中国畜牧兽医2018，45") : 1700-1707
China A nim a l H usbandry& V eterinary M edicine
doi： 10. 16431/j. cnki. 1671-7236. 2018. 06. 035
猪源肠球菌中氟苯尼考耐药性调查及
基因环境研究
张平1!，彭琳瑶、徐昌文、李云霞、张安云“
(1.四川大学生命科学学院，动物疾病防控与食品安全四川省重点实验室，成都610041;
2.成都农业科技职业学院，成都611130)
摘要：本研究旨在调查猪场中肠球菌对氟苯尼考的耐药性，检测氟苯尼考耐药基因，并测定肠球菌中氟苯尼考
耐药基因2x A的基因环境，从而分析其可能的传播机理。以四川某猪场分离鉴定的50株肠球菌为研究材料，开
展分离株对氟苯尼考的药物敏感性试验。运用P C R技术检测分离株中氟苯尼考耐药基因5/.、/2^、/2&、1〇尺
和e3D L136。运用热不对称性P C R(T A I L-P C R)技术获得/e A基因周围序列信息，分析其基因环境。运用反向
P C R技术验证序列中环化结构的存在，同时运用交叉P C R技术检测20株猪源肠球菌/e x A基因的基因环境。结
果显示，在分离出的50株肠球菌中，有34株对氟苯尼考耐药（M I C+16m g/L)，耐药率为68\。P C R结果显示，20
株含有/x A基因，28株含有/x B基因！）株同时含有这两种基因’T A I L-P C R和测序结果显示，分离株D K C5
中秋节的节日风俗中/x A基因存在于12 945 b p的T n554转座子中’T n554转座子可形成环化结构，其中的重复序列可形成含有
2 395 bp的环化结构。本试验结果表明，猪源肠球菌对氟苯尼考耐药率较高，主要由/X&和/x B基因介导，
/x A基因存在于T n554结构中。预测/x A基因是经两次插入整合后进入D K C5分离株基因组序列的，这为
/x A基因的水平传播提供了遗传依据。
关键词：肠球菌；氟苯尼考；耐药性/x A基因；T A I L-P C R；基因环境
中图分类号：S852. 61 文献标识码：A文章编号：1671-7236(2018)06-1700-08
Study on Florfenicol Resistance and/e x A Genetic Environment in
E n tero co ccu s from Swine
Z H A N G Ping1，，P E N G L i n y a o1，X U C h a n g w e n1，LI Yunxia1，Z H A N G A n y u n1"
(1. Animal Dia Prevention and Food Safety Key Laboratory o f Sichuan P rov
College o f L ife Science，Sichuan University，Chengdu 610041，China;
2.Chengdu Agricultural College，Chengdu 611130, China)
Abstract：This study was aimed to investigate the resistance of Enterococcus to florfenicol in pig
farms and analyze t h e florfenicol resistance genes.Al s o,the gene environments of florfenicol re
sistant gene/exA in Enterococcus were determined to identify the underlying transmission m e c h a
nism.Fifty strains of Enterococcus isolated from a pig farm in Sichuan province were ud as the
rearch materials to perform the drug susceptibility test of florfenicol.T h e florfenicol resistance
genes c/r，/exB，/exA，/loR and estDL136were detected by P C R.T h e information of gene envi
ronment of/exA gene was obtained by T A I L-P C R and further analyzed.In addition,t h e prence
of cyclized structure in the quence was verified by P C R.Meanwhile,t h e g
20 fexA-positive isolates was confirmed by cross-P C R.T h e results showed that a m o n g the 50 *
收稿日期：2017-11-21
基金项目：国家自然科学基金（31572548)；四川省科技厅应用基础项目（2015JY0221)
作者筒介：张平（1982-)，女，四川成都人，硕士，副教授，研究方向：临床病原细菌耐药性及兽用中药制剂，E-mail:340447406®qq com
*通信作者：张安云（1981-)，男，重庆人，博士，副教授，研究方向：畜禽病原细菌及其耐药性，E-mail:zhaIlganyun@Gcu.edu
6期 张平等：猪源肠球菌中氟苯尼考耐药性调查及/ex A基因环境研究
strains of Enterococcus were resistant to florfenicol(M I C+16 m g/L)，w i tha resistant rate of 68%. P C R results showed that 20 strains contained/e x A gene,28 strains contained/e x B gene，and 14 strains contained both of the two genes.Besides,T A I L-P C R and quencing showed/e x A gene in isolated strain D K C5was located in the 12 945 bp T n554 transposon.In particular,the
T n554 transposon could form a cyclized structure and i ts repeating quence could also form a
local cyclized structure containing 2 395 b p.T h e resistance rate of Enterococcus from swine to florfenicol was high,and was mainly mediated by/e x A and/e x B genes.Specifically,/e x A gene was located in the T n554 structure.It was predicted that/e x A gene was inrted into D K C5 strain genome quence by two inrtions,which provided a genetic basis for the horizontal
transmission of/e x A gene.
