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第４７卷第３期东㊀北㊀林㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报
Ｖｏｌ.４７Ｎｏ.３２０１９年３月ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＮＯＲＴＨＥＡＳＴＦＯＲＥＳＴＲＹＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＭａｒ.２０１９
１)国家自然科学基金项目(３１４７０６６８ꎻ３１６７０６７１)ꎻ国家林业公益性行业科研专项项目(２０１１０４０５４)ꎮ
第一作者简介：周科ꎬ男ꎬ１９９４年１０月生ꎬ北京林业大学生物科学与技术学院ꎬ硕士研究生ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｚｈｏｕｋｅ＠ｂｊｆｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
通信作者：王延伟ꎬ北京林业大学生物科学与技术学院ꎬ副教授ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｙｗｗａｎｇ＠ｂｊｆｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
㊀㊀㊀㊀贺伟ꎬ北京林业大学林学院ꎬ教授ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｈｅｗｅｉ＠ｂｊｆｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
人性的善恶
收稿日期:２０１８年６月２９日ꎮ责任编辑：程㊀红ꎮ
杨树受溃疡病菌侵染初期的转录组
１)
周科㊀徐千惠㊀霍晓薇㊀王延伟㊀贺伟
(北京林业大学ꎬ北京ꎬ１０００８３)
㊀㊀摘㊀要㊀欧美杨细菌性溃疡病是一种对杨树人工林造成严重损害的新型枝干病害ꎮ为探讨杨树抵御该病害的分子机制ꎬ分别以染病初期和未染病的中林４６杨(Ｐｏｐｕｌｕｓˑｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａ Ｚｈｏｎｇｌｉｎ４６ )树皮组织为材料开展了转录组测定和分析ꎮ基因差异表达结果表明ꎬ２５９７个基因在中林４６杨受到溃疡病菌侵染初期发生变化ꎬ其中１４１２个基因表达上调ꎬ１１８５个基因表达下调ꎮ表达量变化最大的前２０个基因包含了编码锌指蛋白㊁漆酶㊁内切几丁质酶㊁胰蛋白与蛋白酶抑制剂等与抗病相关的基因ꎮ差异表达基因的ＧＯ注释和ＫＥＧＧ通路富集性分析进一步表明ꎬ类黄酮和苯丙烷类物质在杨树抵御病原菌侵染的初期起了一定作用ꎮ有趣的是ꎬ发现维生素Ｂ６代谢㊁有机含硒化合物代谢和苯并恶嗪生物合成通路等抗病相关通路的差异表达基因在染病初期全部或绝大部分受到诱导ꎮ
关键词㊀杨树ꎻ欧美杨细菌性溃疡病ꎻ转录组分类号㊀Ｓ７９２.１１９ꎻＱ５２２＋.６
按图索骥的故事
ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｏｆＰｏｐｌａｒｓｗｉｔｈＥａｒｌｙＲｅｓｐｏｎｓｅｔｏＬｏｎｓｄａｌｅａｑｕｅｒｃｉｎａｓｕｂｓｐ.ｐｏｐｕｌｉＩｎｆｅｃｔｉｏｎ//ＺｈｏｕＫｅꎬＸｕＱｉａｎ￣ｈｕｉꎬＨｕｏＸｉａｏｗｅｉꎬＷａｎｇＹａｎｗｅｉꎬＨｅＷｅｉ(ＢｅｉｊｉｎｇＦｏｒ
莲藕的功效与作用
ｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００８３ꎬＰ.Ｒ.Ｃｈｉｎａ)//ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈ￣ｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２０１９ꎬ４７(３):１００－１０６.
