中，兽医科学 2020，50(12):1486-1493
Chine Veterinary Science
D O I：10.16656/j.issn. 1673-4696.2020.0216 中图分类号：S852.659.4 文献标志码：A文章编号：1673-4696(2020) 12-1486-08
中国流行的十二种血清型蓝舌病病毒一步法
RT-PCR定型方法的建立与应用
东非大裂谷李占鸿\宋子昂2，杨振兴\李卓然、廖德芳\李华春\杨恒”
(1.云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明650224;
2.云南农业大学动物医学院，云南昆明650201)
摘要：为建立针对我国流行的12种蓝舌病病毒0丨此1;〇叩116乂丨1'115,13丁\〇血清型的特异性1^1'-?〇^检 测方法，本研究根据我国流行B T V毒株Seg-2的高度保守区域，设计出12对B T V血清型特异性扩增引物，建立了 R T-P C R方法，并对该R T-P C R方法的反应条件、引物特异性与灵敏性进行了优化与
验证；以我国分 离的162株B T V为检测对象，对其血清型进行鉴定并构建系统发生树。结果显示，建立的B T V血清型R T-P C R具有良好的特异性与灵敏度：设计的12对引物仅与对应血清型B T V核酸模板产生特异性P C R扩 增，与其余血清型毒株之间无交叉扩增现象；对不同血清型B T V核酸的检测灵敏度在1.28X102copies (B T V-2)至9.62X102copies(B T V-l)之间。对我国分离的B T V毒株的R T-P C R血清型鉴定与测序结果显示，162 株 B T V 分属 12 种血清型（B T V-l、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21 与-24)，根据 Seg-2 序列 构建的系统发生树显示，我国流行B T V血清型毒株的Seg-2序列与对应血清型的B T V标准参考毒聚为一簇，分属9个基因群(八、8、(^、已、卩、0#、1和』基因群）。本研究建立的81^血清型特异性[?!'-卩〇^方法为我国流行B T V的检测、诊断与分子流行病学调查提供了可靠的技术手段。
关键词：蓝舌病病毒；血清型；R T-P C R；检测方法
景的作文Establishment and application of one-step RT-PCR method to identify the rotype of bluetongue virus epidemic in China
L I Zhan-hong'.SONG Zi-ang2,YANG Zhen-xing1,LI Zhuo-ran1, L I A O De-fang1, L I Hua-chun1, YANG Heng1*
(1. K u nnan Tropical and Subtropical A nirrud V i rology Laboraiory,Y i innan A cade m y oj A nimxil H
u sbandry mui Veterinary,
Kunming 65022A .China；2. College of Veterinan Medicine ,Yunnan Agricultural University,Kunming650201 .China)
Abstract：Bluetongue virus (BTV)contains many rotypes and twelve rotypes of BTV are epidemic in China,which threatens the development of cattle and sheep breeding industry of China.The purpo of the study was to establish rotype-specific RT-PCR detection methods for the detection of twelve BTV rotypes in China.Twelve pairs of specific primers were designed and synthesized bad on the conrved quence of Segment-2 (Seg-2) gene of BTV prevalent in China.The RT-PCR reaction conditions were optimized,and the specificity and nsitivity of PCR were analyzed.The rotypes of 162 BTV strains isolated in China were identified and the phylogenetic trees were constructed bad on the quence of the Seg-2 gene.The results showed that the BTV rotype-specific RT-PCR detection methods were highly
收稿日期：2020-05-23；修回日期：2020-06-22
基金项目：国家自然科学基金项目（31760744)；国家重点研发计划项目（2017YFC1200505)；云南省中青年学术和技术带头 人后备人才培养项目（2017HB055)
作者简介：李占鸿（1989-)，男（白族），云南大理人，助理研究员，硕士，主要从事牛羊虫媒病毒的研究，E-mail :dy0811zh@ 163. c o m。*通讯作者：杨恒（1978-)，男，研究员，主要从事动物虫媒病毒的研究，E-mail :yangheng2008. cool@
163. com〇
第12期李占鸿等：中国流行的十二种血清型蓝舌病病毒一步法RT-PCK定型方法的建立与应用1487
specific and nsitive.The rotype-specific primers only generated specific PCR products with the nucleic acid of the corresponding rotype BTV,and there was no cross-amplification with other rotype strains.The nsitivity of themethods ranged from 1.28X l〇2copies (BTV-2) to 9. 62X l〇-copies (BTV-1). The rotype identification results showed that the 162 BTV strains belonged to twelve rotypes of BTV (BTV-1, _2, -3,-4,-5,-7,~9,-12,-15,-16,-21 and -24),and clustered with the corresponding standard reference BTV strains belonging to 9 gene groups (Gene group A,B,C,E,F,G,H,I and J).The BTV rotype- specific RT-PCR detection methods established in this study provided reliable technical means for the detection,diagnosis and molecular epidemiological investigation of the BTV epidemic in China.
