文献
综述
猪圆环病毒2型免疫学研究进展
王宪文，赵 普，王丽荣，刘兴友，杭柏林
(河南科技学院动物科学学院，动物病毒病防控与药残分析河南省重点学科开放实验室，河南新乡 453003)
摘要：猪圆环病毒2型(PCV2)感染猪体后，可引发猪体内相应的细胞免疫反应和体液免疫反应，同时可造成免疫系统损伤，其中包括CD4+/ CD8+/MH CIIT细胞和B细胞显著减少，相关细胞因子 干扰素、IL a和I L 10增加，产生病毒中和抗体等。人们已鉴定了PCV2衣壳蛋白的多个B/T细胞抗原表位，其中包括PCV2特异的氨基酸残基231~233和195~202和PCV1和PCV2共有的氨基酸残基156~162和175~192位;T细胞抗原表位包括Rep蛋白的第81~100位和201~220位氨基酸和ORF3蛋白的第31~50位氨基酸。在PCV2疫苗研究中，灭活疫苗和亚单位疫苗成为现时养猪生产中的常用疫苗、病毒活载体疫苗和DNA疫苗也成为疫苗研究的热点。
关键词：抗原表位；细胞因子；疫苗
中图分类号:S855 3 文献标识码:A 文章编号:0529 5130(2011)04 0094 04
猪圆环病毒2型(PCV2)是一种小而无囊膜、二十面体对称、共价闭合、环状、单股DNA病毒，病毒粒子直径平均为17nm，是目前发现的最小的动物病毒。PCV2可引发的疾病包括猪断奶后仔猪多系统衰竭综合征(P MW S)、猪繁殖障碍、母猪流产死亡综合征、育肥猪的慢性呼吸道综合征和猪皮炎和肾病综合征[1-4]等，给养猪业带来很大的经济损失。PC V2有11个ORFs，其中ORF1编码复制酶蛋白, ORF2编码衣壳蛋白，是病毒的主要免疫原性蛋白,
收稿日期:2010 11 15
作者简介：王宪文(1974 )，男，副教授，博士。ORF3编码蛋白与感染细胞凋亡有关，可能与病毒毒力有关。在此我们讲述了PC V2感染免疫损伤、相关细胞因子的变化、PC V2的抗原表位和疫苗的研究进展情况，以进一步了解PCV2的致病机理并控制其引发的相关疾病。
1 PCV2免疫损伤和免疫研究
1 1 PCV2感染引发的免疫损伤
PC V2感染猪体内靶细胞的变化。Sanchez等[5]用不同细胞标记物的双免疫荧光标记和PC V2抗体对胎儿期和初生仔猪的心脏、肺脏、肝脏、脾脏和腹股沟淋巴结的PC V2感染细胞进行定位和免疫分型。
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癌生长迅速，质地坚实，常固定，有溃疡，有局部侵蚀性，易发生转移，病理学上腺癌组织界限不明，癌细胞核大，形态各异，核仁明显，常见分裂。而囊顶质分泌腺癌生长在肛囊内，有甲状旁腺激素样作用，导致高血钙、多尿、多饮。可通过诊断患犬是否有高血钙症来鉴别肛囊顶质分泌腺癌与肛周腺癌[10]。肛门外肿瘤确诊应以病理组织学检查为基础，临床检查、细胞学检查为辅助。
5 4 肛周腺癌防治
肛周腺癌的治疗首先应该切除尚未发生转移与扩散的肿瘤。其次，化学疗法对肛周腺癌也有一定的作用，但放射性治疗对此病常常没有效果，可伴发如大便失禁等并发症[9]。虽然有报道[8]显示，该病的发生与雄激素无关，但此病例做过去势手术后没有发生癌症复发，并且原来腋下的淋巴结肿块也逐渐消失，更有效的防治方法有待进一步研究。
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果发现PC V2靶细胞从胎儿期心肌细胞、肝细胞和巨噬细胞变为出生后只有巨噬细胞。同时,Sanchez 等[6]将妊娠后期第92天/104天的胎儿和1日龄新生仔猪分别接种PCV2，未观察到接种猪有临床症状；在大多数病毒滴度很低的接种仔猪中，感染细胞表型为单核细胞和巨噬细胞，大多数为S WC3+和Sa+，几乎没有CD14+细胞；而在病毒滴度稍高的5个仔猪中，感染细胞除了淋巴细胞(CD4+、CD8+或I g M+细胞)外，还有S W C3+、CD14+(大多数)和Sa+等单核/巨噬细胞。