Ｌｏｎｓｄａｌｅａｃａｎｋｅｒｏｆｐｏｐｌａｒｉｓａｎｅｗｔｙｐｅｏｆｃａｎｋｅｒｄｉｓｅａｓｅｔｈａｔｃａｕｓｅｓｓｅｖｅｒｅｄａｍａｇｅｔｏｐｏｐｌａｒｐｌａｎｔａｔｉｏｎ.ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｆｅｎｓｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｐｏｐｌａｒｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏＬｏｎｓｄａｌｅａｃａｎｋｅｒꎬｔｈｉｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓｅ￣ｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｔｈｅｂａｒｋｏｆＰｏｐｕｌｕｓｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａ Ｚｈｏｎｇｌｉｎ４６ ｉｎｆｅｃｔｅｄｏｒｎｏｔｗｉｔｈＬｏｎｓｄａｌｅａｑｕｅｒｃｉｎａｓｕｂｓｐ.ｐｏｐｕｌｉ.Ｔｈｅｒｅ￣ｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ２５９７ｇｅｎｅｓｏｆｐｏｐｌａｒｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｃｈａｎｇｅｄａｔｔｈｅｅａｒｌｙｓｔａｇｅｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｐｏｐｌａｒｓ.Ａｍｏｎｇｔｈｅｓｅｇｅｎｅｓꎬ１４１２ｇｅｎｅｓｗｅｒｅｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｗｈｉｌｅ１１８５ｇｅｎｅｓｗｅｒｅｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ.Ｔｗｅｎｔｙｇｅｎｅｓｗｉｔｈｔｈｅｍｏｓｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒ￣ｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｂｕｎｄａｎｃｅｉｎｃｌｕｄｅｄｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｐｒｏｔｅｉｎ
ｓꎬｌａｃｃａｓｅꎬｅｎｄｏｃｈｉｔｉｎａｓｅꎬｔｒｙｐｓｉｎａｎｄｐｒｏｔｅａｓｅｉｎ￣ｈｉｂｉｔｏｒａｎｄｏｔｈｅｒｇｅｎｅｓｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ.ＧＯａｎｎｏｔａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＫＥＧＧｐａｔｈｗａｙｏｆｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ(ＤＥＧｓ)ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｆｌａｖｏｎｏｉｄａｎｄｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｓｈｏｕｌｄｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｄｅｆｅｎｓｅｒｅ￣ｓｐｏｎｓｅｏｆｐｏｐｌａｒｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｔｔｈｅｅａｒｌｙｓｔａｇｅ.ＩｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇｌｙꎬｗｅｆｏｕｎｄｔｈａｔａｌｌｏｒｍｏｓｔｏｆｔｈｅＤＥＧｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｒｅ￣ｓｉｓｔａｎｃｅ￣ｒｅｌａｔｅｄｐａｔｈｗａｙｓｓｕｃｈａｓＶｉｔａｍｉｎＢ６ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍꎬｓｅｌｅｎｏｃｏｍｐｏｕｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｂｅｎｚｏｘａｚｉｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙｓｏｆｐｏｐｌａｒｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄａｔｔｈｅｅａｒｌｙｓｔａｇｅｏｆｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＰｏｐｕｌｕｓꎻＬｏｎｓｄａｌｅａｃａｎｋｅｒｏｆｐｏｐｌａｒꎻＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ
㊀㊀中国的杨树人工林种植面积巨大ꎬ已持续多年位居世界第一ꎬ其中ꎬ１０７杨和中林４６杨等欧美杨杨树品种因良好的材性和速生能力在我国北方大面
积种植ꎮ然而ꎬ２００５年在河南省濮阳市４年生中林４６杨(Ｐｏｐｕｌｕｓˑｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａ Ｚｈｏｎｇｌｉｎ４６ )林地发现一种对杨树造成严重损害的新型枝干溃疡病 欧美杨细菌性溃疡病ꎬ这是该病害被发现于我国杨树人工林当中的最早记录ꎮ研究表明ꎬ１０７杨(Ｐ.ˑｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａ ７４/７６ )和中林４６杨均是该病原菌的易感树种ꎬ而中林４６杨的病害情况更加严重[１]ꎮ欧美杨细菌性溃疡病的病原菌为Ｌｏｎｓｄａｌｅａｑｕｅｒｃｉｎａｓｕｂｓｐ.ｐｏｐｕｌｉꎬ主要危害症状为早期树干形成层被破
坏ꎬ随后树皮开裂并伴有大量汁液从中流出ꎬ树干韧皮部局部坏死并在相同部位出现组织肿胀ꎬ同时部分细枝顶梢坏死ꎬ从而对杨树产生严重的损伤并造成树木材积和其他可用部分减少ꎮ
目前对欧美杨细菌性溃疡病的研究虽然已有一定报道ꎬ但是主要集中在早期病原菌鉴定和不同杨树品种的抗性鉴定及防治等方面[２]ꎮＹａｎｇｅｔａｌ.对病原菌Ｌｏｎｓｄａｌｅａｑｕｅｒｃｉｎａｓｕｂｓｐ.ｐｏｐｕｌｉ进行了突变研究ꎬ发现了病原菌中１９个控制细菌毒性的双组分信号转导系统基因[３]ꎮ刘振阳等研究了水杨酸(ＳＡ)和茉莉酸(ＪＡ)信号转导的１２个相关基因在杨树接种欧美杨细菌性溃疡病菌后的表达变化ꎬ发现其在杨树不同抗性品种间存在显著差异ꎬ抗性品种中ＰＲ１－１和ＰＲ１－２等基因的诱导和基因ＣＯＩ１－１㊁ＣＯＩ１－２和ＪＡＺ１的抑制可开启ＳＡ和ＪＡ信号通路进而影响品种抗性[４]ꎮ儿茶素对病菌有较强的抑制作用ꎬ左涛等以感染欧美杨细菌性溃疡病菌后的杨树为材料克隆了儿茶素形成步骤中的二氢黄酮醇－４－还原酶和无色花色素还原酶２个关键酶
基因ꎬ在杨树和烟草中进行了转基因研究ꎬ发现这２个基因
均能影响儿茶素的合成[５－６]ꎮ上述结果为杨树对欧美杨细菌性溃疡病菌侵染响应分子机制的研究提供了较好的理论探索ꎬ但这些研究仅限于病原菌的致病相关基因或杨树中部分抗病相关基因的分析ꎬ而植物对病菌侵染的防御反应涉及多种途径和基因的调控ꎬ有必要进一步系统地鉴定杨树中参与欧美杨细菌性溃疡病胁迫响应的多种基因ꎬ以揭示杨树抗病的分子机制及挖掘重要的抗病基因及调控功能ꎮ植物被病原菌侵染后ꎬ基因和蛋白质的表达水平通常会发生一定变化ꎬ而植物细胞内基因表达水平的变化则明显早于病症的出现ꎬＳｏｃｑｕｅｔ－Ｊｕｇｌａｒｄｅｔａｌ.在研究树生黄单胞菌李变种(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓａｒ￣ｂｏｒｉｃｏｌａｐｖ.ｐｒｕｎｉ)侵染时ꎬ发现在桃树上接种病菌后２ｈ时有３４个基因发生了差异表达ꎬ１２ｈ时２６３个基因发生了差异表达ꎬ说明在染病早期木本植物的基因表达就会发生较大差异[７]ꎮ此外ꎬ由于欧美杨细菌性溃疡病对杨树造成的危害很大且不可逆ꎬ增强其自身染病初期的抗性很有必要ꎮ转录组测序已广泛用于植物抗逆反应相关基因的研究ꎬ近年来在李(Ｐｒｕｎｕｓｓａｌｉｃｉｎａ)㊁柑橘(Ｃｉｔｒｕｓｊｕｎｏｓ)等木本植物的抗逆研究中已有较多应用[８－９]ꎮ所以ꎬ本研究通过转录组测序的手段来探究杨树染病初期基因表达的整体变化情况ꎬ鉴定差异表达的基因ꎬ并结合ＧＯ注释和ＫＥＧＧ富集性分析鉴定杨树抵御细菌性溃疡病的相关基因ꎬ以期为林木抗病分子机制研究提供一定参考ꎬ为林木抗病分子育种提供候选基因ꎮ１㊀材料与方法
