )和变异系数(CV )，再通过比较各个值的大小，最终确定稳定性较好的内参基因。判定原则为相关系数越大、标准偏差和变异系数越小，内参基因稳定性越好，反之，稳定性越差；当SD>1时，则该内参基因表达不稳定。该程序不但可以用于内参基因稳定性比较，还可以分析目的基因的表达水平。3.2操作流程
BestKeeper 程序是一个内置公式的Excel 表格，在该表
格中只有CP (crossing point )值输入区域(CP date input )可以进行数据的输入和修改，其他区域的单元格由于带有内置公式而不能进行任何操作。该程序操作较简单，只需要将实时荧光定量PCR 所获得的CP 值直接输入“CP date input ”区域，输入的CP 值是RT-qPCR 中3次技术重复所得值的几何平均数。当CP 值输入完毕后,BestKeeper 程序会自动将计算好的相关系数(r )、标准偏差(SD )和变异系数(
CV )等值显示在表格的下方。之后根据判定原则，确定较稳定的内参基因。4结语
geNorm 、NormFinder 和BestKeeper 等软件是专门用于
筛选内参基因稳定性的程序，且在多种植物中利用这些软
件获得的内参基因稳定性试验成果已在较高档次的SCI 期刊上发表，如在大豆[18]、马铃薯[19]、印加果[20]、香蕉[21]上的试验结果分别在BMC Molecular Biology 、Journal of Experimental Botany 、International Journal of Molecular Sciences 、Planta 期刊上发表，笔者利用这些软件分析获得的龙眼[22]内参基因稳定性结果也发表在Frontiers in Plant Science 期刊。
利用geNorm 和NormFinder 软件分析时，需要将RT-
qPCR 所得到的Ct 值转化为基因的相对表达量，然后按相应的格式把这些数据保存在Excel 表格中，而在使用BestKeeper 软件时不需要将RT-qPCR 所得到的CP 值进行转化，可以直接使用所得到的CP 值。
geNorm 分析时首先是将已经处理好的数据保存在
Excel 表格中，再把Excel 表格导入geNorm 程序中。NormF-inder 分析时是在Excel 表格中将NormFi
nder 程序以宏的方式插入到Excel 表格中，从而使Excel 具有NormFinder 分析功能。BestKeeper 分析时是在内置BestKeeper 公式的Excel 表格中直接输入CP 值进行分析。
这3种软件各具优点,geNorm 软件可以用于筛选任何样品的任意数量内参基因，通过该程序分析可以筛选出合适的内参基因以及确定最适内参基因数目。NormFinder 软件不但可以比较内参基因的表达差异，还可以计算样品组间的变异，但只能筛选出1个合适的内参基因。BestKeeper 软件可以用于比较100个样品中10个内参基因和10个目
标基因的表达水平，并最终获得较为稳定的内参基因。
5参考文献
[1]RANSBOTYN V ,REUSCH T B H.Houkeeping gene lection for qua-ntitative real-time PCR assays in the agrass Zostera marina subjected to heat stress[J].Limnology and Oceanography Methods ,2006,4(6):367-373.
[2]YOO W G ,KIM T I ,LI S ,et al.Reference genes for quantitative analysis on Clonorchis sinensis gene expression by real-time PCR[J].Parasitology Rearch ,2009,104(2):321-328.
[3]QUACKENBUSH J.Microarray data normalization and transformation[J].Nature Genetics ,2002,32:
496-501.
[4]NOLAN T ,HANDS R E ,BUSTIN S A.Quantification of mRNA using re-altime RT-PCR[J].Nature Protocols ,2006,1(3):1559-1582.
[5]SUZUKI T ,HIGGINS P J ,CRAWFORD D.Control lection for RNA qu-antitation[J].Biotechniques ,2000,29(2):332-337.
[6]BUSTIN S A.Quantification of mRNA using real -time rever transc -ription PCR (RT-PCR ):trends and problems[J].Journal of Molecular En-docrinology ,2002,29(1):23-29.
[7]DHEDA K ,HUGGETT J F ,BUSTIN S A ,et al.Validation of houk -eeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR[J].Biote-chniques ,2004,37(1):112-119.
[8]KIM B R ,NAM H Y ,KIM S U ,et al.Normalization of rever transc -ription quantitative-PCR with houkeeping genes in rice[J].Biotechnol-ogy Letters ,2003,25(21):1869-1872.