Key w ords：Enterococcus；florfenicol；resistance；/e x A gene；T A I L-P C R；genetic environm
ent
肠球菌广泛存在于人和动物体内，从而成为了 耐药基因的基因库[1]，并在特定条件下提供将耐药基因水平传播给其他致病菌的可能[2]。近年来随着 抗菌药在临床上的广泛应用，肠球菌对不同抗菌药的耐药情况也在改变，而氟苯尼考作为氯霉素禁用后的主要替代品种，在兽医临床上被大量使用，目前 已报道的氟苯尼考耐药基因有e x A3、/Z〇R[4-9]& /x B[10—11]、e3〇L136[10—11]、c/r[12—1/]和 /x A[13，18—22]。肠球菌作为携带耐药基因的细菌种类之一，其对氟 苯尼考的耐药性分子流行病学及其耐药基因在规模 化猪场肠球菌中的分布情况无系统报道，/x A基因 在肠球菌中的流行性和基因环境也尚未见报道。本 研究通过对猪源肠球菌中氟苯尼考耐药性进行分子 流行病学调查，了解其耐药现状，筛选出氟苯尼考耐 药基因/x A的阳性菌株，并对其进行基因环境检测，以期为了解其传播机制提供判断依据。
1材料与方法
1.1 菌株
50株肠球菌于2015年7月先后从四川某规模 化猪场分离，经16S r D N A测序鉴定，其中保育猪舍 和后备母猪舍猪新鲜粪样中各分离20株，10株从 猪舍内外苍蝇中分离，均由四川大学动物疾病防控与食品安全四川省重点实验室保存。金黄色葡萄球 菌A T C C 29213为四川大学动物疾病防控与食品安全
四川省重点实验室保存的药敏质控菌株。
1.2主要试剂与仪器
Pfrier培养基购自成都博瑞克生物技术有限公 司；2 X T a g P l u s P C R M a s t e r M i x均购自天根生化科技（北京）有限公司；G o l d V i e w染料、琼脂糖、T r a n U K D N A M a r k e r均购自成都飞克（天泰）生物 科技有限公司；革兰氏阳性细菌板购自Bio-R e d公司。P C R仪、D Y Y-n恒压恒流电泳仪、G e n e凝胶 成像仪和脉冲场凝胶电泳均购自Bio-R a d公司；隔 水式恒温培养箱。
1?最小抑菌浓度测定
采用琼脂稀释法测定氟苯尼考对50株临床肠球 菌的最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration，M I C)值，测试浓度范围为：0. 125!256啤/m L，并分 析其M I C5。和M I C9。。以C L S K2010年版）公布的 药敏试验解释标准分析结果。
1.4氟苯尼考耐药基因PCR检测
微信申诉解封参考文献中耐药基因c/r[12]、/x B[10]、/x A[18]、/ZoR[4]和 e3〇L136[11]序列设计引物，引物信息见表1。引物均由生工生物工程（上海）股份 有限公司合成。P C R反应体系252X P C R T a g M i x 12.5p L，上、下游引物（20pmol/-L)各 1p L，模板D N A1p L^d H z O补至25，。P C R反应条 件：4
°C预变性5m i n;94 °C变性30 s，退火（退火 温度见表1)30s，72 °C延伸2 m i n，共31个循环；
72 °C延伸10 m i n。对50株肠球菌进行以上氟苯尼 考耐药基因扩增，符合目的大小的产物由生工生物工程（上海）股份有限公司测序，利用N C B I的B L A S T软件对测序结果进行耐药基因的同源性比
分。
1.5 /exA基因环境检测
从50株肠球菌中选择/x A基因阳性，编号为 D K C5的分离株，运用热不对称P C R (T A I L-P C R)反应技术使用的简并引物（表2)有效扩增特异产物，第3轮反应产物由生工生物工程（上海）股份有 限公司测序。
利用S e q m a n软件将测序所得序列与已知序列 进行序列拼接。循环运用T A I L-P C R反应技术获得/x A基因上、下游基因环境。通过N C B I 的
1702 中国畜牧兽医45卷B L A S T软件比对分析，确定/e：r A基因环境对应基O R F查找，获得该基因及其上、下游基因环境的全因。拼接序列使用N C B I的O R F F in d e r软件进行序列。
表1氟苯尼考耐药基因扩增引物信息
Table 1 Primer information of florfenicol resistance genes
目的基因Target
genes
引物序列
Primer quences (5/(3/)
产物大小
Product
size/bp
退火温度
Annealing
temperature/°C
香菇怎么做
GenBank登录号
GenBank
accession N o.