１.１㊀材料与接种方法
将Ｌ.ｑｕｅｒｃｉｎａＮ－５－１菌株(北京林业大学森林保护学教育部重点实验室提供)注入液态ＬＢ培养基中ꎬ在３０ħ条件下１８０ｒ ｍｉｎ－１震荡培养２４ｈ后使用ꎮ
杨树材料取自河南省濮阳市林业科学院苗圃的２年生中林４６杨无性系植株ꎬ试验组共用６棵杨树ꎬ将每棵杨树主干截成６段各３０ｃｍ的等长小段ꎮ表面用７５％酒精消毒后ꎬ再使用打孔器在每段的中央部位打出直径为６ｍｍ的小孔ꎮ然后用无菌棉蘸取Ｌ.ｑｕｅｒｃｉｎａＮ－５－１培养液放置于小孔内ꎬ最后用塑料膜包裹密封ꎮ接种菌液浓度为１０８菌落 ｍＬ－１ꎮ
接种后的茎段培养在温度为２８ħ㊁相对湿度９０％的人工气候箱中ꎬ１６ｈ光照８ｈ黑暗ꎬ每两天换水１次ꎮ对照组用无菌棉蘸取无菌水接种ꎬ其他试验条件保持一致ꎮ侵染后的第３天ꎬ除去密封的塑料膜和无菌棉ꎮ侵染后的第６天[２]ꎬ分别刮取杨树试验组紧邻发病组织下方１ｃｍˑ２ｃｍ的树皮样本(带有活的维管束细胞)ꎬ对照取类似部位的树皮ꎬ立即用液氮速冻并在冰箱中－７０ħ储存ꎮ
１.２㊀ＲＮＡ提取和转录组测序
使用本实验室提出的改良型试剂盒法ꎬ分别从对照组和试验组中提取树皮总ＲＮＡ[１０]ꎬｍＲＮＡ使用Ｏｌｉｇｏｄ(Ｔ)磁珠法富集后ꎬ用破碎缓冲液打碎成小片段(约２００ｎｔ)作为模板ꎬ用随机引物合成ｃＤＮＡꎮ双链的ｃＤＮＡ用磁珠进行纯化ꎬ紧接着进行最后的修复并在３ᶄ末端进行腺嘌吟的添加ꎮ最后将ａｄａｐ￣ｔｏｒ连接到打碎的片段上ꎬ进行ＰＣＲ以选择富集纯化片段ꎮ在华大基因使用
ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２０００对ｃＤＮＡ文库进行测序ꎮ
１.３㊀转录组测序的原始数据筛选
测序得到的原始数据首先进行去杂处理ꎮ去掉的序列主要包括:①包含接头的序列读取片段ꎻ②未知碱基的比例>１０％的序列读取片段ꎻ③质量值Ｑɤ５的碱基数占整个序列读取片段的５０％以上的低质量序列读取片段ꎮ经筛选得到的序列读取片段被用于后续分析ꎬ使用ＳＯＡＰａｌｉｇｎｅｒ/ｓｏａｐ２将测序结果比对到毛果杨基因组(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ.ｎｅｔ/ｐｏｐ￣ｌａｒ.ｐｈｐＰｈｙｔｏｚｏｍｅｖ９.０ꎬＰｏｐｌａｒｖ３.０)[１１]ꎮ
１.４㊀差异表达基因筛选
用ＲＰＫＭ值来计算每个基因的表达量[１２]ꎮ基因差异表达计算公式为ｌｏｇ２[ＲＰＫＭ(接种)/ＲＰＫＭ(对照)]ꎬ以ＦＤＲɤ０.００１且ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏ的绝对值ȡ１作为差异表达基因的筛选标准[１３]ꎮ
１.５㊀差异表达基因的ＧＯ注释方法和ＫＥＧＧ分析方法
通过Ｂｌａｓｔ２ＧＯ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｂｌａｓｔ２ｇｏ.ｏｒｇ/)进行差异表达基因的ＧＯ注释[１４]ꎮ通过Ｐ值的邦费罗尼矫正(Ｐ<０.０５)来确定差异表达基因中显著富集的ＧＯ分类ꎬ使用带有Ｃ
ｌｕｅＧＯ插件(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｉｃｉ.ｕｐｍｃ.ｆｒ/ｃｌｕｅｇｏ/ｃｌｕｅｇｏＤｏｗｎｌｏａｄ.ｓｈｔｍｌ)的软件Ｃｙｔｏ￣ｓｃａｐｅ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｙｔｏｓｃａｐｅ.ｏｒｇ/)注释通路ꎮ通过ＫＥＧＧ数据库(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｅｎｏｍｅ.ｊｐ/ｋｅｇｇ/)来进行差异表达基因的通路富集[１５]ꎮＫＥＧＧ通路分析以Ｐ<０.０５且Ｑɤ０.０５作为显著富集的标准ꎮ