Key words：bluetongue virus；rotype；RT-P C R；detection method
* Corresponding author ：YANG Heng,E-mail ：yangheng2008. ************
蓝舌病（bluetongue，B T)是一种通过吸血库蠓(CMco/des spp.)叮咬易感反刍动物传播的烈性出血性虫媒病毒病，其病原为蓝舌病病毒（bluetongue virus,B T V)。B T呈世界范围分布，非洲、北美洲、南 美洲、大洋洲、亚洲的热带、亚热带与温带地区均有该疫病的暴发:13]。B T V可感染几乎所有的反刍动物，牛和山羊感染病毒后，往往无明显的临床症状，成为病毒的储存宿主。B T V感染绵羊后可引起动物出现明显的临床症状，主要表现为高热、消瘦、口唇 充血肿胀及糜烂、鼻腔和胃肠黏膜出血溃疡、蹄冠脱落引起跛行等[13]。当新血清型B T V传人时，感染绵 羊的发病率可达80%，死亡率高达40%，给养殖业带来毁灭性的灾难。世界动物卫生组织(O I E)将B T 列为法定报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病的】。
B T V为呼肠孤病毒科（/?eoWr/dae)环状病毒属(O r W v/rus)成员，目前已在世界范围确认了 27种 B T V血清型（B T V-1〜B T V-27V6、B T V基因组大小约20吐，由10个节段（568_1〜568-10)的双链1^八 (d s R N A)组成。Seg-2编码的V P2蛋白是构成病毒外层衣壳的主要蛋白之一，与病毒感染早期对细胞的吸附和侵人有关，诱导机体产生针对特定血清型B T V的中和抗体，决定着B T V的血清型7_8。B T V 的Seg-2/V P2序列具有高度变异的特性，不同血清型B T V毒株Seg-2核苷酸序列差异在38.6%~ 59.5%之间,V P2蛋白的氨基酸序列差异在40.5%〜72.9%之间。根据Seg-2的变异，可将27个血清型的B T V分为A〜L等12种基因群9]。研究发现，同一种血清型B T V的Seg-2/V P2序列差异度可
达
31.6%/27.4%，可根据这种差异将同一种血清型
B T V的Seg-2分为“东方型"（Eastern)和“西方型”(Western)两种地域型[9]。
1979年在我国云南省师宗县暴发B T的发病绵 羊上首次分离并确认了 B T V在我国的存在。1996—1997年，笔者所在实验室在我国云南省设立的哨兵牛中分离出7种血清型B T V(B T V-l、-2、-3、-4、-12、-15和-16)i l()]。2012年以来，笔者在全国范围开展了 B T V流行病学调查，在我国的云南、广西、广东、江 苏与湖南相继分离出了 12种血清型的B T V(B T V-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、—15、_ 16、-21、-24)[1卜13]。通 过对我国流行B T V代表毒株的Seg-2序列分析显示，我国流行的 B T V-l、-2、-3、-4、-9、-15、-16 与 -21这8种血清型B T V的Seg-2均为Eastern型，而 B T V-5、-7、-12 与-24 血清型的 Seg-2 为 Wes tern 型 [11_13]。
多种B T V血清型在我国流行，给我国B T的防 控带来了严峻的挑战。建立方便快捷的B T V血清型 鉴定方法，是确保B T V流行病学研究顺利开展，科 学制定B T防控策略的重要前提。传统的血清中和试验鉴定B T V血清型存在费时、费力以及试验成本高等缺陷。本研究根据我国流行B T V血清型毒株的Seg-2基因序列特征，设计B T V血清型特异性扩增引物，建立了针对12种血清型B T V的型特异性R T-P C R检测方法。该方法具有简便、快速、准确等 优点，为开展我国B T V血清型的鉴定与分子流行
病学调查研究提供了技术支持。
1材料与方法
1.1病毒株与核酸样品
中国分离的12种血清型B T V(B T V-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21、-24)代表毒株由本实验室分离并保存，病毒信息见表1。本实验室1996— 2017年分离的不同血清型B T V毒株共计162株，病 毒信息见表2。B T V-1至B T V-24等24种B T V血 清型参考毒源自世界动物卫生组织（O I E)B T V参 考实验室 Onderstepoort Veterinary Institute:South Africa。体外转录B T V Seg_10 s s R N A核酸（核酸浓度：1.48X10,2copies/"L)由本实验室制备并保存1M]0
1488中国兽医科学第50卷
表1中国分离的12种B T V血清型代表毒株的分离信息
Table 1Isolation information of Chine BTV
血清型Serotype
毒株号
Strains No.
