玉米蛋白酶解产物对a■淀粉酶活性抑制研究
战旭梅，祁兴普，赖梦宇，刘萍
(江苏农牧科技职业学院，江苏泰州225300)
摘要：以玉米蛋白粉为原料，采用碱性蛋白酶、复合风味蛋白酶、胰蛋白酶对玉米蛋白进行酶解，研究不同酶解条件下得到的酶解产物对！淀粉酶活性的抑制作用&通过单因素和响应面方法对酶解条件进行优化。结果表明：在玉米浓缩蛋白粉稀释料液比1：10(g/mL)、酶解时间3.0h、酶添加量4000U/g、pH8-0、酶解温度45.5C的条件下，酶解液对！-淀粉酶抑制率达到15.01%&关键词：玉米蛋白；酶解；响应面试验;!淀粉酶抑制率
我的苦难我的大学Stiidy on tlie inhinition of corr protein hydrolysates to a-amylast activity ZHAN Xu-met,QI Xing-pu,LAI Merg-yu$LIU Ping$
(Jiangst Agri-animal Hustandry Vocational College,Taizhou225300,Jiangsu,China) Abstrad:C on protein meal was hydrolyzed by alkaline protea,tavourzyma and typsin,and the inhibition of a-Cmyla activity by the hydrolysates under di/eynt conditions was studied-The conditions of enzymatic hydrolysis were optimized by single factor and respon surface methods.The results showed that con
protein concentrate at a dilui material-to-liquid ratio of1：10(gmL):the enzymatic hydrolysis iomewas3.0h,iheenyymeaddoioon was4000Ugg,pH8.30,and iheenyymaio hydeoeysosiempeeaC ture was45.5C-Under the conditions,the inhibition rate of the enzyme hydrolysate on a-Cmyla cached15.01%-
Key wo S s：con protein;enzyme hydrolysis;respon surface test;a-Cmyla inhibition rate
中图分类号：TS201.2文献标志码：A文章编号：1008-9578(2021)05-0142-06
玉米蛋白粉是玉米湿法生产淀粉的主要副产物之一，含有60%以上的蛋白质，约68%的蛋白质为醇溶蛋白，难溶于水［1］）利用酶法对玉米蛋白进行水解生产的玉米肽不仅具有高效性%安全性等特点'2（，并且具有纯天然%易被人体消化吸收、抗氧化、抗疲劳、促进乙醇代谢等优良特性［3］，可以开发成运动饮料、醒酒饮料等功能性食品。！淀粉酶抑制剂能抑制胃肠道内唾液%胰淀粉酶的活性，阻碍或延缓人体对食物中主要碳水化合物分解为还原糖类物质在小肠中被吸收，避免餐后血糖浓度快速升高；从而起到降低血糖、血脂的作用，有利于糖尿病患者的饮食治疗［4'5］。对于肥胖患者，具有减少糖向脂肪转化，延缓肠道排空，增加脂肪消耗以减轻体质量⑷的效果。目前，市场上常见的用于减肥或代餐的商品化！-淀粉酶抑制剂产品，制备原料多限于白芸豆，对于自然界中存在的其他来源有待于进一步的开发和利用）
本文以玉米蛋白粉为原料，研究不同蛋白酶对其水解度以及水解产物对！-淀粉酶抑制率的影响，并利用响应面优化酶解工艺参数，旨在为玉米蛋白活性肽的功能研究提供依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
