第1卷第2期2008年 11月
水生态学杂志Journal o fH ydroecology Vo.l 1,No .2 Nov .,2008
收稿日期:2007-06-11
基金项目：广西科技攻关项目(桂科攻0322006-3A )。通迅作者：谢芝勋。E -m ai:l X i ez h i m
作者简介：谢丽基,1981年生，女，广西灵山人，助理研究员，主要从事动物传染病病原的分子生物学研究。
对虾I HHNV 荧光定量PCR 检测方法的建立
谢丽基1
，谢芝勋1
，庞耀珊1
，卢兆发2
，谢志勤1
，刘加波1
，邓显文1
，唐小飞
1
(1.广西兽医研究所，广西南宁 530001; 2.广西水产畜牧局，广西南宁 530022)
摘要：根据G enBank 中对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒(I HHNV )保守基因序列(AF218226)，设计合成了1对引物和1条T aq M an 探针，建立了检测I HHNV 的荧光定量PCR 技术。将建立的荧光定量PCR 检测方法与常规PCR 对比。结果显示，所建立的荧光定量PCR 方法灵敏度可达2个拷贝，比常规PCR 灵敏度高1000倍。对保存的15份经常规PCR 检测为I H HNV 阳性的DNA 样品进行荧光定量PCR 检测，结果都为阳性，检测的病毒含量为2.15@107~4.21@104拷贝/L L 。用该方法对不同浓度的样品进行了重复检测，表明该方法具有良好的重复性，可满足I HHNV 的临床诊断需要。关键词：对虾;I HHNV 病毒;PCR；检测
中图分类号:S945.1+9 文献标志码:A 文章编号:1674-3075(2008)02-0132-04
鲁滨逊漂游记
对虾传染性皮下及造血器官坏死病(Infecti o us hypoder m al and hae m atopoieti c necr osis ,I H HN )是由传染性皮下及造血器官坏死病病毒(I H HNV )引起
的，该病毒主要引起红额角对虾急性感染死亡，死亡率高达90%，还可以引起南美白对虾出现慢性/矮小残缺综合症0，导致患病对虾生长缓慢，表皮畸形(B ellT A &Lightner D V,1984)。国际兽疫局(O -f fice internati o na l despizooties ,O I E ,2003)水生动物疾病诊断手册中将该病定为须向其申报的甲壳类其它重要疾病之一。
近年来，我国对虾养殖业发展很快，其病害也日趋严重(俞开康等,2000)。实时荧光定量PCR 将PC R 与荧光检测方法相结合，具有操作简便、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，已成为动物病原检测的重要方法。目前，国内还没有应用实时荧光定量PCR 检测对虾I H HNV 的报道。本研究创建了Taqm an 实时荧光定量PCR (real-ti m e Taq M an-quantitati v e PCR)检测I H HNV 的方法，并与普通PCR 方法进行了比较，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
L i g h tcycler 2.0荧光定量PCR 仪(Roche)；荧光
定量PCR 试剂盒，购自Ta Ka R a 公司(大连)；质粒小量提取试剂盒购自北京B i o Dev 公司。1.2 质粒与阳性病料
p MD-I H HNV 阳性重组质粒由本室构建保存。I H HNV 阳性病料由本室保存，按照文献(庞耀珊,2005)的方法进行DNA 抽提。W SSV 、溶血弧菌及TSV 由本室保存。1.3 标准阳性模板的制备
参照质粒提取试剂盒说明，提取p MD -I H HNV 质粒，经紫外分光光度计测定D 260值，确定质粒DNA 的浓度,-20e 保存备用。1.4 荧光定量PCR 方法的建立
1.4.1 引物与Taq m an 探针的设计与合成 根据GenBank 中I H HNV 基因序列(AF 218226)中的保守片段，采用Pri m er Express 软件，设计1对特异引物和1条Taqm a m 探针，由Ta Ka R a 公司合成。
I H HNV(m od)53F :5-AGGAGACTCAAAC AC -CTTCCATCT-3
I H HNV(m od)130R:5-TGACTGATTCTGGGT -TCTTC GA -3
Taqm a m 探针序列:
I H HNV (m od )78T :5-FAM -CAAAACCT -CATCGGAA AGTCCTACGCTC TC -TAMRA -31.4.2 引物和探针浓度的筛选 应用质粒p MD -I H HNV 作为检测样品，将引物和探针配制成终浓度为0.2、014、0.6及0.8L m o l/L 进行荧光定量PCR，选择引物和探针的最佳浓度。
1.4.3 Real-ti m e PCR 扩增反应总体积为20L L，其中Rea l ti m e PCR Pre m ix 10L L，上、下游引物
及探针终浓度分别为0.6L m ol/L，模板2L L，余下
用灭菌DEPC水补足，均匀混合，置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。温度转换率为20e/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为:94e预变性10s；然后按94e 变性5s、60e退火延伸20s进行40个循环；最后于40e结束反应。
1.5敏感性试验与标准曲线的建立
用含有目的片段的质粒DNA作标准品,10倍系列稀释后进行荧光定量PCR，并与本实验室已建立的普通PCR进行比较(庞耀珊等,2005)。PCR结束后，取PCR反应液用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物。
1.6特异性、准确性和稳定性实验
