氧杂蒽酮、呫吨酮（图片加文字Xanthone）自由基清除ROS清除：活性、机制与构效关系（PTIO法）
【文献依据】
魏桓子
Li, X.; Chen, B.; Zhao, X.; Chen, D. 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-oxide Radical (PTIO•) Trapping Activity and Mechanisms of 16 Phenolic Xanthones. Molecules. 2018, 23, 1692. doi: 10.1021/acs.jafc.7b02247
【实验操作】
说明：使用2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基3-氧化物自由基（PTIO•）清除法，我们研究了16种天然呫吨酮在水溶液中的抗氧化活性，包括γ-倒捻子素、芒果苷、1,6,7-三羟基呫吨酮、1,2,5-三羟基呫吨酮、1,5,6-三羟基呫吨酮、1,3,5,6-四羟基呫吨酮，2-羟基呫吨酮，7-O-甲基芒果苷，新芒果苷和披针菊酯。观察到16种呫吨酮中的大多数可以在pH 4.5和7.4下以剂量依赖性方式清除PTIO•自由基。其中，12种对二羟基（或邻）型呫吨酮的抑制浓度（IC50）值始终低于邻二羟基型的呫吨酮。超高效液相色谱联合电喷雾电离飞行时间串联质谱（UPLC−ESI−Q−TOF−MS/MS）分析显示，除新芒果菊素外，这些呫吨酮在PTIO•孵育后，大多数均给予呫吨酮-呫吨酮二聚体。基于这些数据，我们得出结论，酚类呫吨酮的抗氧化活性可能是由电子转移（ET）和H+转移机制介导的。通过这些机制，一些呫吨酮可以进一步二聚，除非它们具有巨大的取代基和空间位阻。四种取代基类型（即对二羟基，5,6-二羟基，6,7-二羟基和7,8-二羟基）可以主导呫吨酮的抗氧化活性，而其他取代基（包括异戊二烯基和3-羟基-3-甲基丁基取代基）只要不破坏上述四种类型，就起次要作用[1]。
【背景知识】
天然呫吨酮可以从食用植物、药用植物（包括中草药）中分离出来， 和海洋衍生的真菌。特别是，已经成功地从热带水果山竹和芒果中分离出数十种黄原酮，呫吨酮被认为是这些水果的生物活性成分。结构阐明表明，呫吨酮支架由同一平面上的两个苯基环和一个吡喃酮环组成。 (图.1). 在这个平面和对称的脚手架中,，1-8位的氢原子（H）可以被-羟基取代以构建酚羟基;因此，呫吨酮可以被视为天然酚类物质，并作为酚类抗氧化剂。
据报道，酚类抗氧化剂在疾病预防中起着重要作用。例如，山竹果最近被认为对肝癌具有抗肿瘤作用。事实上，抗肿瘤活性与抗氧化活性密切相关。这是因为细胞癌变在很大程度上是由活性氧（ROS）诱导的氧化损伤引起的。呫吨酮等酚类物质能有效抑制过量的ROS，防止癌变。然而，尚未报道对呫吨酮类抗氧化活性和机制的系统研究。
图1 呫吨酮支架的结构（A）和优先构象（B）
图2 2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基3-氧化物自由基的结构
在这项研究中，引入了2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基3-氧化物自由基（PTIO•，图2）清除测定法[1]。PTIO•-清除法由我们的团队最新开发，与常见的抗氧化测定法，相比至少有两个优点：例如1,1-描写水的诗句古诗二苯基-2-苦味基-肼（DP自制戚风蛋糕PH•）清除测定和2,2'-叠氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS•+）清除测定。与•羟基自由基，•O2-阴离子自由基和其他献给好人的奏鸣曲ROS一样，PTIO• 自由基也是以氧为中心的自由基（图2）;与细胞中的抗氧化作用一样，PTIO•清除作用也在水性介质中实现;然而，水性培养基在生物学上更具相关性。然而，两种常见的抗氧化测定（特别是DPPH•清除测定）基于以氮为中心的自由基，并在亲脂性培养基中进行。因此，PTIO•-清除测定可以很好地表征抗氧化剂的ROS清除作用，更适合研究呫吨酮的抗氧化活性。为了研究其抗氧化机理，采用超高效液相色谱法结合电喷雾电离飞行时间串联质谱（UPLC−ESI−Q−TOF−MS/MS）进一步测定了呫吨酮与PTIO•的反应产物。
假设，抗氧化活性和机制应来自呫吨酮中某些特定取代基的有效性。如文献中所述，这些取代基主要指酚-羟基、异戊二烯基、环化异戊二烯基、甲基和糖苷。然而，酚羟基可以进一步分为 几种类型： 对二羟基，5,6-二羟基，6,7-二羟基， 7,8-二羟基， 单酚-羟基和 间位二羟基。异戊二烯基取代基被认为是呫吨酮家族的特征，因为约50%的成员含有这种取代基。这些取代基是否以及如何影响呫吨酮的抗氧化活性直到现在仍然未知，尽管文献中已经记录了至少300种呫吨酮。为了解决上述问题，本研究随机选择了16种呫吨酮作为参考（图3）。如图3所示，这些参考文献涵盖了上述所有取代基。此外，它们约占整个呫吨酮的6%。因此，该研究有望提供呫吨酮的新特征信息。