２㊀结果与分析
２.１㊀杨树转录组测序
芋头糕的做法家常做法广东对获得的数据进行预处理ꎬ过滤去除其中的接头序列㊁重复序列㊁低质量测序结果(５０％以上碱基质量评价值ɤ５)等数据ꎬ形成可直接用于转录组分
１０１
第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀周科ꎬ等：杨树受溃疡病菌侵染初期的转录组
析的测序数据ꎬ得到包含７５５８４３０个序列读取片段的对照组(ＢＫ)和７２４４８１３个序列读取片段的试验组(ＢＨ)ꎬ占各自文库的比例都为９９.４０％(图１)ꎬ用于后续分析ꎮ对照组的序列读取片段中能与杨树基因组匹配的总序列读取片段和唯一匹配序列读取片段分别为７６.１４％㊁６９.１４％ꎬ试验组的总序列读取片段和唯一匹配序列读取片段分别为７６.０１％㊁６９.０２％
(表１)ꎬ说明测序所得序列总的匹配性较好ꎬ可以用于后续的分析ꎮ
穿透是什么意思图１㊀染病初期和未染病的植株原始测序数据各成分所占比例表１㊀染病初期(ＢＨ)和未染病(ＢＫ)的植株测序序列读取片段对比
组㊀别
总序列
读取片段/个所占比例/％
可匹配序列
读取片段/个所占比例/％
唯一匹配序列
读取片段/个所占比例/％
多匹配序列
读取片段/个所占比例/％
不可匹配序列
读取片段/个所占比例/％
对照组(ＢＫ)７５５８４３０５７５４８７７７６.１４５２２６２２５６９.１４５２８６５２６.９９１８０３５５３２３.８６试验组(ＢＨ)７２４４８１３５５０６９５２７６.０１５０００１７８６９.０２５０６７７４６.９９１７３７８６１２３.９９
２.２㊀差异表达基因
为了鉴定杨树抵御溃疡病菌侵染的相关基因ꎬ进一步筛选了试验组和对照组之间差异表达的基因ꎬ共筛选出２５９７个差异表达基因ꎬ其中１４１２个基因表达上调ꎬ１１８５个基因表达下调(ＢＨ/ＢＫ)ꎬ表达上调的基因比表达下调的基因多１９.１６％ꎮ其中ꎬ表达量上调和下调最大的前１０个基因中(表２)ꎬ多数基因编码已知功能的蛋白质或者酶ꎬ如上调表达的基因中Ｐｏｔｒｉ.０１８Ｇ０６６９００(９.４５)编码锌指蛋白ꎬＰｏｔｒｉ.００５Ｇ２００６００(８.９９)和Ｐｏｔｒｉ.０１１Ｇ０７１１００(８.９３)均编码漆酶ꎬ下调表达的基因中Ｐｏｔｒｉ.００４Ｇ１８２１００(－１０.２３)编码内切几丁质酶ꎬＰｏｔｒｉ.０１９Ｇ００６９００(－１１.２４)编码胰蛋白与蛋白酶抑制剂ꎬ以往研究表明这些酶和蛋白质与抵御病菌侵染有一定的关系[１６－２３]ꎮ
表２㊀表达量上升和下降最大的前１０个基因
基因编号差异表达ｌｏｇ２(试验组/对照组)功能注释
Ｐｏｔｒｉ.００４Ｇ００７０００上调１０.４３(１ｏｆ１４)ＰＴＨＲ３３２２７:ＳＦ４－Ｆ１２Ｆ１.２１蛋白质
Ｐｏｔｒｉ.００９Ｇ１１４４００上调９.７７(１ｏｆ４)ＰＦ１０９５０－功能未知蛋白(ＤＵＦ２７７５)(ＤＵＦ２７７５)
Ｐｏｔｒｉ.０１８Ｇ０６６９００上调９.４５(１ｏｆ２)ＰＴＨＲ２３１１１//ＰＴＨＲ２３１１１:ＳＦ４１－锌指蛋白//未命名亚家族
Ｐｏｔｒｉ.００４Ｇ００７２００上调９.２６(１ｏｆ１４)ＰＴＨＲ３３２２７:ＳＦ４－Ｆ１２Ｆ１.２１蛋白质
Ｐｏｔｒｉ.００５Ｇ２００６００上调８.９９(１ｏｆ５)ＰＴＨＲ１１７０９:ＳＦ８８－漆酶－１４
Ｐｏｔｒｉ.０１１Ｇ０７１１００上调８.９３(１ｏｆ２)ＰＴＨＲ１１７０９:ＳＦ９４－漆酶－１５
Ｐｏｔｒｉ.００１Ｇ３９１１００上调８.８９氧化还原酶ꎻ与锌结合的脱氢酶家族蛋白ꎻ低相似度的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷
酸依赖性氧化还原酶(ζ－晶体蛋白同系物)Ｐ１(ＳＰ｜Ｑ３９１７２)(ｇｉ:８８６４２８)和Ｐ２(ＳＰ
｜Ｑ３９１７３)(ｇｉ:８８６４３０)ꎻ类似于锌的结合体
Ｐｏｔｒｉ.０１０Ｇ０４２７００上调８.８７(１ｏｆ６)２.３.３.８－三磷酸腺苷柠檬酸合成酶/柠檬酸裂解酶
Ｐｏｔｒｉ.００６Ｇ１０６９００上调８.６８与拟南芥中表达的蛋白相似ꎻ[Ａｔ３ｇ５６２２０和Ａｔ２ｇ４０４３５的共同同源基因]
Ｐｏｔｒｉ.０１３Ｇ１２９８００上调８.４６(１ｏｆ５)ＰＴＨＲ１３９３５:ＳＦ５３－含有基本螺旋－环－螺旋域的蛋白质