PC V2感染的显著特点就是感染猪的免疫系统损伤。Sega les等[7]用流式细胞技术分析发现在P MW S 感染猪的周围血液中的淋巴细胞亚群变化很大，特点是单核细胞增加,T细胞(主要是CD4+)和B细胞减少，出现密度较低的不成熟粒细胞。N ieln等[8]在研究淋巴细胞缺失与PCV2诱导发病成P MW S间的关系时，发现PCV2主要诱导淋巴细胞减少，而且可使动物随后发生P MW S病。记忆/激活的辅助性T淋巴细胞所受的影响可能要比T细胞其他亚群更大，但随着时间的推移,T细胞和B细胞群的凋亡就很明显了。Dar w ich等[9]也得到相似的结果,PCV2感染猪的B细胞和T细胞(主要是CD4+和CD8+)数量比对照阴性猪的T、B细胞显著降低；而且,PCV2感染猪的临床症状和病理变化越严重，其B淋巴细胞和CD8+T细胞数量降低越明显。另外，猪肺巨噬细胞也是PCV2主要的感染细胞,M c Ne ill y等[10]发现肺巨噬细胞的PCV2感染后4d观察到在PCV2感染细胞中MH C 型复合体的表达暂时性增加，感染后8 d可观察到表达MH C 型抗原的细胞数量减少，而MHC 型T细胞主要起外抗原提呈作用(表1)。
表1 PCV2感染细胞的特点
不同阶段PCV2感染感染细胞的特点
胎儿期感染心肌，肝和巨噬细胞感染
出生后的猪感染单核巨噬细胞系统感染;T,B淋巴细胞减少 PCV2轻度感染时SW C3+,Sa+细胞
PCV2严重感染时CD4+,CD8+,Ig M+;S W C3+, CD14+(大多数),Sa+细胞
1 2 PCV2感染猪体内免疫因子的变化
PC V2不同病毒蛋白有不同的免疫学功能。An[11]将PCV26个抗原阅读框的裸露DNAs接种小鼠后，发现ORF3引发了高水平的亲炎性细胞因子TNF ，降低了I L 12的水平;15个接种小鼠中有9个死亡，剩余6只小鼠，精神沉郁，但随后恢复正常。ORF1接种第35天，可以提高细胞因子 干扰素和I L 13的水平，而ORF2接种明显提高的体液免疫和细胞因子I L 10的表达水平。Kekara i n en等[12]研究发现，具有抑制效应的CpG基序寡核苷酸位于ORF1基因中，含有CpG基序的寡核苷酸或PCV2病毒样颗粒均可抑制 干扰素和I L 2，而诱发I L 10和I L 12。因此认为PC V2感染引发的免疫学反应似乎取决于病毒DNA调节元件和宿主免疫系统中的结构蛋白间的精妙调节。
PC V2接种猪能明显地激活细胞介导的免疫学反应，形成PCV2特异抗体，并可能导致亚临床感染。Fernandes等[13]研究发现PC V2接种组中的绝大多数上调基因与免疫反应密切相关，如细胞因子(重
组淋巴细胞活化基因，干扰素诱导单核因子，干扰素诱导T细胞趋化因子)，主要组织相容性复合体结合分子(T细胞抗原受体 肽链，白细胞分化抗原8 肽链)，免疫球蛋白和T细胞活化(淋巴细胞酪氨酸激酶，自然杀伤细胞凝集素样受体K1基因,R as相关区域蛋白家族2，干扰素诱导的鸟苷酸结合蛋白2)。Dar w ich等[14]研究发现PCV2阳性猪细胞的I L 8产量明显下降,I FN 减少，说明PCV2能损害Th1免疫应答，这表明PCV2感染猪形成炎症反应能力受损和细胞因子合成下降。Dar w ich等[15]研究发现，在感染的病毒血症阶段,PC V2亚临床感染猪暂时性出现较高水平的I L 10，抗体反应主要由I g M反应转变为IgG反应。Fo rt等[16]在PC V2作用的外周血液单核细胞培养物中均可检测到I L 10的释放。在接种后14~ 21d，病毒血症达到高峰，随后病毒滴度下降，同时出现PCV2特异的I FN 分泌细胞和中和抗体。
与上述PC V2感染猪相比,PCV2感染发病(P MW S)猪体内细胞因子的变化更明显。K i m等[17]研究发现，与单一接种PCV2或猪细小病毒相比, PC V2和猪细小病毒混合接种组引发的 肿瘤坏死因子显著增加。这表明猪细小病毒对PC V2诱导的P M W S的致病增强作用与 肿瘤坏死因子的产生过量有关。Dar w ich等[18]发现P MW S患病猪与健康猪相比，其细胞因子mRNA表达量改变，特别是I L 10mRNA 量上升；胸腺明显萎缩，且在淋巴组织中都观察到显微病损，表明P MW S猪T细胞免疫应答受损。Sipos 等[19]研究发现与对照组相比,P MW S发病猪体内血液中淋巴细胞比例明显减少，感染猪体内I L 显著降低。用流式细胞技术检测胞内细胞因子发现I L 1 ,I L 2和I L 6表达水平增加，而I L 12和TNF 的表达不受影响；发病动物中I FN 的表达水平略有上升(表2)。
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畜牧与兽医 2011年 第43卷 第4期
表2 PCV2感染(患病)猪体内免疫因子的变化(与对照猪相比)免疫因子变化免疫因子
下调的免疫因子IL IL 8淋巴细胞数量
上调的免疫因子
I L 1
TCR
I L 2