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提取I H HNV、W SSV和溶血弧菌的DNA及TSV 的RNA(其中TSV提取RNA后经反转录为c D-NA)，并设空白对照，检测本方法的特异性。用1@ 108拷贝/L L和1@106拷贝/L L的I H HNV阳性样品，每个浓度分3个标本同时检测。通过计算C t值的标准差(S)和变异系数(C.V)来验证荧光定量PC R的批内重复性。3d后重复检测保存于-20e 的模板DNA，验证模板的稳定性及荧光定量PCR的批间重复性。
1.7临床病料的检测
利用建立的对虾I H HNV荧光定量PCR方法，检测本实验室保存的15份经常规PCR检测为I H H-NV阳性的病料DNA，评价其临床实用性。
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2结果
2.1p MD-I HHNV质粒DNA浓度的测定
提取的质粒DNA经核酸蛋白仪测定，其质量浓度为69.96L g/mL，所提质粒DNA溶液浓度可换算为3.9@1010拷贝/L L，稀释成1@1010拷贝/L L。2.2引物、探针浓度
不同的引物和探针终浓度试验结果显示，其对试验结果影响比较大，用0.6L m ol/L的引物和探针终浓度，对质粒标准品的检测可获得较小的C t值。
2.3标准曲线及灵敏度
以10倍系列稀释的标准质粒(1@109~1@100拷贝/L L)为模板进行扩增的标准曲线见图1，扩增的效率为1.738，加样误差为0.0453。荧光定量PC R和常规PCR的敏感性结果分别见图2、图3和表1。从图2中的荧光曲线可见,1@100拷贝/L L
仍有荧光曲线，表明该检测方法灵敏度为2个拷贝，比常规PCR高1000倍。
2.4特异性
对I H HNV、W SSV和溶血弧菌的DNA及TSV 的RNA经荧光定量PCR检测，只有I H HNV为阳性，而其它病料及阴性对照均为阴性。结果证实，该方法特异性强，与其它检测对象无交叉反应。
1-空白对照;2-1@100;3-1@101;4-1@102;5-1@103; 6-1@104;7-1@105;8-1@107;9-1@108;10-1@109拷贝/ L L;M-M ark er;11-空白对照;12-1@100;13-1@101;14-1@ 102;15-1@103;16.-1@104;17-1@105;18-1@107;19-1@ 108;20-1@109拷贝/L L。
图3Real-ti m e PCR和常规PCR扩增结果
F ig.3PCR produc t of R eal-ti m e PCR
and con ventional PCR
(R ea l-ti m e PCR:1~10，常规PCR:11~20)
表1I HHNV不同检测方法的敏感性
T ab.1Co m parison of the resu lts ob tai n ed
by the R ea l-ti m e PCR and convent i ona l PCR 检测方法
轮番而治
I HHNV DNA/拷贝#L L-1
1@1051@1041@1031@1021@1011@100普通PCR++----Real-ti m e PCR++++++注:/+0表示检查出结果为阳性;/-0表示为阴性。
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2008年第2期谢丽基等，对虾I H HNV荧光定量PCR检测方法的建立
2.5 准确性和重复性
用1@108拷贝/L L 和1@106
拷贝/L L 的I H H-NV 阳性样品，分别分为3个标本同时检测(图4),C t 值的标准差(S )分别为0.08和0.06，变异系数(C.V)分别为0147%和0.22%,3d 后重复检测保存于-20e 的模板DNA，其结果见表2。结果说明
此方法具有良好的准确性和重复性。
从左至右依次为1@108、1@108、1@108、1@106、1@106、1@106拷贝/L L 和空白对照。
图4 I HHNV R ea l-ti m e PCR 的批内重复性
婚姻恐惧症Fig .4 The resu lts of 3repetit i ou s detections by the sa m p l e
表2 Real-ti m e PCR 的批间重复性Tab.2 The resu lts of 3repetiti ou s detecti ons by 2d ifferent sa m p l es
模板浓度/拷贝#L L -1
同一模板检测日期的C t 12-0112-0412-07S C #V /%1@10816.8917.1617.080.140.821@106
26.99
27.11
27.12
0.07
得意门生是什么意思
0.25
2.6 临床病料的检测
对各15份经普通PCR 检测I H HNV 阳性的病
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料进行荧光定量PCR 。结果15份病料检测的结果在2.15@107
~4.21@104
拷贝/L L，其中普通PCR 强阳性样品在2.15@107
~3.57@106
拷贝/L L，普
通PCR 为弱阳性样品的在4.56@105~4.21@104
拷贝/L L 。
3 讨论
当前国内外对I H HNV DNA 检测方法有核酸探针，常规PC R (庞耀珊等,2005)。核酸探针存在着操作复杂、检测时间长、敏感度低等缺点，而常规的PC R 在操作和电泳过程中的污染较难控制，其特异性得不到保证。最近报道较多的用于I H HNV 的检测PCR-核酸探针点杂交方法(杨冰等,2004;Carr W H et a l,1996)，虽结合了PCR 的高度敏感和探针的高度特异等优点，但也存在着操作复杂、检测时间长和不能定量的缺点。
定量PCR 是在PCR 定性技术基础上发展起来
