光 合 关 键 酶 的 测 定 方 法
一、酶液的制备
取植物样品0.5g左右放入用液氮预冷的研钵中，迅速研磨成粉末状，加入3.0ml（w/v为1：6）预冷的100 mM Tris-H2SO4提取缓冲液【PH 8.2，内含7.0 mM 巯基乙醇，1.0 mM EDTA-Na（乙二胺四乙酸钠盐），5% 甘油和1% 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）】，混匀后在4℃下反应20min，混合液于4℃下15000 r/min离心15min，取上清液备用。
二、RUBPC活性的测定方法（参照Racker方法并略加改动）
反应混合液（总体积3.2 ml）组成：0.1 M Tris-HCl缓冲液 (pH 8.0)、0.1 M MgCl2立项处女座和天秤座合适吗、50 mM腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、洗澡怎么读50 mM二硫苏糖醇（DTT）、2.0 mM NADH、1.0 mM EDTA-Na各0.3 ml，200 µM NaHCO3 0.1ml，蒸馏水1.0ml，3-磷酸甘油酸激酶（PGK）/3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAP-DH）（15u/15u） 0.1ml，酶提取液0.1ml ，30℃恒温水浴预温10 min，将反应体系摇匀倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，于340nm下测吸光度值E0，最后加入9.0 mM 1，5-二磷酸核酮糖（RuBP） 0.1ml启动反应，立刻每隔10～15s间隔测定光吸收的变化。
三、PEPC活性的测定方法（施教耐等方法）
反应液总体积3.1 ml，内含1.0 ml 0.1 M Tris-H2SO4 (pH 9.2)，1.0 ml酶提取缓冲液，0.1ml 10 mM MgCl2，0.1ml 10 mM NaHCO3，0.2 ml 40 mM磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），0.3ml 1.0 mg/ml NADH，过量的苹果酸脱氢酶（MDH，约10.5U）0.2 ml，于28℃水浴预温10min，用高考诗词0.2 ml PEPC提取液启动反应，迅速在340nm下测吸光度的下降。
酶活性测定反应液组成：
注：参考文献――董永华等，ABA和6-BA对水分胁迫下玉米幼苗碳素同化关键酶的影响。植物营养与肥料学报，1997，3（2）：182－187.
四、RUBPC和PEPC活性测定操作步骤
操作流程如下：
说 明：
1. RUBPC反应液（2.9 ml）包括：0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)、0.1 M MgCl2、伟库网50 mM ATP、50 mM DTT、2.0 mM NADH、1.0 mM EDTA-Na各0.3 ml，200 µM NaHCO3 0.1
ml，蒸馏水1.0ml。
2. PEPC反应液（2.5 ml）包括：1.0 ml 0.1 M Tris-H2SO4 (pH 9.2)，1.0 ml酶提取缓冲液，0.1ml 10 mM MgCl2，0.1ml 网球比赛规则10 mM NaHCO3，0.3ml 1.0 mg/ml威宁地震 NADH。
3. 上述两种反应液的配制方法是：先按要求的浓度配制各组分试剂溶液，然后根据各试剂的体积按比例混合而成。
4. 为减小实验误差，粗酶液提取出来后，应先测RUBPC活性，其次测PEPC活性，最后测定可溶性蛋白含量。
可溶性蛋白的测定
反应液配制：0.1克G-250溶于50毫升90%乙醇(用无水乙醇加水兑成)中，加入100毫升85%磷酸，定容至1000毫升，过滤。(配制时要避光)(1000ml反应液可做330个样品)
测定：20ūl酶液+3ml G-250放置2分钟，595纳米比色，同时做空白（20微升缓冲液+3毫升G-250）。
结果计算：可溶性蛋白（mg/Gfw）=(C×V/Va)/W
C为查标准曲线值，V为提取液总体积(ml)，秦时明月汉时关Va为测定时加样量(ml)，W为样品鲜样重(g)
用牛血清蛋白配制标准液：100mg牛血清蛋白溶于100ml蒸馏水，即为1000ug/ml的原液。
90%乙醇：90ml无水乙醇+10ml蒸馏水
85%磷酸：170磷酸+30ml蒸馏水