参考文献[4’1l!1218]
References^'1012'18*
cfr F: TGA A GTAT A AAGCAGGTTGGGAGTCA R：ACCATATAATTGACCACAAGCAGC 74655AJ249217Schwarz et al.
(2000#
fexB F: ACCT A TCCCTAA A CTCCC
R: T A ATCCTGTTCTCGGTGT 1 01547JN201336Liu et al. (2012)
/ex A F: GTACTTGTAGGTGCAATTACGGCTGA R: CGCATCTGAGT A GGAC A TAGCGTC 1 27355AJ549214Kehrenberg et al.
(2004#
/6R F: CTGA A C A CG A CGCCCGCT A T
R: ACAGG A CCGCTCCGC A AAC 75156D37826Kim et al. (1996)
est@L13(F: TGCCCGC A CCCGATTTCT
R: GATTGG A TGC A CCTCGTTCTA
86453JN242251Tao et al. (2012)
表2 TAIW-PCR简并引物信息
Table 2 Simple primers information for TAIL-PCR
引物名称Primers name引物序列Primer quence (5’— 3’）
AD1 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/A)N(G/C/A)NNNGGAA
AD2 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/T)N(G/C/T)NNNGGTT
AD3 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/A)(G/C/A)N(G/C/A)NNNCCAA
AD4 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/T)(G/A/T)N(G/C/T)NNNCGGT
AC1 ACGATGGACTCCAGAG
1. 6基因序列环化结构验证
选择/a A基因上、下游分别设计反向扩增引.(D R-F：5,-C A G A A G T T G TT C TT C C A G C T G- A A C A3)和（D R-R: S^G A CTG G TG CG CTA G- C A C T T T T T A A T-38对DKC5 基因组DNA 进行反向P C R扩增，将碱基重复序列包含在产物中，符合目的大小的产物由生工生物工程（上海）股份有限公司测序后用Mega 5. 0软件与目的序列进行比。
1.7 交叉P C R技术调查T n554结构在其他fexA 阳性菌株中的存在情况
运用交叉P C R技术对20株/e：r A基因阳性菌分A、B、C3段序列与分离株D K C5中/e：r A基因环境对应的T n554结构进行调查，引物信息见表3。P C R扩增20株/e：r A基因阳性菌株的基因组DNA
后，统计含A、B、C结构的株数和菌株编号。
表3交叉PCR引物信息
Table 3 Primers information for cross-PCR
P C R反应P C R reactions引物序列Primer quences (5’— 3’）产物大小Product size/bp A A F:G T G A A G G T T C A A A G G A T A G A A G T G G 4 087
B A R:T G
C C A C A T T C G A G C T A G G G T
B F：A T T
C G C G A G A T G C C G A G T G A 4 897
C B R:A C G A T G G A C T C C A G T C C G G
C F:G T A C T T G T A G G T G C A A T T A C G G C T G A
C R:C C A T C G A T C G G C A A A C T C A A A A G G T C T T C A C 4 119
张平等：猪源肠球菌中氟苯尼考耐药性调查及/^：A 基因环境研究
1703
(期
2 结果
示，其结果在8〜128-g /m L 之间（表经计算可2.1 M IC 测定结果
知，50株菌的M I C 5〇为32邱/m L ，M I C ?。为50株肠球菌分离株对氟苯尼考的M I C 值显
6) p g /m L ，对于氟苯尼考的耐药率为68\。
表
4 50株肠球菌对氟苯尼考的MIC 值和耐药率
Table 4 MIC and resistant rate of 50 strains of Enterococcus
数StrainsNo. /株
M I C /(—g/mL)
平均M I C
Average MI C /(-g /m L )
M K W (—g/mL)
M I C 90/(g/mL)率