Ｐｏｔｒｉ.０１１Ｇ０４６６００下调－１１.３４丝氨酸羧肽酶Ｓ１０家蛋白族ꎻ类似于丝氨酸羧肽酶２的Ａ链和Ｂ链.(ＳＰ:
Ｐ０８８１９)(ＥＣ３.４.１６.６)(小麦属小麦)ꎻ[和基因Ａｔ４ｇ１５１００ꎬＡｔ１ｇ１１０８０ꎬＡｔ１ｇ６１１３０
同源]
Ｐｏｔｒｉ.０１９Ｇ００６９００下调－１１.２４(１ｏｆ３２)ＰＦ００１９７－胰蛋白酶和蛋白酶抑制剂(Ｋｕｎｉｔｚ＿ｌｅｇｕｍｅ)
Ｐｏｔｒｉ.００４Ｇ１８２１００下调－１０.２３(１ｏｆ６)ＰＴＨＲ２２５９５:ＳＦ３４－内切酶Ｂ
Ｐｏｔｒｉ.００４Ｇ０２００００下调－１０.０５(１ｏｆ６)ＰＴＨＲ３１３３８:ＳＦ１６－多聚酶环化酶/脱水酶和脂质转运蛋白质超家族蛋白Ｐｏｔｒｉ.００４Ｇ０２０１００下调－９.９６(１ｏｆ６)ＰＴＨＲ３１３３８:ＳＦ１６－多聚酶环化酶/脱水酶和脂质转运蛋白质超家族蛋白Ｐｏｔｒｉ.０１３Ｇ１００７００下调－９.９１(１ｏｆ４)ＰＴＨＲ２１２３４//ＰＴＨＲ２１２３４:ＳＦ３０－嘌呤核苷磷酸化酶//未命亚家族
Ｐｏｔｒｉ.００１Ｇ２３９７００下调－９.８７
Ｐｏｔｒｉ.０１３Ｇ１００８００下调－９.６８(１ｏｆ４)ＰＴＨＲ２１２３４//ＰＴＨＲ２１２３４:ＳＦ３０－嘌呤核苷磷酸化酶//未命亚家族
Ｐｏｔｒｉ.００５Ｇ０５１９００下调－９.５６
Ｐｏｔｒｉ.００９Ｇ０９１１００下调－９.５５(１ｏｆ８)ＰＦ０３２４２－一种胚胎形成后期大量
产生的蛋白质(ＬＥＡ＿３)
２０１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀东㊀北㊀林㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第４７卷
２.３㊀杨树差异表达基因的ＧＯ功能划分
将差异表达基因映射ＧＯ数据库ꎬ根据序列同源性ꎬ试验组和对照组之间２５９７个差异表达基因可以分为三大类总共４７个功能组ꎬ包括生物学过程㊁细胞组分和分子功能ꎮ结果显示：在生物学过程分类中ꎬ３个差异表达最大的功能组是新陈代谢过程(１１５１个差异表达基因)㊁细胞进程(９２９个差异表达基因)和刺激响应(４８３个差异表达基因)
(表３)ꎮ
表３㊀基于测序数据的差异表达基因ＧＯ功能
差异表达基因分类功能组差异表达基因/个生物学过程新陈代谢过程１１５１
细胞进程９２９
刺激响应４８３
单个有机体过程２５６
定位２４６
定位建立２３３
生物调节２２７
发育过程１６５
生物过程调控１５９
多细胞生物过程１４２
信号１３８
细胞成分组织或生物发生１１７
繁殖８３
繁殖过程７９
多有机体过程４５
死亡２０
免疫系统过程２０
生长１３
被动的生物学调控过程１０
主动的生物学调控过程６
运动１细胞组分细胞１０７８
细胞组成部分１０７８
细胞器８０７
隔膜４４７
隔膜组分２５８
细胞器组分２１４
高分子复合物８０
胞外区６８
膜封闭腔２４
膜外区部分５
细胞接合３
细胞外基质３
细胞外基质组分１分子功能催化活性１１５８
结合１０９２
转运活性１４０
核酸结合的转录因子活性１１２
分子转导活性５４
酶调控活性４１
抗氧化剂活性１８
结构分子活性１４
受体活性１０
电子载体活性１
蛋白结合的转录因子活性１㊀㊀在细胞组分分类中ꎬ３个差异表达最多的功能组是细胞(１０７８个差异表达基因)㊁细胞组成部分(１０７８个差异表达基因)和细胞器(８０７个差异表达基因)ꎮ在分子功能分类中ꎬ同样是３个功能组的差异表达基因较多ꎬ分别是催化活性(１１５８个差异表达基因)㊁结合(１０９２个差异表达基因)和转运活性(１４０个差异表达基因)ꎮ
空调安装为进一步探讨杨树在病原菌胁迫下差异表达基因的功能ꎬ将差异表达基因映射ＫＥＧＧ数据库ꎬ以Ｑɤ０.０５且Ｐɤ０.０５为显著富集的标准ꎬ共得到包括１４０７个差异表达基因ꎬ在２０条通路中显著富集(表４)ꎮ在这２０条通路中ꎬ有１２条与代谢相关ꎬ有５条与生物合成相关ꎬ剩余的３条分别是糖酵解
和糖质新生㊁细胞自然杀伤介导的细胞毒性㊁植物昼夜节律ꎮ差异表达基因数量最多的３条通路分别是新陈代谢通路[ｋｏ０１１００](４８２ꎬ３０.７％)㊁次生代谢物生物合成[ｋｏ０１１１０](３４８ꎬ２２.１７％)和类黄酮生物合成[ｋｏ００９４１](６４ꎬ４.０８％)ꎮ研究表明ꎬ次生代谢物包括类黄酮可参与植物抵御病原物的侵染ꎮ