玉米蛋白粉（粗蛋白含量为60.29%），河北兴隆植物油有限公司；碱性蛋白酶（200000U/g）、胰酶（4000U/g）、风味蛋白酶（15000U/g），江苏锐阳生物科技有限公司;！淀粉酶，河南安锐食品配料有限公司；其他试剂均为分析纯。
1.2仪器与设备
YJ-250A高速多功能粉碎机，济南亿健医疗设备有限公司&DF-101S集热式恒温加热搅拌器，巩义市予华仪器有限公司;HH数显恒温水浴锅，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；FE20K台式pH计、EL3002电子天平、AL204电子天平，梅特勒-托利多
收稿日期：2020-05-09
基金项目：泰川市科技支撑（农业）项目（TN201606）；院级科研项目（NSFPT201725）作者简介：战旭梅（1980—），女，硕士，讲师，研究方向为功能性食品研究与开发。
通信作者：刘萍（1982—），女，博士，副教授，研究方向为功能性食品研究与开发。
仪器上海有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度
计，北京普析通用仪器有限公司&5810R台式高速冷
冻离心机,EppendoO'G；L'BCONCOAL冻干机，南
京博惠科学仪器有限公司)
1.3试验方法
1.3.1浓缩玉米蛋白的制备*6+
玉米蛋白粉T按料液比1：15(g/mL)加入碱醇液(由0.1mol/L NaOH与体积分数95%乙醇按体积
比45：55配制)-于55C水浴中回流浸提$过滤$浸提液按体积比1：1加水$调pH至6-4$按体积比5：1加2g/100mL NaCt溶液盐析$3000r/min离心10mb$取沉淀部分冷冻干燥$研细，过孔径0.2mm 筛$得到玉米浓缩蛋白粉，备用。
1.3.2玉米蛋白酶解液的制备
称取一定量浓缩玉米蛋白粉于1000mL烧杯
中，按1：10(g/mL)的比例用蒸3水溶成悬浮液并搅拌均匀。放入100C恒温水浴锅中预变性10mb
(水浴过程中不停搅拌)，调节酶反应所需pH值，冷却至酶的最适温度后添加适量的酶，放入恒温加热磁力搅拌器中，水解一定时间，水解过程中维持pH 值不变。水解结束后，将烧杯放入100C水浴锅中保温15mb使酶灭活，冷却后，转速10000r/mb，冷冻离心15mb，上清液即为酶解液。
1.3.3蛋白酶的筛选
玉米浓缩蛋白粉按1：10(g/mL)的比例添加蒸3水制成混悬液，分别按照玉米浓缩蛋白粉质量加入等量(2000U/g)的胰蛋白酶、风味蛋白酶和碱性蛋白酶，并在各自最佳酶解pH和酶解温度(见表1)反应3h，按照1.3.2制备酶解液。测量不同蛋白酶制备的酶解液的水解度和！淀粉酶抑制率，筛选出)淀粉酶抑制率咼的蛋白酶，进行下一步试验。
表13种酶的水解条件
酶种类酶解pH酶解温度/C gh 碱性蛋白酶(200000U/g)8.0453胰蛋白酶(4000U/g)8.1373
风味蛋白酶(15000U/g)7.5503
1.3.4单因素试验
根据蛋白酶筛选结果，以水解度和！淀粉酶抑制率为指标,100mL1：10(g/mL)的玉米浓缩蛋白混悬液，以酶解时间、酶解pH、酶添加量、酶解温度4个因素进行单因素试验。每个水平平行测定3次，取其平均值。
1.3.4.1酶解时间对水解度和！淀粉酶的抑制率的影响
在酶添加量3000U/g、温度45C、pH8.0条件下，分别酶解1、2、3、4、5h后,100C灭酶15mb，测定不同酶解时间所制备酶解液的水解度和！可粉酶抑制率。
1.3.4.2酶解pH对水解度和！淀粉酶抑制率的影响
酶添加量3000U/g、温度45C，分别调节pH 7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，酶解3h后,100C灭酶15mb，测定不同pH下所制备酶解液的水解度和!淀粉酶抑制率。
长发公主的故事