分离时间
Isolation date
分离地点
Isolation place
分离动物
Animal
S e g-2地域型
Topotype of
Seg-2
与参考毒株的相似度/%
Identity to the reference
strain
病毒核酸拷贝数/
(copies*mL ')
Copy of the virus
nucleic acid
BTV-1YNSZ/V1472012云南，师宗
Shizong,Yunnan 山羊
Goat
东方型
Eastern
74. 39.62X107
BTV-2YNPE/V1462013
云南，普洱
Puer,Yunnan
牛
Cattle
东方型
Eastern
72. 1 1.28X109
BTV-3YNDH/V0252013
云南，德宏
Dehong,Yunnan
牛
Cattle
东方型
Eastern
69.93.46X109
BTV-4YNPE/V0302013
云南，普洱
Pue r,Yunnan
牛
Cattle
东方型
Eastern
72.9 4. 54X106
BTV-5YNSZ/V0842012
云南，师宗
Shizong,Yunnan
牛
Cattle
西方型
Western
95.47. 85X107
BTV-7GDST/V0892014广东，汕头
Shantou,
Guangdong
牛
Cattle
西方型
Western
92. 8 2.66X108
BTV-9YNDH/V0082013
云南德宏
Dehong,Yunnan
牛
Cattle
东方型
Eastern
69. 08.45X K T
BTV-12GXNN/V0072012
广西，南宁
Nanning.Guangxi
牛
Cattle
西方型
Western
97.8 6.82X K T
BTV-15YNPE/V0612014
云南，普洱
P u e r，Yunnan
牛
Cattle
东方型
Eastern
74.6 1.43X109
BTV-16YNSZ/V1092012
云南，师宗
Shizong,Yunnan
山羊
Goat
东方型
Eastern
95. 1 2. 54X108
BTV-21JSXY/V0572013
江苏，盱眙
X uyu,Jiangsu
牛
Cattle
东方型
Eastern
85.97. 14X106
寿司紫菜
BTV-24YNDH/V0152013
云南，德宏
Dehong,Yunnan
牛
Cattle
西方型
Western
94.38.45X107
表2 1996—2017年分离的不同血清型B T V毒株的信息
Table 2 Information of different BTV rotype strains isolated from 1996 to 2017
血清型Serotype
分离地
Isolation place
分离动物
Animal
分离时间
Isolation date
毒株数海航怎么样
Virus strainamount
BTV-1
云南，广西
Yunnan,Guangxi
牛，山羊
Cat tie,Goat
1996、2012、2013、2015、201615
BTV-2
云南，广东
Yunnan，Guangdong
牛，山羊
Cattle,Goat
1996,2013,201415
BTV-3
云南
Yunnan
牛
Cattle
1996,2012,2013 j01418
BTV-4
云南，广西，广东
Yunnan,Guangxi,Guangdong
牛，山羊
Cattie,Goat
1996、2012、2013、2015、2016、201731
BTV-5
云南，广东
Yunnan,Guangdong
牛
Cattle
2012、2013、2015、20168
BTV-7
广西
Guangxi
牛，山羊
Catt le ,Goat.
