植物学通报 2005, 22 (6): 715￣722 Chine Bulletin of Botany
专题介绍
植物 SNARE 蛋白的结构与功能①
鲍永美 王州飞 张红生 ②
(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 南京 210095)
摘要
在真核生物细胞囊泡运输过程中的膜融合主要是由SNARE蛋白介导的, SNARE蛋白的结构高
家乡的天空二次多项式度保守。研究发现, 植物中的SNARE蛋白促进植物细胞板形成, 能与离子通道蛋白相互作用, 有利于 植物的正常生长发育, 能提高植物的抗病性及参与植物的向重力性作用。应用基因组学和蛋白质组学 技术结合细胞学水平上的分析方法有助于深入揭示植物SNARE蛋白家族成员的功能, 明确SNARE蛋 白在信号转导途径中的作用, 阐明动植物免疫系统的区别和联系。 关键词 SNARE蛋白, 结构, 功能
Structure and Function of SNAREs in Plant
BAO Yong-Mei WANG Zhou-Fei ZHANG Hong-Sheng②
(State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095)
Abstract
The membrane fusion in vesicle trafficking in the cells of eukaryotic organisms is
mediated by soluble-N-ethyl-maleimide-nsitive fusion protein attachment protein receptor (SNARE) proteins, which are highly conrved in their structures from various species, including yeast, animals and plants. Increasing rearch has demonstrated many tissue- or subcellularspecific components of SNAREs involved in the formation of the cell plate, interacting with ion channel proteins, and gravity nsing in plants. SNARE proteins might play important roles in plant growth, development and respon to abiotic and biotic stress. The application of genomics and proteomics approaches, as well cytological methods, will accelerate our understanding of diver functions of the plant SNARE family and their specific location in the signal transduction pathway, and the differentiation and relation between animal and plant immunity systems. Key words SNARE protein, Structure, Function 植物细胞内可溶性物质的运输主要是通 过细胞内的囊泡(vesicles)在不同
细胞器膜结 构间穿梭运输而实现(Sanderfoot et al., 1999), 囊泡充当了整个系统的运输工具。大多数可 溶性“货物” (cargo)首先从内质网进入系统, 接着被囊泡运输到高尔基体, 然后进入高尔基
①国家自然科学基金项目(30470921)资助。 ②通讯作者。Author for correspondence. E-mail:hszhang@njau.edu 收稿日期: 2005-05-10 接受日期: 2005-09-27 责任编辑: 于昕
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体反面网管结构(trans golgi network, TGN) (Neumann et al., 2003; Reinhard et al., 2003; Uemura et al., 2004)。装有“货物”的囊 泡有几个不同的去向: 1)载有分泌性蛋白的囊 泡运输到质膜, 与质膜融合后将“货物”释 放到细胞壁外; 2)载有膜组分的囊泡通过与质 膜融合后将“货物”释放到质膜(PM)上; 3) 载有液泡蛋白的囊泡将“货物”运输到前液 泡区室(prevacuolar compartments, PVC)或液 泡上, 到达目的地后囊泡通过与目标膜融合将 “货物”释放( 图 1 ) ( S a n d e r f o o t e t a l . , 2 0 0 0 ) 。绝大多数的膜融合过程都离不开 SNARE蛋白(soluble-N-ethyl-maleimide-nsitive fusion protein attachment protein receptor) 的参与, 所以植物体内有很多不同种类、位 于不同位置的SNARE蛋白, 以实现整个植物 细胞内“运输系统”的正常运转(Bassham et al., 2000)。对动物细胞 SNARE 蛋白的研 究表明, 它主要与动物体内神经递质传递和免 疫系统运转有关, 乙酰胆碱等化学信号物质往 往需要通过囊泡与目标膜之间
的融合才能实