表４㊀中林４６杨在病原菌胁迫下差异表达基因中显著富集的通路
通路名称编号
差异表
达基
因/个
占所有差异
表达基因的
比例/％
Ｐ值Ｑ值
次生代谢物生物合成ｋｏ０１１１０３４８２２.１７<０.０１<０.０１新陈代谢通路ｋｏ０１１００４８２３０.７０<０.０１<０.０１类黄酮生物合成ｋｏ００９４１６４４.０８<０.０１<０.０１氨基糖和核苷酸糖代谢ｋｏ００５２０４９３.１２<０.０１<０.０１半胱氨酸和蛋氨酸代谢ｋｏ００２７０３４２.１７<０.０１<０.０１植物昼夜节律ｋｏ０４７１２３９２.４８<０.０１<０.０１淀粉和蔗糖代谢ｋｏ００５００７０４.４６<０.０１<０.０１甘氨酸㊁丝氨酸和苏氨酸代谢ｋｏ００２６０２２１.４０<０.０１<０.０１硒化合物代谢ｋｏ００４５０１１０.７０<０.０１<０.０１苯丙氨酸代谢ｋｏ００３６０３５２.２３<０.０１<０.０１苯丙烷类生物合成ｋｏ００９４０６３４.０１<０.０１<０.０１苯丙氨酸㊁酪氨酸和色氨酸生物合成ｋｏ００９４０１６１.０２<０.０１０.０１氮代谢ｋｏ００９１０１５０.９６<０.０１０.０１自然杀伤细胞介导的细胞毒性ｋｏ０４６５０１４０.８９<０.０１０.０１糖酵解和糖异生ｋｏ０００１０２９１.８５<０.０１０.０１α－亚麻酸代谢ｋｏ００５９２２０１.２７<０.０１０.０１抗坏血酸和新陈代谢ｋｏ０００５３２２１.４０<０.０１０.０２苯乙烯类㊁二芳庚酸类和姜酚生物合成ｋｏ００９４５４２２.６８<０.０１０.０２丙酸代谢ｋｏ００６４０１５０.９６<０.０１０.０２半乳糖代谢ｋｏ０００５２１７１.０８０.０１０.０５２.４㊀生物合成相关的差异表达基因
在病原菌侵染初期ꎬ多个生物合成通路的基因表达发生了变化(表５)ꎬ显著富集的通路有类黄酮生物合
成㊁苯丙烷生物合成㊁苯丙氨酸㊁酪氨酸和色氨酸生物合成ꎬ芪类化合物㊁二芳基庚烷和姜醇生物合成ꎮ其中ꎬ以类黄酮生物合成通路和苯丙烷生物
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第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀周科ꎬ等：杨树受溃疡病菌侵染初期的转录组
合成通路差异表达基因数量最多ꎮ
表５㊀生物合成相关通路差异表达基因的数量差异
通路名称编号差异表达
基因/个
Ｐ值Ｑ值
类黄酮生物合成ｋｏ００９４１６４<０.０１<０.０１苯丙烷生物合成ｋｏ００９４０６３<０.０１<０.０１芪类化合物㊁二芳基庚烷和姜醇生物合成ｋｏ００９４５４２<０.０１０.０２类胡萝卜素生物合成ｋｏ００９０６２６０.１１０.３２玉米素生物合成ｋｏ００９０８２２０.０２０.０８黄酮和黄
酮醇的生物合成ｋｏ００９４４２１０.０２０.１０二萜生物合成ｋｏ００９０４１７０.０５０.１６苯丙氨酸㊁酪氨酸和色氨酸生物合成ｋｏ００４００１６０.０００.０１苯并恶嗪类生物合成ｋｏ００４０２１１０.０２０.１０角质㊁木栓质和蜡的生物合成ｋｏ０００７３１１０.７００.９６糖基磷脂酰肌醇锚定生物合成ｋｏ００５６３１１０.７２０.９７泛素和其他萜烯类－醌生物合成ｋｏ００１３０１００.２６０.４７异喹啉生物碱生物合成ｋｏ００９５０９０.０４０.１３油菜素内酯生物合成ｋｏ００９０５９０.２９０.５１托烷㊁哌啶和吡啶生物碱的生物合成ｋｏ００９６０８０.０３０.１３不饱和脂肪酸的生物合成ｋｏ０１０４０８０.１７０.４０脂肪酸生物合成ｋｏ０００６１８０.１９０.４１倍半萜类和三萜生物合成ｋｏ００９０９７０.３４０.５７类固醇生物合成ｋｏ００１００７０.５５０.８２异黄酮生物合成ｋｏ００９４３７０.７００.９６萜类骨架生物合成ｋｏ００９００７０.７００.９６单萜类生物合成ｋｏ００９０２６０.０８０.２５泛酸和ＣｏＡ生物合成ｋｏ００７７０６０.２５０.４７缬氨酸㊁亮氨酸和异亮氨酸的生物合成ｋｏ００２９０５０.１７０.４０硫代葡萄糖苷生物合成ｋｏ００９６６５０.３６０.５９鞘糖脂生物合成－神经节系列ｋｏ００６０４４０.１７０.４０吲哚生物碱的生物合成ｋｏ００９０１４０.３２０.５５
