哌嗪-2-羧酸单一对映体产生菌的筛选与鉴定
支票存根
吕志堂;时佩佩;郭晓东;徐长源;石楠孕妇可以吃雪梨吗
【摘 要】Five strains that can lectively biotransform the racemic (l?,S)-piperazine - 2 - car-boxamide to produce single enantiomers were obtained by enrichment and lective isolation, of which 4 strains could produce (S)- piperazine - 2 - carboxylic acid and one strain produce (i?)~ piperazine - 2 - carboxylic acid. The strains were identified to species or genus level by the intergrated results of 16S rDNA phylogenetic analys, morphology and culture characteristics, as well as physiological and biochemical features. Strains 412 and 437 could be identified as Acinetobacter Ixvoffii and Acinetobacterjunii, respectively; Strains 211 and 610 belonged to Brevundimonas, and strain 416 belonged to Pudomonas.%经选择性富集、分离得到4株可以选择性转化(R,S)-哌嗪-2-甲酰胺产生(S)-哌嗪-2-羧酸单一对映体的菌株和1株可以选择性转化(R,S)-哌嗪-2-甲酰胺产生(R)-哌嗪-2-羧酸单一对映体的菌株.通过基于16S rDNA序列分析的系统发育分析和形态培养特征观察、生理生化特征分析对试验菌株进行鉴定,结果表明:菌株412和437分别属于鲁氏不动杆菌(Acinet
obacter lwoffii)和琼氏不动杆菌(Acinetobacterjunii),菌株211和610属于短波单胞菌属(Brevundimonas)、菌株416属于假单胞菌属(Pudomonas).
【期刊名称】《河北农业大学学报》
【年(卷),期】2012(035)003
【总页数】6页(P69-74)两性氢氧化物
两只老虎英文版
【关键词】哌嗪-2-羧酸单一对映体产生菌;筛选;鉴定
【作 者】吕志堂;时佩佩;郭晓东;徐长源;石楠
【作者单位】河北大学生命科学学院河北省微生物多样性研究与应用实验室,河北保定071002;河北大学生命科学学院河北省微生物多样性研究与应用实验室,河北保定071002;河北大学生命科学学院河北省微生物多样性研究与应用实验室,河北保定071002;河北大学生命科学学院河北省微生物多样性研究与应用实验室,河北保定071002;河北大学生命科学学院河北省微生物多样性研究与应用实验室,河北保定071002
象棋攻略
【正文语种】中 文俄罗斯西部军区
【中图分类】Q93
identification
哌嗪-2-羧酸是一种非常重要的手性药物中间体，单一对映体及其衍生物具有多种药物活性，可作为多种有抗癌作用基团的载体。（S）-哌嗪-2-羧酸可用来合成治疗艾滋病的药物佳息患（Crixi-van）［1］、治疗心脏病的曲氟嗪药物（Draflazine）和抗癌药物中间体 N－甲基-D-天冬氨酸酯和等［2］；（R）-哌嗪-2-羧酸可用来合成金属蛋白酶抑制剂［3］，对于抑制肿瘤的侵袭转移起重要作用。目前生产上使用的是化学拆分法，但化学拆分工艺复杂，效率低［4］；亦有微生物和酶法拆分法研究的报道，土生克雷伯氏菌（Klebsiella terrigena）DSM 9174和伯克霍尔德氏菌（Burkholderia sp.）DSM 9925可分别选择性转化（R，S）-哌嗪-2-甲酰胺产生（S）-哌嗪-2-羧酸和（R）-哌嗪-2-羧酸，但这2株菌的生物安全性较差，转化底物浓度低（2.2%），转化周期长（72 h）［1］；商品酶 Alcala和产氮假单胞菌（Pudomonas azotoformans）IAM 1603也可专一性拆分产生（S）-哌嗪-2-羧酸，但分别需要底物哌嗪-2-叔丁酰胺和methyl-4-tertbutyroxycarbonyl- pip