Resistant rate/ \20(保育猪类便）20(Feces of weaned pigs)3232.03232100(20/20)20(后备母猪类便）20(Feces of replacement gilts)8 〜12867. 26412860(12/20)10(苍蝇）10(Flies)
8〜64
19. 2
8
64
20(2/10)
2.2
氟苯尼考耐药基因检测结果50株分离菌中，仅检测出/e x A 和/e x B 基因， 没有检测到c /r 、
和如D L 136基因，其中
/x A 基因在20株分离菌中检测出，/x B 基因在 28株分离菌中检测出，1)株同时检测到/x A 和
/x B 基因（表5)。部分菌株/x A 和/x B 耐药基 因的部分P C R 产物电泳结
图1、2。
基因
性克隆均由生工生物工程（上海）股份有限公测 序，序列比对表明，与G e n B a n k 中相应基因的同源 性为99.3\〜100. 0\，表明P C R 检测结果准确。
表
5氟苯尼考耐药基因检测结果
Table 5 Detection result of florfenicol resistance gene
株
耐药基因 Drug resistance genes
c/r
/6R
/ex A
/exB
estDL136
20(
保育猪类便）20(Feces of weaned pigs)00418020(后备母猪类便）20(Feces of replacement gilts)
00128010(苍蝇）10(Flies)00420合计Total
20
春天咳嗽
28
M l 23456789 10
bp 5000 3000 2000
1000
750 500250
100
民诉法M ，Trans2K D N A Marker;1，阴性对照；2，阳性对照；3〜10，分离菌株
M ，Trans2K D N A Marker; 1，Negative control;2,Positive control;3-10,Isolated strains吉娃娃狗
图
1 /e M 基因PCR 产物电泳图
Fig. 1 PCR product electrophoretogram of /exA
gene
1704中国畜牧兽医45卷
M12345678910 11 12
bp
5000
3000
2000
围棋英语
1000
750
500
250
100
M，Tmns2K DNA Marker•(〜10，分离菌株；11，阴性对照；12，阳性对照
M，Trans2K DNA Marker; 1-10，Isolated strains; 11，Negative control; 12，Positive control
图2 /VxB基因PCR产物电泳图
Fig. 2 PCR product electrophoretogram of fexB gene
2?基因环境检测结果
使用T A IL-P C R方法检测出分离株D K N5的包括/e x A基因在内的19 123 b p序列。通过NCBI 的BLAST 比对分析，绘制出/x A基因环境图谱（图3#所获序列的G + C含量为35. 2\，包含了16个O R F s，其中包括大环内酯类、林可酰胺类和链阳菌素B耐药基因e r m A，位于/x A基因5'端3 016 b p处，与/x A基因反向；还包括氨基糖苷类耐药基因aw〖（9)-I a，位于/e x A基因5'端3 872 b p处，与/e x A基因同向。
箭头表示基因的位置和转录方向；不同的耐药基因或转移元件用不同的花纹表示；同源性高于95\的序列用灰色阴影表\
The arrows indicate the location of the genes and the direction of transcription；Different resistance genes or transposable elements are showed by different patterns；Gray shadows indicate the quence with more than 95 \homology
图3 DKC5菌株中f x A基因环境图谱
Fig. 3 fexA gene environment map of DKC5 strain
进一步分析得知！2 945 b p插入序列前6 565 bp 序列与已报道的金黄色葡萄X03216中Tn554转座子具有高度的同源性，仅缺失了e rm A基因后端107 b p序列。另外，在该插入序列中有两段长为325 b p的正复序列，分别位于插入序列第
6 240—6 564位和第12 617—12 941位。据此可推断，插入C P004081基因组序列中的12 954 b p序列是由X03216中的T n554转座子变化形成。
在两段325 b p重复序列间有一段长2 395 bp 的序列与金黄色葡萄球菌质粒p S A737中的序列K C206006具有100. 0\的同源性，/x A基因就位
于这段序列之中。
2.4基因序列环化结构验证结果
/x A基因环境中存在T n554转座子环化结构和环化结构缺失后原序列连接的结构，/x A基因环境中出现含有325 b p的重复序列！序列环化（图4
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