Ｎ－聚糖生物合成ｋｏ００５１０４０.８６１.００花色素苷生物合成ｋｏ００９４２２０.４００.６４氨酰生物合成ｋｏ００９７０２１.００１.００糖鞘脂质生物合成－ｇｌｏｂｏ系列ｋｏ００６０３１０.７７１.００叶酸生物合成ｋｏ００７９０１０.８６１.００２.５㊀差异表达基因呈一定趋势变化的通路
为了解析杨树抵御溃疡病菌侵染的关键基因及通路ꎬ逐条分析了差异表达基因(ＤＥＧｓ)映射在ＫＥＧＧ数据库中的参考通路ꎬ有趣的是ꎬ发现一些通路的差异表达基因表达变化存在相当一致的趋势(表６)ꎮ例如ꎬ在通路硒化合物代谢ꎬ叶酸参与的一碳单位ꎬ维生素Ｂ６代谢和苯丙氨酸㊁酪氨酸和色氨酸的生物合成中所有的差异表达基因相比对照组都呈现表达量上升的趋势ꎮ在通路半胱氨酸和蛋氨酸代谢ꎬ甘氨酸㊁丝氨酸和苏氨酸代谢ꎬ苯丙氨酸代谢ꎬ苯并恶嗪生物合成中ꎬ７７％以上的差异表达基因相对于对照组表达量上调ꎮ此外ꎬ发现氮代谢通路(６７％)和半乳糖代谢通路(７１％)中的大部分差异表达基因相对于对照组呈现表达量下调的趋势ꎮ３㊀结论与讨论
植物在其生命周期内会受到多种外界环境因素的影响ꎬ因其无法移动从而更易遭受多种外界环境胁迫ꎬ植物在长期进化过程中形成一系列的适应性机制来应对外界环境胁迫ꎮ植物在面临生物胁迫或非生物胁迫时ꎬ会激活多种机制从而使胁迫造成的伤害最小化ꎬ这些机制包括改变基因表达㊁蛋白合成㊁代谢过程和生理学过程[２４]ꎮ
表６㊀差异表达基因呈一定趋势变化的通路
通路名称
下调基
因/个
上调基
因/个
空调滤网清洗上调基因
比例/％苯丙氨酸㊁酪氨酸和色氨酸的生物合成０１６１００.００硒化合物代谢０１１１００.００维生素Ｂ６代谢０６１００.００叶酸参与的一碳单位０６１００.００苯并恶嗪生物合成１１０９０.９１甘氨酸㊁丝氨酸和苏氨酸代谢３１９８６.３６半胱氨酸和蛋氨酸代谢５２９８５.２９苯丙氨酸代谢８２７７７.１４氮代谢通路１０５３３.３３半乳糖代谢通路１２５２９.４１㊀㊀为探究杨树受细菌性溃疡病病菌侵染初期基因表达的差异情况ꎬ通过对试验组与对照组进行转录组测序ꎬ发现总计２５９７个差异表达基因ꎬ其中ꎬ１４１２个基因(５４％)表达上调ꎬ１１８５个基因(４６％)表达下调(ＢＨ/ＢＫ)ꎮＳｏｃｑｕｅｔ－Ｊｕｇｌａｒｄｅｔａｌ.在研究桃树受树生黄单胞菌李变种侵染初期１２ｈ的基因表达情况时ꎬ通过转录组测序发现１５７个基因(６０％)表达量下调ꎬ１０６个基因(４０％)表达量上调[７]ꎮＭｉｒａｎｄａｅｔａｌ.使用微阵列芯片分析杨树叶锈病菌(Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａｍｅｄｕｓａｅ)感染杨树第３天时ꎬ６３个基因(５７％)上调表达ꎬ４８个基因(４３％)下调表达[２５]ꎮ这些研究与笔者的结果相似ꎬ差异表达基因都呈现部分上调表达与部分下调表达的趋势ꎬ这说明在一些病原菌侵染木本植物的初期ꎬ木本植物会同时上调和下调一定数量基因的表达ꎮ本研究结果为
后续深入鉴定杨树抵御该病原菌侵染初期起作用的基因缩小了范围ꎬ也为探究杨树抗生物胁迫的分子响应机制奠定了一定基础ꎮ
在分析差异表达变化较大的基因时(表２)ꎬ鉴定到部分响应生物胁迫的差异表达基因ꎮ如在表达量上调的基因中Ｐｏｔｒｉ.０１８Ｇ０６６９００(９.４５)编码锌指蛋白ꎬ已有报道显示多种锌指蛋白与植物抗逆相关[１６－１８]ꎬ转Ｃ３Ｈ２Ｃ３型锌指蛋白基因的烟草有效增强了对烟草花叶病毒㊁野火病菌和烟粉虱的抗性[１９]ꎮＰｏｔｒｉ.００５Ｇ２００６００(８.９９)和Ｐｏｔｒｉ.０１１Ｇ０７１１００(８.９３)编码漆酶ꎬ有研究显示转漆酶基因的番茄(Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ)过表达后能通过改变氯原酸等酚类物质的含量而有效提高对丁香假单胞菌番茄变种(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ.ｔｏｍａｔｏ)
４０１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀东㊀北㊀林㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第４７卷
