浅谈几种常用分子生物学技术的原理及其在昆虫分类中的应用
摘要：在以分子生物学技术占主导地位的生物世纪，分子生物学技术已被应用到生物科学当中，当然应用到昆虫分类中也起到了很明显的成效。本文主要介绍了核酸序列分析、RFLP 技术、RAPD 技术、分子杂交技术、同工酶电泳技术、SSCP和DSCP技术等几种常见分子生物学技术的原理及其在昆虫分类中的应用。通过总结分析得出分子生物学技术在昆虫分类中有着重大的意义。
关键字：分子生物学技术；昆虫分类；核酸序列分析；同工酶电泳技术
随着生命科学和化学的不断发展，人们对生物体的认知已经逐渐深入到微观水平。从单个的生物体到器官到组织到细胞，再从细胞结构到核酸和蛋白的分子水平，人们意识到可以通过检测分子水平的线性结构（如核酸序列），来横向比较不同物种，同物种不同个体，同个体不同细胞或不同生理（病理）状态的差异。因此分子生物学技术在现代生物学研究工作中起着至关重要的作用。这里主要介绍了几种常用分子生物学技术的原理及其在昆虫分类中的应用。
1 核酸序列分析
现代生物学研究业已证实核酸是生物遗传的本质，他决定着生物体的形态性状。因此通过核酸序列分析能从根本上对生物进行鉴定分类，当然核酸序列分析在昆虫分类工作中也会起着至关重要的作用。在昆虫体内，有细胞核DNA和线粒体DNA两种DNA。
1.1 线粒体DNA的研究
线粒体DNA为双链闭环分子,昆虫的线粒体DNA大小为15.4～16.3 kb,其中含有编码2个核糖体RNA(12SrRNA,16S rRNA)、22个tRNA、1个细胞色素b、3个细胞色素氧化酶(CO I、COII、COIII)、6个NADH降解酶(ND1～6)和梦见老公和别人结婚2个ATP酶(6和8)的基因。目前,通常用于鞘翅目昆虫分类研究的基因有以下几种:16SrRNA、ND4、ND5、COI等。
我国研究者刘晓丽和任国栋测定了9 种拟步甲科昆虫的16SrDNA部分基因序列,并与GenBank中的1种步甲的基因序列作同源性比较,构建了分子系统树,对它们的亲缘关系进行研究,结果与传统的分类观点相吻合[1]。李伟丰等对来自不同国家的7 种长蠹科害虫的线粒体DNA ND4基因的部分序列进行测定,发现这7种昆虫不仅在外形特征上存在差异,并且在ND4基因序列上也存在明显差异[2]。这为长蠹科昆虫的准确鉴定提供了充分的证据。日本
学者普遍认为日本步甲是在冰河世纪时从欧亚大陆传入日本的,然而Tominaga 等学者通过线粒体ND5 基因比较和日本地史学研究,发现日本的步甲是来源于在欧亚大陆分离时本身居住在日本的步甲祖先[3]。我国也有不少研究者也利用线粒体DNA的部分基因序列对瓢虫进行分类。
1.2 核糖体DNA的研究
核糖体DNA ( ribosomal DNA , rDNA) 是编码核糖体RNA的基因,是一类中度重复的DNA序列,以串联多拷贝形式存在于染色体DNA中。每个重复单位由非转录间隔区、转录间隔区和驴英语3种RNA基因编码区组成。由于rDNA是生物界普遍存在的遗传结构,具有多拷贝性、编码区保守、转录间隔区中度保守等优点,公共的拼音因而在个体及群体内有较好的均一性,少量样品能有效代表其来源群体的rDNA的变异情况。因此,rDNA已成为生物系统进化研究中一个非常有用的分子标记。
日本学者利用28SrDNA对发光叩甲的进化进行研究,通过构建系统树发现叩甲祖先是不发光的,这表明发光的叩甲是独立于其它发光的甲虫而进化的。Bocakova 等对核基因18SrDNA和28SrDNA、线粒体基因16SrDNA和COI进行扩增,并构建系统进化树,研究发现尽管鞘翅