erazine-2-carboxylate 作为拆分前体，它们的合成复杂、价格昂贵［5－6］。因此得到生物安全性高、可拆分简单底物的哌嗪-2-羧酸单一对映体产生菌具有重要的应用价值。在以往研究中曾筛选得到可拆分外消旋哌嗪-2-甲酰胺产生哌嗪-2-羧酸单一对映体的短波单胞菌（Brevundimonas sp.）210、假 单 胞 菌 （Pudomonas sp.）418［7］和假单胞菌X1［8］，其中只有假单胞菌X1的拆分效率较高。本文进一步从白洋淀底泥样品分离筛选得到5株哌嗪-2-羧酸单一对映体产生菌，确定了其分类地位，以期从分类学角度为筛选生物安全性和拆分效率高的生产菌种奠定基础。
1.1.1 样品来源 2007年7月25日采自白洋淀枣林庄、鸳鸯岛和烧车淀的底泥样品共3份。
1.1.2 培养基 ①富集／分离培养基：苹果酸钠6.6 g，（R，S）-哌嗪-2-甲酰胺 2 g，K2 HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2 O 0.2 g，NaCl 0.1 g，酵母提取物0.2 g，FeCl3·6H2 O 0.015 g，无离子水1 000 m L，p H 7.0。在每升富集培养基中加入16 g琼脂粉即得分离培养基。②营养肉汤／营养琼脂培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，无离子水1 000 m L，p H 7.2。在每升菌体收集培养基中加入16 g琼脂粉即得营养琼脂培养基，用于传代培养。洞察近义词
1.1.3 主要试剂 （R，S）-哌嗪-2-甲酰胺、（S）-哌嗪－2－羧酸二盐酸盐、（R）-哌嗪-2-羧酸二盐酸盐（石家庄瑞凡科技有限公司惠赠，含量＞98.5%），硅胶G60（青岛海洋化工厂），Taq DNA聚合酶（上海生物工程有限公司），其余试剂均为国产分析纯试剂。
1.2.1 富集与分离 将5 g样品加入到盛有100 m L富集培养基的三角瓶内，在温度28℃，200 r／min条件下振荡富集培养48 h。富集培养液梯度稀释后用分离培养基平板进行涂布分离，28℃培养72 h后挑取单菌落。
1.2.2 活性菌株的筛选 利用装有4 m L营养肉汤培养基的16 mm×160 mm试管，28℃、200 r／min振荡培养48 h，5 000 r／min离心10 min收集菌体，0.1 mol／L，p H 7.0的磷酸缓冲液洗涤1次后将菌体置于（R，S）-哌嗪-2-甲酰胺浓度为4.0%的磷酸缓冲液中，28℃、200 r／min转化24 h。5 000 r／min离心10 min去除菌体，得到上清即转化液。
初筛采用薄层层析法（TLC）［1］，TLC不能判断产物的旋光性。
采用测定产物旋光性的方法进行复筛，产物制备方法同文献［1］。将产物干燥后配制成1.0%的水溶液，用自动旋光仪（上海精科，WZZ-1）测旋产物的旋光度。
1.2.3 活性菌株的鉴定 DNA提取采用Marmur建立的方法［9］，参考文献［10］描述的方法进行16S rDNA扩增。引物的合成和PCR产物的测定由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。将所得序列采用BLAST与GenBank中的核酸序列进行同源性比对，并选取与其同源性较高的模式菌株序列，用Bio Edit7.0软件中的Clustal W进行多重序列比对，利用MEGA 4.1构建邻接法 （NJ）系统发育树并进行bootstrap稳定性验证。