[9]TONG Z G ,GAO Z H ,WANg F ,et al.Selection of reliable reference ge-nes for gene expression studies in peach using real -time PCR [J].BMC Molecular Biology ,2009,10(1):1-13.
如何让孩子爱上阅读
[10]TROND L ,CATHRINE L.Reference gene lection for quantitative rea-ltime PCR normalization in tomato subjected to nitrogen ,cold ,and light stress[J].Analytical Biochemistry ,2009,387(2):238-242.
[11]MUKESH J ,AASHIMA N ,AKHILESH K ,et al.Validation of hou -keeping genes as internal control for studying gene expression in rice by quantitative real-time PCR[J].Biochemical and Biophysical Rearch Communications ,2006,345(2):646-651.
[12]MA R ,XU S ,ZHAO Y C ,et al.Selection and validation of appropriate
reference genes for quantitative real-time PCR analysis of gene expr-
280
.com. All Rights Rerved.
(上接第272页)
等课程的课程体系中，通过专业实验的开设及参与教师的科研项目等多种手段，全方位地提升学生的创新创业精神及能力，要充分发挥农学类专业学生的专业优势，结合国家的惠农政策，大力倡导农学
类专业学生走涉农创业之路。农学类专业学生针对自身的实际情况，凭借自身的技术优势，走涉农创业之路，并努力获取国家的政策支持，抓住机遇、迎接挑战，必将提高创业的成功率[7]。
5参考文献
[1]李勇超.以专业为基础的高校生物化学教学改革[J].河南科技学院学
报,2013(2):113-115.
[2]王梦姣.浅谈生物化学与分子生物学进展及其在社会发展中作用[J].
陕西农业科学,2009(5):112-114.
[3]高双成，史国安，施江，等.农学专业《分子生物学》教学模式的探
索[J].教育教学论坛,2013(38):50-51.
[4]彭湘奇，王美军，王愚，等.农学类专业研究生自主创业影响因素与对
策分析[J].科技创业,2013(1):25-28.
[5]赵莹莹，何剑斌，于业辉，等.高等农业院校分子生物学教学改革实
践[J].沈阳农业大学学报(社会科学版),2014,16(6):713-716. [6]孙新.农业院校提高生物化学课程教学效果的实践探索[J].现代农业
科技,2015(19):341-342.
[7]王平，韩菡，尹昌美，等.大学生职业生涯规划与创新创业能力提升探
析[J].山东青年政治学院学报,2016(1):56-60.
(上接第273页)
黄河泛滥合、理论讲解与实际操作相结合、集中培训与个别指导相结合、问题分析与交流研讨相结合的方式实施培训[3-4]。
3.3依托合作社为贫困户农民搭建作业服务平台袁拓宽贫困户增收渠道
在对贫困户农民进行农村实用人才农机化技术培训、政策帮扶、资金扶持的同时，还要介绍农村贫困户农民加入当地有影响、标准高、服务好、盈利强的合作社。在合作社统一组织下，积极参与当地的土地流转规模经营，打破一家一户小规模经营现状，推进土地流转、扩大托管面积，最大限度地提高农机具的利用率和使用效益，科学经营土地，提高土地产出。同时，积极参与夏、秋2季的跨区作业服务，为贫困户拓宽增收渠道，早日实现脱贫致富。
4参考文献
[1]张昭文.加强农村劳动力转移培训和实用技术培训为建设社会主
义新农村做贡献[J].中国职业技术教育,2006(23):5-11. [2]荣昱.农村职业技术培训的现状和发展前景[J].天津农学院学报, 2004(3):55-60.
[3]杜敏.浅谈开展农村实用技术培训存在的问题及对策[J].时代金融, 2007(7):92-93.
[4]张艺矾.甘肃农村实用技术培训现状与发展的几点建议[J].农业与技
术,2014(2):227.
(上接第275页)
“互联网+”使畜牧企业形成上游、下游协同发展的产业链，抓住“互联网+”的优点，使畜牧业在这片“海洋”中获取更大的开发空间。未来谁先充分利用“互联网+”发展畜牧业，谁就是畜牧业的领物，就是产业链的绝对主导者，从而在畜牧企业竞争中立于不败之地。
租设备
5参考文献
[1]中华人民共和国国务院.国务院关于积极推进“互联网+”行动的指
导意见[N].经济日报,2015-7-05(005).