目的关键特征在叩甲类昆虫中受到很大程度限制,但它们有多重的起源,说明世系和独立地获得相似特征的关系密切[4]。郑福山等通过对我国菱角萤叶甲6个地理种群和褐背小萤叶甲扬州种群的ITS1 进行测序,发现ITS1 在小萤叶甲属昆虫中进化速度较快,种下具有一定差异,种间差异明显,该基因适合小萤叶甲属种间和属下的分类鉴定研究[5]。Kawamura 等对世界各主要疫区甘薯象甲的ITS1 进行扩增, 获得557～587bp 的序列,来源于印度的象甲ITS1 序列明显较长,系统发生树明显可以分为印度的和东亚的2个分支[6]。Contreras2Dí清炒土豆丝az 等利用线粒体DNA 和ITS2 序列对加那利群岛的步甲进行分析,系统进化树表明该地区步甲可以分为2个分支,一支包含由来源于拉戈梅拉岛照叶林和特纳里夫的步甲,另一支包含大加那利岛和来源于西方不合适4个岛屿的步甲[7]。Gómez2Zurita 等对47个叶甲样品(34 种)的ITS2序列进行研究,发现叶甲的ITS2 序列和其它叶甲总科昆虫的ITS2有相似性,但和其它节肢动物的ITS2没有明显相似性[8]。
2 RFLP 技术
限制性片段长度多态性(RFLP)是指用限制性内切酶处理不同的DNA，产生不同长度的限制性片段所呈现的多态现象。可根据酶切图谱,计算类群之间的遗传距离,构建系统树,此方法
既可以进行近缘种及种内群体间的比较,同时也可以进行远缘物种的比较,主要用于构建基因组连锁图谱及确定物种间的亲缘关系。由于RFLP 技术存在许多局限性：现有的限制性内切酶不可能检出所有的核苷酸改变、酶切所产生的不同长度的酶切片段所能提供的多态信息量有限等,目前在鞘翅目昆虫分类研究中的应用不多, 国内主要应用于双翅目、膜翅目等昆虫的快速鉴定。
3 RAPD 技术
随机扩增多态性DNA(RAPD)技术在PCR的基础上,利用随机合成的寡聚核苷酸序列为引物(一般为10个nt),分别与DNA的2条单链结合,在DNA聚合酶的作用下, 对基因组特定区域进行PCR 扩增。由于不同物种基因组中与引物相匹配的碱基序列的空间位置和数量都可能不同,所以扩增产物的大小也有可能不同,即扩增片段DNA 的多态性反应了基因组DNA相应区域的多态性。此方法的优点是快速简便、反应灵敏,对遗传背景不清楚的材料也能可应用。目前已经广泛应用于同翅目、蜻蜓目、等翅目、直翅目、双翅目、鳞翅目、膜翅目等昆虫的分类研究中。其中在鞘翅目的分类研究中应用最多。
安榆林等利用RAPD 技术对采自中国和美国光肩星天牛8个地理种群进行遗传关系分析,发
现美国的和中国的光肩星天牛种群的样本之间存在显著差异,遗传关系较远。随后,他们又对更多的采自中国、美国和韩国各地的光肩星天牛进行RAPD 聚类分析,研究结果与前一结果一致。李志强等利用RAPD 技术证实辽宁省不同地域稻水象甲存在遗传差异,并分析了这一差异性对追溯稻水象甲传播过程和开展其传播蔓延控制的意义。张迎春等利用RAPD技术对瓢虫科的6个种进行亲缘关系分析,该结果与形态学分类结果一致[9]。Scataglini等利用RAPD对来自不同国家的墨西哥棉铃象甲进行系统发育分析,其系统树显示了墨西哥棉铃象甲不同种群的亲缘关系的远近，从而揭示了南美洲棉铃象甲是先于棉花的粗放耕作而自然发生的，它们的爆发可能是和耕地的增加相联系的[10]。Taberner等利用RAPD技术分析了糖料作物害虫鞘翅目象甲科的种群遗传特性,并对各个种群之间的关系进行分析,明确了西班牙南部种群间的生态和进化关系[11]。
4 分子杂交技术
分子杂交是将少量变性的核酸固定在固体支持膜上,用专一性检测互补核酸序列的标记探针与样品进行杂交,再通过反射自显影或酶标颜色反应进行检测。分子杂交的关键是制备特异性强、灵敏度高、具有高比活的探针,目前应用较多的是地高辛和生物素等非放射性标记探
针。Lorite 等利用原位杂交对叶甲科昆虫的微卫星进行了研究[12]。由于分子杂交技术要求对研究类群的遗传背景有一定了解,且该技术相对复杂和昂贵,故在鞘翅目的分类研究中应用并不广泛。
5 同工酶电泳技术
由于同工酶是基因的产物,能直接反映基因的异同,易于观察研究,目前已作为一种生化遗传标志广泛地应用于发育生物学、群体遗传学、系统分类学等各个领域。通过物种同工酶的研究,世界上人口最多的国家可以推测物种在基因水平的不同,进而可以推测其血缘关系和进化地位。自20世纪70年代中期以来，应用电泳技术进行昆虫同工酶的研究日益普遍,涉及的昆虫类群有蜉蝣目、蜚蠊目、直翅目、同翅目、半翅目、虱目、双翅目、蚤目、鳞翅目、膜翅目等。在鞘翅目昆虫中,多见于天牛科、瓢甲科、叶甲科。