CD8
I L 6
免疫球蛋白
IL 10
LCK
IF N
KLRK1
CCL4L
RASSF2
CXCL9
GBP2
CXCL11
稳定的免疫因子I L 12TNF
2 PCV2抗原表位研究
在抗原表位研究中，人们已发现针对PCV2不同蛋白的多个抗原表位。Larochelle等[20]研究发现衣壳蛋白的氨基酸序列在第59~80残基，第121~136残基和180~191残基变异程度较大。有趣的是其中2个区域(第59~80残基，第121~136残基)与用Pepscan技术分析编码ORF2的基因后所鉴定的2个主要免疫反应区域(第65~87残基和第113~147残基)有关。Shang等[21]在研究PCV1和PCV2抗原位点时，确定了5个B细胞线性表位，包括PCV2特异的氨基酸残基231~233和195~202位,PC V1特异的氨基酸残基92~103位，以及PCV1和PCV2共有的氨基酸残基156~162和175~192位；确定了在231~233和156~162表位的2个关键残基分别是氨基酸残基233(脯氨酸)和156(酪氨酸)；同时发现氨基酸残基231~233也参与了具中和活性的构象表位的形成。Stevenson等[22]研究PCV2抗原时，获得了3个具表位活性的多肽，均能诱导外周血液单核细胞中的T淋巴细胞的增殖能力，其中2个多肽由PC V2ORF1编码(第81~100位和201~220位氨基酸)，另一个多肽由PCV2ORF3编码(第31~50位氨基酸)，这表明PC V2针对T淋巴细胞的主要作用对象是ORF1和ORF3非结构蛋白的抗原决定簇。这些抗原表位将有助于进一步的疫苗研究和疾病的快速诊断研究。
3 PCV2疫苗研究进展
在抗PCV2感染方面，与Cap蛋白特异的I gG2a 相关的CD8+T细胞和中和抗体反应起关键作用[23]。灭活疫苗和亚单位疫苗已在全世界广泛应用，病毒活载体疫苗和DNA疫苗也成为疫苗研究的热点。
PC V2灭活疫苗以其安全、稳定、高效成为养猪生产中的常用疫苗，如富道公司的PCV1和PC V2嵌合灭活疫苗Suvaxyn和梅里亚公司的全病毒灭活疫苗C ircovac ，我国哈尔滨兽医研究所和南京农业大学分别研制的全病毒灭活疫苗也刚投入生产。但由于病毒感染细胞后不产生细胞病变，且病毒对PK15细胞的适应能力有差异和感染细胞病毒滴度不高等缺点，限制了其应用。人们正在寻求合适的细胞来培养PC V2病毒，如Zhu等[24]将PCV2感染PK15 C1细胞后病毒滴度可达108TC I D50，较在PK15细胞中病毒滴度增加达1000倍。
在PC V2亚单位疫苗研究中,Fan等[25]将PCV2衣壳蛋白基因在杆状细胞中的表达产物作为亚单位疫苗接种猪后，产生了较高的免疫学反应;Bucarey 等[26]将PCV2衣壳蛋白酵母表达后形成的病毒样颗粒经口免疫小鼠后，引发了小鼠的体液免疫反应；亚单位疫苗是生产中常用的疫苗，勃林格公司和英特威公司的生产的Cap蛋白重组杆状病毒灭活疫苗已广泛应用于生产。
在PC V2病毒活载体疫苗研究方面也取得了很大进展。K i m等[27]将构建的PC V2衣壳蛋白支气管败血波氏杆菌活载体疫苗接种猪后，成功地将淋巴结中的病毒DNA清除;Pei等[28]将构建的表达绿荧光蛋白和PCV2衣壳蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)活载体疫苗接种猪后，可诱发产生针对绿荧光蛋白和PC V2衣壳蛋白的抗体，该疫苗用于生产后，可区分免疫抗体和感染抗体。G illespie[29]将PC V1的Cap蛋白取代PCV2C ap蛋白，构建了PCV1 2变异病毒，该毒株遗传稳定，有望成为很好的疫苗株。
PC V2DNA疫苗也是疫苗研究的热点。A rav i n dara m[30]采用初免用基因枪注射DNA，再免用重组痘苗病毒接种，取得了良好的免疫效果。Shen等[31]将ORF2DNA疫苗接种小鼠后，引发了针对PCV2的保护性免疫学反应，同时发现DNA疫苗产生的免疫效果要优于亚单位疫苗的免疫效果。DNA疫苗有望不久应用于生产。
PC V2是新出现的疾病，尽管人们对该病毒及其免疫机制做了很多研究，但仍有许多研究需要做，如PC V2接种后产生明显细胞病变的细胞系、中和抗体产生分子和细胞机理等，均有待进一步的研究。
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畜牧与兽医 2011年 第43卷 第4期