图3 16种选定呫吨酮的结构[1]
【实验结果与讨论】
2.1 PTIO•清除测定中的抗氧化活性和机制
正如循环伏安图所表明的那样，pH5.0以下的PTIO•清除是一种ET过程。在本研究中，大多数呫吨酮可以在pH4.5下以剂量依赖性方式清除PTIO•自由基。这表明呫吨酮在抗氧化过程中可能具有ET电位。此外，在生理pH值（7.4）下也测定了这些呫吨酮的PTIO•清除活性。pH7.4时的PTIO•清除作用可能与H+转移有关。如增1所示，16个呫吨酮参比物的PTIO•清除百分比在pH7.4时也以浓度依赖性方式增加，这意味着呫吨酮的抗氧化活性也可能参与H+转移。事实上，在生理pH值下，酸度较弱的酚类羟基可能电离产生H+。例如，芒果苷已被证明是pKa16.52±0.006（25◦C）。在pH4.5时，其弱酸度可能被溶液H+离子抑制，因此其H+转移已降低。因此，与pH 7.4时相比，它在pH 4.5时表现出更高的IC50值（表1）。
为了进一步研究抗氧化机制，每种呫吨酮与PTIO•自由基一起孵育，随后使用UPLC−ESI−
Q−TOF−MS/MS分析反应产物。表1中的结果表明，这些呫吨酮中的大多数产生了二聚体产物。例如，在与PTIO•自由基孵育后，异孵红素产生异椴红素-异椿株二聚体，其在负离子模型下显示初级MS峰（m/z649）。进一步观察到该初级MS峰切割以产生m/z323和324（表1）。基于这些MS光谱数据和以往的工作，可以提出异加孕素的二聚反应如图4A所示;而质谱解析如图4所示。
图4 王各Isojacareubin与PTIO•（A）和MS光谱阐明（B）的可能反应（m/z值表示为整数;精确的m/z值）
在所提出的反应（图4）中，7-和7'-位置之间的共价键连接了两个异芸香红素自由基（III），以产生一个异芸香红素-异芸香红素二聚体（IV）。二聚体的产生可以被认为是ET加H+转移的结果（图4）。如果没有 H+转移，则产品中没有m/z 649的峰值。另一方面，如果只有H+转移而没有ET，就会有一个苯氧基阴离子;然而，两个苯氧基阴离子不能通过共价相互结合。因此，来自UPLC−ESI−Q−TOF−MS/MS分析的证据可以进一步验证ET加H+-转移的发生。值得一提的是，（i）二聚化反应可能比图4中的二聚反应更复杂，共价键也可以与其他位置相连。然而，毫无疑问，二聚体异jacareubin-isojacareubin是形成的。（ii）唯一没有产生二聚体产物的呫吨酮是含有两种糖残基的新芒果苷（表1）。这可以归因于两种糖残基具有巨大的取代基，并可能阻碍自由基加合物的形成（RAF）电位。然而，RAF产品得到了早期文献的支持，在那里它被称为非自由基产品。2.2 酚羟基的抗氧化作用：来自PTIO•-清除测定的证据
比色法的结果表明，16个H+转移（或ET）电位存在很大差异（表1）。在pH 4.5时，IC50
的值从36.0 μM到681.2 μM不等。特别是，在pH 4.5时，前12种呫吨酮（1-12,IC50 =36.0-121.3 μM，pH=4.5）与后4种呫吨酮（13-16,IC50 =284.2-681.2 μM，pH=4.5,表1）之间存在明显的差距。后四种呫吨酮既不含有对二羟基，也不含有邻二氧环己烷。在这种情况下，即使具有多个酚羟基，呫吨酮仍然表现出vry低高IC50值，例如新芒果苷（15）。新芒果苷的数据清楚地表明，对二羟基（或邻二羟基）在pH 4.5时的抗氧化活性中起关键作用;而单酚-羟基和met-二羟基型起的作用可以忽略不计。如表1所示，对二羟基和邻二呫吨酮根据pH 4.5时的IC50值被分类为强组一个典型的例子是在pH 4.5时为9对11;轻粉的功效与作用在pH 7.4下也观察到类似的情况。然而，在pH 7.4时，PTIO•-清除已被提到由H +转移介导。因此，可以推断出对二羟基或邻接二羟基可能类似地控制ET加H+转移电位。
进一步的分析表明，邻位二羟基可分为3种类型，即5,6-二氧合物（例如，7,9和10），6,7-二羟基（例如，1,2,4,5,8和12）和7,8-二羟基（例如，6）。 3种呫吨酮（1,6,7-三羟基呫吨酮（5），1,2,5-三羟基呫吨酮（6）和1,5,6-三羟基呫吨酮（7））的IC50值在pH 4.5时没有显着差异（拌小白菜p>0.05），这表明邻位二羟基位置（5,6,6,7-位置或7,8位置）没有影响抗氧化活性。这个建议可以部分解释一对呫吨酮的相似性：去甲苯甲嘧啶（8）及其异构体1,
3,5,6-四羟基呫吨酮（9）。如表1所示，在PTIO•清除比色分析中，在pH 4.5下，IC50值在pH 4.5时没有显着差异（p>0.05）。在PTIO•清除UPLC−ESI−Q−TOF−MS/MS分析中，去甲状旁腺醇及其异构体产生了一系列类似的MS峰（表1）。根据MS光谱的阐明，推测这两种异构体经历了类似的二聚反应。