唐桦等通过酯酶同工酶电泳发现光肩星天牛和黄斑星天牛在酯酶带上差异甚微铁观音的功效,认为这2种天牛应归属于同1个种[13]。张迎春等分析了瓢虫科2属5种的酯酶同工酶,结果显示属间的酶谱有显著差别,在属内具有某些共性[14]。每个种都具有自己特有的谱型,彼此易于区分。
聚类分析显示5个种亲缘关系的远近,与形态分类结果一致。聂传朋等分别于2005年和2007年对叶甲科昆虫酯酶同工酶进行研究,结果表明利用酯酶同工酶分类与传统分类结果基本一致。说明以酯酶同工酶作为研究手段来进行叶甲类昆虫亚科以下阶元的分类是可行的,同时也说明它们酯酶同工酶酶谱的差异和其分类地位是一致的。
6 SSCP和DSCP技术
单链构象多态性(SSCP)技术的原理是基于序列不同的DNA 单链片段,其空间构象亦有所不同，当其在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，其电泳的位置亦发生变化而表现出不同序列单链电泳迁移率的差异，据此判断有无突变或多态性存在。该方法对检测基因的单个碱基置换或短核苷酸片段的插入或缺失的筛查提供了有效而快速的手段。双链构象多态性(DSCP)技术的原理和SSCP基本相似，由于突变引起DNA 双螺旋构象不同,从而在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度发生变化。SS2CP技术已被广泛应用于人体医学[43244]、畜牧学[45246 ]、植物病理学[47251]、昆虫和线虫分类学[52257]等研究领域。Boge 等采用SSCP 技术对步甲属进行了种的鉴定[30],Sedlimair 等也应用泛素基因SSCP技术研究了步甲亚属的进化关系。
随着分子生物学的迅猛发展,以及核酸序列分析、RFLP技术、RAPD 技术、分子杂交技术、同工酶电泳技术、SSCP以及DSCP等分子生物学技术在昆虫分类研究中的应用和有益探索,或是解决了传统分类中所存在的学术疑难问题,良久的近义词或是验证了传统分类所得出的结论,已显示出其应有的优势和广阔的发展前景。然而分子生物学技术在昆虫分类研究中的应用时间毕竟不长,还存在不少问题。首先是目的基因或DNA 片段的选择,如何在庞大的昆虫DNA 文库中选择最有利于昆虫分类、最能反映其进化关系的基因或DNA 片段,仍存在较大难度。其次是用不同的目的基因或DNA 片段对同一昆虫进行研究,可能会得到不同的结果。再次是分析软件或程序包的应用,目前有大量的分子生物学分析软件,不同的软件或程序包有许多不同的假设和参数,研究者采用不同的分析软件或采用同一软件而设置不同的参数,同样的数据可能会得到不同的结果。如何解决好这些问题是今后昆虫分子科学研究工作中的重要任务。
参考文献：
[1] 刘晓丽, 任国栋. 9 种拟步甲16S rDNA 部分序列及其亲源关系[J]. 河北大学学报(自然科学版) ,2004 ,24 (4):3992405.
[2] 李伟丰,黄永成,陈邦禄,等. 7 种长蠹科昆虫的线粒体DNAND4 基因序列比较分析[J]. 植物检疫,2001 ,15 (5):2572262.
[3] TOMINAGA O , SU Z H , KIM C G, et al . Formation of the J apane Carabina Fauna inferred from a phylogenetic tree of mitochondrial ND5 gene quences ( Coleoptera : Carabidae )[J]. J Mol Evol ,2000 ,50 :5412549.
[4] BOCA KOVA M ,BOCA K L ,HUNT T ,et al. Molecular phylo2 genetics of Elateriformia ( Coleoptera ) : evolution of biolumi2nescence and neoteny[J]. Cladistics ,2007 ,23 :4772496.