1.3.4.3酶添加量对水解度和！淀粉酶抑制率的影响
在温度4C、pH8.0条件下，酶添加量分别为1000、2000、3000、4000、5000U/g，酶解3h后, 100C灭酶15min，测定酶的不同添加量所制备水解液的水解度和！淀粉酶抑制率。
1.3.4.4酶解温度对水解度和！淀粉酶的抑制率的影响
在酶添加量3000U/g,pH8.0条件下，分别调节温度35、40、45、50、55C，酶解3h后,100C灭酶15min，测定不同温度下所制备酶解液的水解度和!淀粉酶抑制率。
1.3.5响应面法优化玉米蛋白酶解工艺试验
在单因素的基础上，采用响应面方法设计试验，确定玉米蛋白酶解液抑制！淀粉酶的最佳条件。试验采用Design-Expert8-0.6软件中的Box-Behnken法设计试验方案，以酶解液对！淀粉酶抑制率为考察指标，酶解时间(B)、酶解pH(B)、酶添加量(B)和酶解温度(B)为反应条件，建立四因素三水平的响应面因素水平设计，因素水平如表2所示。
表2玉米蛋白酶解液抑制！淀粉酶
响应面优化试验的因素水平
因素
水平
gh pH酶添加量/(U/g)酶解温度/C -1 2.07.0200040
0 3.08.0300045
1 4.09.0400050
1.4测方
1.4.1水解度测定
水解度(DH)=水解液憎警吉氮含量X100%⑴
游离氨基酸态氮测定：参照GB 5009. 235—
泳衣款式2016-食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》。量测定：参 GB 5009.5—2016《食品安 全国家标准食品中蛋白质的测定》。1.4.2 a-淀粉酶抑制率的测定
采用3 ,5-二硝基水杨酸(DNS "比色法⑺，稍作
修改。：准确吸取0. 1 mL a-淀粉酶溶液
(1 mg/mL )、0. 9 mL 磷酸缓冲液(pH 6. 8 "于 50 mL
比 ，充分混，40 C 水 保温10 in ,
然后加入1 mL 10 g/100 mL 的可溶性淀粉溶液,
在40 C 水浴中反应10 min 后加入2 mL DNS 显色
，在沸水 反应5 in ，即冷水浴冷却，
3
水定容至刻度线，在波长540 nm 处测量其吸光度,
为1。
样品管：准确吸取0.1 mL a-淀粉酶
溶液！ 1 mg/mL )、0.2 mL 酶解液和0. 7 mL 磷酸缓
(pH6.8) 50 mL 具塞比
，其余 同
淀粉酶管，吸光度记为1)
零管：准确吸取10 mL 磷酸缓冲液(pH 6.8)50 mL 比 ， 余 同
， 为
零管，调零用。
a-淀粉酶抑制率的计算公式见式(2))
1 <
B =十 x100 %
(2)
:B 为a-淀粉酶抑制率,% ；1为a-淀粉酶水解
在 540 nm 处测得吸光度;1为 淀
水解淀粉在 540 nm 处测得吸光度。
2 果与分析2. 1 蛋白 选
o
6.
o o o o d
20.&o o o o & d 2.□ a-淀粉酶抑制率□水解度
胰蛋白酶 碱性蛋白酶 风味蛋白酶
o o o o O &6.4.2.0..0.0.0.0
00 乙
o
春光灿烂海棠红图1 3种蛋白酶对玉米蛋白的酶解效果
相比之下，胰蛋白酶酶解玉米蛋白后虽水解度
最咼，但a 无 制率不如碱性蛋白酶咼。在研
究活性的
，水 度并不是越高越好，反之，因
断了某些肽键
活 [8(，因此推测碱性蛋
白酶在
，会产大量具有高度活性
的多肽段，增
制率。所以，综合考虑,
选
制 高的碱性蛋
白 玉米蛋白的
工艺进行优化。
2.2 酶解时间对水解度和)淀粉酶抑制率影响
水解度和制率的影响
2所。随着蛋白 的增加，玉米蛋白的水解度和 产
制率均增加,
当 3 h ,!- 制 , 过
4 h ，水度开始 。这主要是
度 、产 度增加， 产 的
反馈抑制 或 身 失活⑷；同时过度 ；
经产生的活性多肽又被蛋白 ，使多肽片
段 有制活性的特定结构遭到破坏, 从而失 活性[8(，成制 。