20142
BTV-9
云南
Yunnan
牛
Cattle
2012,20159
BTV-12
云南，广西，广东，江苏
Yunnan, Guangxi.Guangdong,
Jiangsu
牛，山羊
Cat tie,Goat
1996,2012,201413
BTV-15
我是abc
云南，江苏牛
1996,2014
Yunnan,Jiangsu Cattle
5
BTV-16
云南，广西，广东
Yunnan, Guangxi,Guangdong
牛，山羊
Cat tie,Goat
1996、2012、2013、2014、2015、201726
BTV-21
云南，广西，广东
Yunnan,Guangxi,Guangdong
牛，山羊
Cat tie,Goat
1996、2013、2014、201517
BTV-24
云南
Yunnan
牛
Cattle
2012、2013、20153
第12期李占鸿等：中国流行的十二种血清型蓝舌病病毒一步法RT-PCR定型方法的建立与应用1489
1.2主要试剂
M a g M a x磁珠法病毒核酸提取试剂盒购自美国应用生物系统公司（A B I)。一步法R T-P C R试剂盒、荧光定量q R T-P C R试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒和D L5000D N A M a r k e r均购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.3引物的设计与合成
从G e n B a n k中下载不同血清型B T V的Seg-2序列，与笔者前期获取的我国流行的12种B T V血 清型（B T V—1、—2、—3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21、-24)毒株的Seg-2全长序列（共计75条）进行序列比对分析。选择不同血清型Seg-2的高度保守区域，利用Oligo 7.0分别设计出12对B T V的血清型特异性R T-P C R扩增引物。引物信息见表3，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
表3中国分离的12种B T V血清型毒株血清型鉴定引物序列信息
Table 3 Serotype identification primer information of BTV isolated from China
窑洞的特点血清型引物名称引物序列（5< —3f)引物位置扩增产物大小/bp Serotype Primer names Primer quences Position Product size
BTV-1/E-Seg2-F TGGGTACARTGGATGATGAAAGA345〜389
BTV-11 151 BTV-1/E-Seg2-R TGGGTACARTGGATGATGAAAGA1789〜2143
BTV2/E-Seg2-F GGTDCARTGGATGATTAAGGATAG330〜353
BTV-2
BTV2/E-Seg2-R GCAATCTCCGTCTCAGTTATCC1613〜1634
1 305
BTV3/E-Seg2-F GCTTGCTTGGATGATTGAGGA330〜350
异体受精BTV-31 298 BTV3/E-Seg2-R TTTCTACGTCACAGGGTTTAACT1605〜1627
BTV4/E-Seg2-F ACTAATGCGAAGTGGATGAAGTG317〜339
BTV-41 321 BTV4/E-Seg2-R CGTTACTTCTAGCYGTACCGATCT1614〜1637
BTV5/E-Seg2-F CTTACGAGRAAGAGCGTGCGA270〜290 BTV-5
AATCCACTTRTCATAGTAGTCAGG1540〜〗1 239
BTV5/E-Seg2-R
BTV7/E-Seg2-F GGTTGGARGAGCAAGCGGAT241〜263 BTV-7
ACTCCAYGAAGTTGCAATCTCAG1507〜15301 289
BTV7/E-Seg2-R
BTV9/E-Seg2-F GCGATATCGACCTGATGCTGA202〜222
BTV-91 280 BTV9/E-Seg2-R AATTTTAACGCCTGCTGCTCCCA1460〜1482
BTV12/E-Seg2-F TGGATGATAGGRGATTCGATGGA337〜359
BTV-121 247 BTV12/E-Seg2-R TGCGTCCATTTGTTRAAATATGG丁1560〜1583
BTV15/E-Seg2-F CGAGATTCRATGGATGTGCAGC337〜358 BTV-15
TTAAACATYGGAGCRTATATCCA1561〜15831 247
BTV15/E-Seg2-R
BTV16/E-Seg2-F GGTDCARTGGATGATTAAGGATAG330〜353 BTV-16
GCAATCTCCGTCTCAGTTATCC1613〜16341 151
BTV16/E-Seg2-R
BTV21/E-Seg2-F GCTTGCTTGGATGATTGAGGA330〜350 BTV-21
TTTCTACGTCACAGGGTTTAACT1605〜16271 305
BTV21/E-Seg2-R
BTV24/E-Seg2-F ACTAATGCGAAGTGGATGAAGTG317〜339 BTV-24
CGTTACTTCTAGCYGTACCGATCT1614〜16371 298
BTV24/E-Seg2-R
1.4病毒核酸的提取