将各试验菌株在营养琼脂培养基平板上划线培养出单菌落，进行形态和培养特征观察。根据IJSEM新种发表原始文献选择生理生化性状［11－12］，参照《常见细菌系统鉴定手册》［13］进行测定。
共从3份白洋淀底泥样品中分离得到95株可以（R，S）-哌嗪-2-甲酰胺为唯一氮源生长的菌株，经TLC初筛得到可转化（R，S）-哌嗪-2-甲酰胺产生哌嗪-2-羧酸的菌株17株（图1，结果未全部显示），选择转化活性较高的10株进行复筛，得到可产生哌嗪-2-羧酸单一对映体的菌株5株，其中菌株211、412、437和610可选择性将底物中（S）-哌嗪-2-甲酰胺转化为（S）-哌嗪-2-羧酸，菌株416可选择性将底物中（R）-哌嗪-2-甲酰胺转化为（R）-哌嗪-2-羧酸（表1）。
2.2.1 活性菌株的系统发育地位 5株菌株的16S r DNA序列在GenBank的注册号分别为EU841502（211）、EU841483 （412）、EU841539（416）、EU841484（437）和EU841504（610），它们与系统发育上相关菌株构建的系统发育树如图2～4所示。
菌株412，437在系统发育上属于不动杆菌属（Acinetobacter）。菌株412与鲁氏不动杆菌（A.lwoffii）处于同一分支，序列同源性为99.92%。菌株437与琼氏不动杆菌（A.junii）处于同一分支，16S r DNA序列完全相同（图2）。鉴于该属已知种间16S r DNA序列同源性均低于99%，所以在系统发育上菌株412和437分别应归入鲁氏不动杆菌和琼氏不动杆菌。
菌株211，610在系统发育上属于短波单胞菌属（Brevundimonas）。菌株211与土生短波单胞菌（B.terrae）同处于一个分支，16S r DNA序列相似性99.36%；菌株610与缺陷短波单胞菌（B.diminuta）的相似性最高，为99.28%（图3）。菌株211和菌株610与之前报道的短波单胞菌210（EU841501）［8］的 16S r DNA 序 列 同 源 性 分 别 为99.28%和99.20%。因该属某些已知种之间即使16S r DNA序列同源性很高，也构成了分类学上的独立种，如那斯达短波单胞菌（B.nasdae）GTC 1043 T和中间短波单胞菌（B.intermedia）ATCC 15262T的16S r DNA序列同源性高达99.84%，因此菌株211和610都应属于短波单胞菌属的新种水平分类单元。
菌株416在系统发育上属于假单胞菌属（Pudomonas），与嗜碱假单胞菌（P.alcaliphila）序列相似性最高，为99.02%（图4）。与之前报道的2株假单胞菌菌株418（GenBank注册号EU841537）［7］和菌株X1（GenBank注册号EU841536）的16S rDNA序列同源性分别为98.64%和98.26%。同样，鉴于该属某些已知种间16S r DNA序列同源性也极高，如嗜碱假单胞菌AL15-21 T和假产碱假单胞菌（P.pudoalcaligenes）LMG 1225 T 序列相似性为99.62%，因此菌株416应属于假单胞菌属新种水平分类单元。
淘宝开店心得2.2.2 活性菌株的形态、培养特征和生理生化特性菌株412：G－短杆菌，1μm×1.5μm。无芽孢，无鞭毛。在营养琼脂平板上28℃培养24 h菌落呈圆形，凸起，表面光滑湿润，边缘整齐，白色至微黄色。液化明胶，发酵葡萄糖产酸，不利用L-Leu、L-His和L-Phe。其形态、培养特征与系统发育关系最近的鲁氏不动杆菌DSM 2403T一致，仅液化明胶特性不同，说明菌株412应是鲁氏不动杆菌的一个新菌株，这与系统发育分析结果是一致的。菌株437：G－短杆菌，1.1μm×2.0μm。无芽孢，无鞭毛。在营养琼脂平板上28℃培养24 h菌落呈圆形，凸起，表面光滑湿润，边缘整齐，乳白色至微黄色。不液化明胶，发酵葡萄糖不产酸，不利用L-Leu、L-His和LPhe。其形态、培养特征及生理生化特性与琼氏不动杆菌DSM 6964T完全相同，和系统发育分析结果一致（序列相似性100%）。