倾国倾城简谱, 选取
3 h 为 。
▲ a-淀粉酶抑制率—■—水解度
18.0进 16.0垦 14.0& 12.0廖 10.0
酶解时间/h
A 6.0
图2酶解时间对水解度和！-淀粉酶抑制率影响
2.3 酶解pH 对水解度和a-淀粉酶抑制率影响
图3酶解对水解度和a 淀粉酶抑制率影响
酶解pH 对水解度和！淀粉酶抑制率的影响如
图3所示。由图3可知：碱性蛋白酶pH 在7.0 2
8.0这个阶段时，水解度和a 无
制率上升，到
达pH 8.0时,a 淀粉酶抑制率最大为11.60 %，此，玉米肽水解度最高 13.69 %。过酸或者过
碱都会改变酶的空间结构， 活 ，甚至使
变形而活
脸肿怎么办失'9(，影响其水解度，从而影响a -
淀粉酶的抑制率。因此，本试验选取pH8.0为碱性蛋白的pH。
2.4酶添加量对水解度和a-淀粉酶抑制率影响
酶添加量对水解度和！淀粉酶抑制率的影响如图4所示。碱性蛋白量在1000〜3000U/g ,，够与结合，故水解度增加,！可制之增加。当的量大于3000U/g，随着量的增加，水度：不，而a可的抑制，是为酶的量增大，酶和接触更，制！
活性的物质所致。，选取量3000U/g为碱性蛋白酶的量。
酶添加量/(U/g)
图4酶添加量对水解度和！淀粉酶抑制率影响
2.5酶解温度对水解度和a-淀粉酶抑制率的影响
酶解温度/°C
图5酶解温度对水解度和！淀粉酶抑制率影响
酶解温度对水解度和a-淀粉酶抑制率的影响
5所。随着 温度的增加，水度和a-淀的抑制率呈现先升高的，当酶解温度45C时，水解度和a淀的抑制高。由于温度对碱性蛋白的影响，当温度
像天使一样
高，碱性蛋白酶的结构发生变化［5,10(，影响到蛋白酶水解玉米蛋白的水解度，从而使a-淀粉酶的抑制，选取45C为温度。
2.6响应面试验
2.6.1响应面分析方案及结果
综合单结果，根据Box-Eehnken中心组合试验设计原理，选取酶解时间(B)、酶解pH (B)、量(B)和温度(B)为变量,
a-的制为变量，设计水平响应面，共计29 点，5组为点，设计及结果3，回归模型的方差分析4。
表3Box-Behnken试验设计及结果
序号X1X?X3X4a-A制/% 10-10112.11
2-101014.22
3-110013.06
400-1112.48
5000014.22
6-10-1012.21
7001-114.23
8-100-112.63
90-11013.46
100-10-112.01
11001114.52
12010113.56
13100113.26
14100-113.06
15000014.22
16000014.29
17-1-10011.91
18011014.47
190-1-1011.45
20000014.25
2110-1012.68
22110013.64
23010-113.28
24101014.47
25110013.64
26000014.28
27-110013.06
28000014.22
29100-113.06
利用Design Expert8-0-6分析软件对表3试验结果进行多元回归拟合，型的二次多元回归方程：
a-淀粉酶的抑制率=3-83600B+15-20933X? +0.00295017X3+2.11993X4+0.10250X1X2-0.00055X1X3-0.011500X1X4-0.0000875X2X3+ 0.009X2X4+0.000008X3X4-0.63308X-0.93808X? -0.00000024933X-0.023973X?-109.285
58
注:“ ** ”表示极显著(5 <0. 01 )；“ * ”表示显著(5<0.05)；“ - ”表示不显著；(5〉0. 05)。
表4回归模型方差分析
方差来源方和
自由度均方F 值5值显著性
模型
24.5014 1.75480.56