取50 p L病毒液，使用M a g M a x磁珠法病毒核酸提取试剂盒，按操作说明书在M a g M a X Express96 核酸自动提取仪(A B I)上进行病毒核酸的提取。将 提取的核酸于94 °C变性3 m i n，立即冰浴，将变性后的病毒核酸于一80°C保存备用。
1.5 BTV血清型特异性RT-PC R检测方法的建立
以中国分离的12种B T V血清型代表毒株(表1) 的核酸为模板，使用表3中的B T V血清型R T-P C R引
物，进行B T V Seg-2的一步法R T-P C R扩增，反应体系：5 p L核酸模板，12.5 n L2X l step Buffer,1 p L Prime Script 1 step E n z y m e M i x，上、下游引物（20 pmol/L)各 0_5 p L，用 RNa Free d d H20 补齐至 25 p L。反 应程序：50 °C 30 min;94 °C 2 m i n;94 °C 30 s、56 °C 30 s、72 X：1 min 15 s,30 个循环；72 °C 10 m i n，4 °C 保存。反应结束后，取 5 p L扩增产物进行电泳检测。将扩增的P C R产物进行测序分析。
1.6特异性试验
取 1.4中提取的24种血清型B T V(B T V-1〜 B T V-24)参考毒株的核酸5 P L为模板，分别用表3 中的B T V血清型特异性R T-P C R引物，按照1.5的 反应条件进行P C R扩增。反应同时设立阴性对照，
1490中B兽医科学第50卷
责任书范文分析B T V血清型R T-P C R引物在不同血清型毒株间的特异性。
1.7病毒核酸的qRT-PC R定量
取表1中B T V代表毒株的核酸1m L为模板，以本实验室建立的B T V群特异性q R T-P C R检测方 法™进行B T V核酸的绝对定量q R T-P C R，通过以Seg-10 s s R N A为模板进行q R T-P C R反应获取的标准曲线计算出不同血清型B T V毒株核酸的拷贝数。
1.8 B T V血清型特异性RT-P C R的敏感性试验
将已知核酸拷贝数的不同血清型B T V R N A进 行10倍梯度稀释作为模板，选择对应的B T V血清 型特异性R T-P C R引物，按照1.5的反应条件进行一步法R T-P C R扩增。反应同时设立阴性对照，分 析B T V血清型R T-P C R方法对不同浓度核酸模板的扩增效果。
1.9中国分离的B T V毒株的血清型鉴定
对本实验室1996—2017年分离的162株B T V 提取核酸，进行B T V血清型的R T-P C R鉴定。将扩增产物送销尚生物技术（上海）有限公司，以P C R扩 增引物作为测序引物进行测序。采用D N A S t a r软件 中的S e q M a n程序对测序结果进行拼接，以M E G A 6.0软件15进行测序结果的比对与系统发生树的构建。
2结果
2.1中国流行B T V血清型特异性RT-P C R检测方法的建立
为确认设计的B T V血清型特异性R T-P C R引 物的扩增效果，笔者选择我国分离的12种血清型B T V代表毒株（表1)，进行B T V血清型的一步法R T-P C R扩增。结果显示，不同血清型B T V毒株的扩增产物大小均在1 k b左右，与预期扩增大小一致(图1)。将扩增产物的测序结果进行B L A S T比对分 析，
测序结果与血清中和试验鉴定出的B T V血清型 一致，表明，初步建立了针对中国流行B T V毒株的血清型特异性R T-P C R检测方法。
M l 2 3 4 5678910 11 12
1500 bp
I000 bp
图1中国12种B T V血清型代表毒株Seg-2的R T-PC R扩增
Figure 1RT-PCR amplification of the Seg-2 of Chine BTV strains belonging to 12 rotypes
M:DNA 分子质量标准；1〜12：分别为BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21 与BTV-24
毒株的R T-PC R扩增结果:
M:DL5000 DNA Marker;l—12:The RT-PCR results of BTV-1，BTV-2，BTV-3，BTV-4，BTV-5，BTV-7，BTV-9，BTV-12，BTV-15，BTV-16, BTV-21and BTV-24 strains.
2.2 B T V血清型RT-PC R检测方法的特异性验证
取24种B T V参考血清型（B T V-1〜B T V-24) 毒株的核酸为模板，对本研究设计的B T V血清型R T-P C R引物的特异性进行验证。结果显示，每种 B T V血清型R T-P C R引物仅与对应血清型的病毒核酸模板之间产生特异性的扩增条带，对其他血清型毒株的核酸扩增结果均为阴性（图略）。表明本研究设计的B T V血清型鉴定引物具有良好的特异性，与其他血清型B T V核酸之间无交叉扩增现象。
2.3 B T V血清型RT-PC R检测方法的灵敏度试验
采用本实验室建立的B T V群特异性荧光定量检测方法14：对中国流行的12种B T V血清型代表毒株的核酸拷贝数进行定量，结果显示，各血清型B T V代表毒株的核酸拷贝数在4.54X106copies/nL
(B T V-4)〜6.82 X109copies/p L (B T V-12)之间（表
1)。以101〜105copies的各血清型B T V毒株的核酸为模板，分析B T V血清型R T-P C R引物的检测灵敏度。结果（图2)显示，B T V血清型特异性R T-P C R引物对B T V核酸的检测灵敏度在1.28 X 1〇2 copies (B T V-2)〜9.62 X102 copies (B T V-1)之间，表明设计的B T V血清型特异性R T-P C R引物具有较高的灵敏度
。