的核酸定量技术，它不仅实现了对DNA 模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点(张立国和张琚,2003)。将其应用于实践，可满足当前对I H HNV 检测的要求。本研究建立的荧光定量PCR 方法已成功用于对I H HNV 的检测。研究中发现不同的引物和探针终浓度对试验结果影响比较大，用0.6L m o l/L 的引物和探针终浓度，对质粒标准品的检测可获得较小的C t 值，具有良好的重复性。该检测方法灵敏度为2个拷贝，比常规PC R 高1000倍。荧光定量PCR 检测的特异性有探针和引物双重保证，具有比常规PCR 更高的特异性。
在定量PCR 中，探针对序列的变化非常敏感，对扩增目标序列的变化比引物对靶序列的要求要高得多，因此，探针的设计和筛选是Taq M an PCR 试验的关键。本研究中引物和探针的设计是定位在I H -
HNV 较保守区域，这样确保了荧光PCR 检测结果的可靠性。由于Taq M an 荧光定量PCR 可对模板进行准确定量，所以本研究建立的方法不仅可用于I H HNV 的临床诊断，还可用于I H HNV 疫苗和药物疗效的评估以及I H HNV 致病机理等方面的研究。因此,I H HNV 荧光定量PCR 检测方法的建立对I H -HNV 的防治有重要的意义。
参考文献:
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研究现状[J].中山大学学报(自然科学版),39:1-5.杨冰，等.2004.PCR 法制备地高辛标记DNA 探针斑点杂交
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Ca rrW H,S w eeney J N,N unan L,et a,l 1996.T he u of an i n -fecti ous hypode r m al and he m a t opo i etic necrosis v irus gene probe rodiagnosti c fi e l d kit for the screen i ng of candidate spec if pathogen -free Penaeus vanna m ei broodstock [J].A quacu lture ,147:1-8.
(责任编辑 万月华)
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第1卷第2期 水生态学杂志 2008年11月
Develop m ent of a Real -tim e Taq M an -quantitative PCR A ssay for I HHNV D etection
X I E L -i ji 1
,
X I E ZH -i xun 1
,PANG Yao -shan 1
,LU Z H ao -fa 2
,X I E Z H -i qin 1
,
LI U Jia -bo 1
,DE NG X ian -w en 1
,TANG X iao -fei
1
(1.Guangx iVeter i n ary R earch I nstit u te ,Nann i n g ,Guangx i 530001,Ch i n a ;2.Guangx iBureau of F isher y and An i m alH usbandry ,Nann i n g ,Guangx i 530022,China)
Abst ract :A pair of pri m ers and a Taq M an pr obe were desi g ned and synthesized according to the conrved gene quences o f InfectiousH ypoder m al andH ae m atopo ietic N ecrosis(I H HNV )i n GenBank(AF218226),and then re -acti o n para m etersw ere opti m ized to develop a real-ti m e Taq M an-quantitative PCR assay .The deve l o ped quant-i tative PCR assay w as co m pared w ith that of rou ti n e PCR.Th is quantitative PCR assay cou l d detect 2te m plate cop -ies of plas m i d DNA,and its nsiti v ity w as 1000ti m es h i g her t h an that o f the routi n e PCR.The rea l-ti m e Taq -M an-quantitative PCR results o f 15routi n e PCR positive cli n ica l sa m ples sho w ed that concentrati o n of the cli n ica l sa mp les w ere 2.15@107
~4.21@104
cop ies /L L .The sa m p les w ere exa m i n ed using the quantitative PCR repea-t edly and the resu lts i n dica ted t h at the quantitati v e PCR w as reproducible and cou l d be ud successfully fo r t h e d-i agnosis of I H HNV i n fection.K ey w ords :P enaeus vannam ei ;I H HNV;real-ti m e quantitative PCR ;detection
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