<0.000 1**0. 3710. 37100.94<0. 000 1**5.07
15. 071 392. 54
<0. 000 1**10.81110. 81
2 969. 38
<0. 000 1**0. 17
10. 1746. 80<0. 000 1**B B 0. 04210. 04211.54
0. 004 3**
雷雨的作者是谁
B B 0. 01210. 0123. 320. 089 7-B B 0. 013
10. 013
3. 63
0. 077 4
-
B B 0.03110.0318.410.011 6*
B B
8.100E-00318. 100E - 003 2.220.158 0
-B B 6.400E-003
1 6.400E-003
1.76
0.206 1-
B 1 2.60
1 2.60
714.05<0.000 1**
B 22 5.711 5.711 567.80<0.000 1**B 230.40
10.40
110.76
<0.000 1**B 24
2.331
2.33639.95
<0.000 1
**
差0.05114 3.641E-003失拟项0.047
10 4. 669E -003
4.360.084 2
-
纯误差
4.280E-003
4 1. 070E -003总和
24.55
28
R 2 =0. 997 9
R 'd =0-95 8
R —=0-88 8
2 -.2 响应面方差分析
由表4回归方程的方差分析可以看出，模型的 5值V0. 01极显著，失拟项5 =0. 084 2 >0. 05，不
显著，说明模型的建立是合理的，并且模型的相关
系数R 2 =0. 997 9，表明预测值和真实值之间高度相
关，在已知的变量范围内，可以用该模型代替实际
试验点推测碱性蛋白酶酶解玉米蛋白粉抑制a-淀
粉酶活性的最优工艺条件。由表4回归方程系数显 著性检验可知，玉米蛋白酶解过程中，影响a-淀粉
酶抑制率的因素按主次顺序排列为酶添加量(B )
>酶解pH (B ) >酶解时间(B 1) >酶解温度(B ),
其中一次项B 1 %B 、BB 达到极显著水平(5 <
0.01)，交互项B 1B 为极显著水平,BB 为显著水
平，其余项均不显著。
根据回归方程计算出最优的酶解条件：酶解时
间3.11 h 、酶解pH 8. 31%酶添加量4 000 U/g 、酶解 温度45. 69 C ，在此条件下,a-淀粉酶抑制率最大值 为 15.056 7%。
2.6.3 验证实验
考虑到实际操作的便利，将酶解条件修正为酶 解时间3.0 h 、酶解pH 8. 30%碱性蛋白酶添加量
4 000 U/g 、酶解温度45.
5 C 、玉米浓缩蛋白稀释料
液比1： 10(g/mL )，在此条件下，测得a-淀粉酶抑制
率为15.01 %，与模型得到最大值的绝对差值为0.
046 7 %，说明运用响应面法优化得到的模型参数
是可靠的，能真实反应酶解条件对a-淀粉酶抑制率
的影响。
3结论
本研究以玉米蛋白粉为原料，采用酶解法制备
具有抑制a-淀粉酶活性的多肽，以蛋白粉的水解度 和对a-淀粉酶抑制率为指标，选择最适蛋白酶为碱
性蛋白酶。通过单因素试验优化了酶解条件，并在
单因素试验基础上，以a-淀粉酶抑制率为指标，通
过四因素三水平的响应分析，进一步优化酶解条
件，得到了玉米蛋白酶解条件的二次多项式回归方
程，经过方差分析，各因素对a-淀粉酶抑制率影响 大小的顺序：酶添加量(B )〉酶解pH (B )〉酶解
时间(B 1) >酶解温度(B )，酶添加量、酶解pH 、酶
解时间、酶解温度对a-淀粉酶抑制率的影响均极显
著。经回归分析并结合实际操作便利，将酶解条件
修正为酶解时间3. 0 h 、酶解pH 8. 30、碱性蛋白酶
添加量4 000 U/g 、酶解温度45.5 C 、玉米浓缩蛋白 稀释料液比1 ： 10 (g/mL )，在此条件下，测得a-淀
制 为 15.01 % )
(下转第155页)