[2]顾玲艳，李鹏，许永斌.畜牧业互联网+战略实施现状与建议[J].产业
透视,2015,51(22):15-17.
[3]杨秀春.信息技术在畜牧业中的传播方式及其应用[J].畜牧与饲料科
学,2014,35(2):61-62.
[4]吴洋.从牧业角度看“产业+互联网”[J].中国畜牧业,2016(1):84-85.
[5]周爱国.畜牧业与互联网应深度融合[J].行家指点,2015(18):41-42.
[6]王雅林.对电商进入畜牧行业的几点思考[J].新视点,2015,51(10): 22-25.
[7]张宪帮.“移动通讯+互联网+信息技术”模式在畜牧业中的应用[J].
养殖技术顾问,2014(10):310.
(上接第277页)
段还会不断改进和更新，养殖水化学实验课程的教学改革和探索还将进一步深入。
4参考文献
[1]梁震，蒋礼，郑曙明，等.高等院校养殖水环境化学教学改革探讨[J].
科技创新导报,2014(15):112-113.
[2]姜宏波，包杰，何剑斌，等.《养殖水环境化学》课程教学的改革实践
与探索[J].畜牧与饲料科学,2014,35(3):34-35.[3]陈雪芬，郭伟良，王永强.“水环境化学实验”实验教学改革探讨[J].实
验技术与管理,2011,28(7):141-143.
[4]吴湘，郭玉华，叶金云.高校水产养殖专业实践教学体系改革的探索
与思考[J].湖州师范学院学报,2014(36):54-56.
[5]祁保霞.内陆地区《养殖水环境化学》课程教学改革初探[J].安徽农学
通报,2015,21(11):152-153.
[6]杨雨虹，陈伟兴，黄金善.水产养殖专业养殖水化学课程教学改革的
探索与思考[J].东北农业大学学报(社会科学版),2012,10(6):118-120.
ession in Lycoris aurea[J].Frontiers in Plant Science,2016,7:651.
[13]LI M Y,WANG F,JIANG Q,et al.Validation and comparison of refer-ence genes for qPCR normalization of celery(apiumgraveolens)at diff-erent development stages[J].Frontiers in Plant Science,2016,7:313.
[14]VANDESOMPELE J,PRETER D K,PATTYN F,et al.Accurate norma-lization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J].Genome Biology,2002,3:7. [15]CLAUS L A,JENS L J,TORBEN F R.Normalization of real-time qua-ntitative rever transcription-PCR data:a model-bad variance esti-mation approach to identify genes suited for normalization,applied to bladder and colon cancer data ts[J].Cancer Rearch,2004,64(15): 5245-5250.
[16]PEREZ S,ROYO L J,ASTUDILLO A,et al.Identifying the most suitable endogenous control for det
ermining gene expression in hearts from organ donors[J].BMC Molecular Biology,2007,8(1):1-23. [17]MICHAEL W P,ALES T,CHRISTIAN P,et al.Determination of stable houkeeping genes,differentially regulated target genes and sample integrity:Best Keeper-Excel-bad tool using pair-wi correlations[J].
Biotechnology Letters,2004,26(6):509-515.
[18]HU R B,FAN C M,LI H Y,et al.Evaluation of putative reference genes for gene expression normalization in soybean by quantitative real-time RT-PCR[J].BMC Molecular Biology,2009,10(1):93-93. [19]NICOT N,HAUSMAN J F,HOFFMANN L,et al.Reference gene lec-tion for RT-qPCRnormalization in potato during biotic and abiotic str-ess[J].Journal of Experimental Botany,2005,56(421):7-14. [20]NIU L,TAO Y B,CHEN M S,et al.Selection of reliable reference genes for gene expression studies of a promising oiled crop,plukenetia vol-ubilis,by real-time quantitative PCR[J].International Journal of Molec-ular Sciences,2014,16(6):12513-12530.
[21]CHEN L,ZHONG H Y,KUANG J F,et al.Validation of reference genes for RT-qPCR studies of gene expression in banana fruit under different experimental conditions[J].Planta,2011,234(2):377-390. [22]WU J Y,ZHANG H N,LIU L Q,et al.Validation of reference genes for RT-qPCR studies of gen
e expression in preharvest and postharvest lon-gan fruits under different experimental conditions[J].Frontiers in Plant Science,2016,7:439.
281
.com. All Rights Rerved.