现在细胞内部的运输, 这些膜融合过程离不开 NSF ﹑ SNAP 和 SNARE 蛋白。NSF ( N ethylmaleimide-nsitive fusion protein)是 N乙基顺丁烯二酰亚胺敏感融合蛋白, 是细胞内 囊泡运输过程中发挥重要作用的一种ATP酶, SNAP 蛋白(synaptosomal-associated protein) 是可溶性的 NSF 的附着蛋白,SNARE 蛋白是 SNAP 蛋白的受体。 不同物种的NSF ﹑ SNAP 和SNARE蛋白在进化上高度保守, 它们在细 胞内协同作用，参与各种膜融合过程。
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植物SNARE蛋白的分类
中国二重植物细胞囊泡运输过程中的膜融合主要
是由SNARE蛋白介导的, SNARE蛋白的分类 方法有2种: 一种是根据膜融合过程中SNARE 蛋白所处位置, 分为囊泡膜(vesicle)SNARE蛋 白(v-SNAREs)和靶目标膜(target )SNARE 蛋 白(t-SNAREs)两类(Sanderfoot et al., 1999); 另 一种是根据SNARE蛋白的氨基酸序列相似性 进行分类, Fasshauer等(1998)比较了人和酵母 的多个SNARE蛋白序列, 发现不同SNARE蛋
图 1 囊泡在植物细胞内的运输过程 (绿色和红色圆圈标出小囊泡, 圆圈内的黑点表示可溶性 ‘ 货物 ’ ) Fi
g. 1 Vesicles trafficking in the plant cell (Sanderfoot et al., 2000) (Green and red circles indicated the vesicles; the black dots within circles indicated the soluble cargos)
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鲍永美等: 植物 SNARE 蛋白的结构与功能
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白尽管在氨基酸长度和结构上有所区别, 但有 一段序列(长度为55个氨基酸)是高度保守的, 称之为“SNARE 结构域(SNARE-domain)” , 是SNARE核心复合体(core complex)形成时各 个成分相互作用的部位。 根据位于SNARE结 构域中间的氨基酸残基是精氨酸, 还是谷氨酰 胺, 将SNAREs家族成员分为R-SNAREs和QSNAREs 两类。Bock 等(2001)进一步根据蛋 白序列的聚类分析结果, 将SNAREs家族成员 划分为 Q a - S N A R E s、Q b - S N A R E s、QcSNAREs 和 R-SNAREs四类。 由于 SNARE 蛋 白可以在多个膜融合过程中起作用, 它在某个
膜融合过程中可能是囊泡上所必需的, 而在另 一个膜融合过程中可能是靶目标膜所必需的, 所以前者根据位置将其划分为v-SNAREs或tSNAREs并不很准确, 目前绝大多数研究都参 照第二种分类方法(McNew et al., 2000b)。
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植物SNARE核心复合体的结构
空无一人的意思囊泡膜与靶目标膜融合时，会形成SNARE
核心复合体(称为 SNARE pin 或 SNARE core complex)(图 2A), 它是由 Q-SNAREs 和 RSNAREs的 4 个 SNARE 结构域结合在一起形 成的四螺旋束, 其中3个螺旋是位于靶目标膜
图 2 植物 SNARE 蛋白介导的囊泡运输过程中的膜融合机制 A. SNARE核心复合体的组成及结构; B. 在膜融合过程中 SNARE 蛋白作用流程图 粉红色示 R-SNARE 结构域; 蓝色示 Qa-SNARE 结构域; 黄色示 Qb- 和 Qc-SNAREs 结构域 Fig. 2 Mechanism of SNAREs in the vesicle fusion A. Structure of the SNARE core complex; B. Regulation of the SNAREs cycle in the vesicle fusion. (Pratelli et al., 2004) R-, Qa-, Qb- and Qc-SNARE domains are indicated by pink, blue and yellow respectively
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(t-)Q-SNAREs 上的 Qa- ﹑ Qb- 和 Qc-SNARE 结构域, 另一个螺旋是位于囊泡膜 ( v - ) R SNAREs上
的R-SNARE结构域(Pratelli et al., 2004)。 构成SNARE核心复合体的SNARE蛋 白通常包括1个突触融合蛋白(Syntaxin, 含有 Qa-SNARE结构域)﹑ 1个SNAP25类蛋白(含 有Qb-和Qc-SNARE结构域)和1个VAMPs(含 有 R-SNARE 结构域)。 2.1 Syntaxin Syntaxin也叫突触融合蛋白, 其C端为一 个跨膜结构域, “锚定”在靶目标膜上, 靠 近跨膜结构域的是Qa-SNARE结构域(Gln位 于中央), 用于与其他SNARE蛋白的螺旋结构 结合形成 SNARE 核心复合体, 蛋白的 N 端依 次排列的是Ha﹑Hb和Hc三个α-螺旋 (Pratelli et al., 2004)。Syntaxin 亚家族的成员众多, N 端的螺旋也有不同, 但Qa-SNARE结构域都是 高度保守的, 有些蛋白成员的整个蛋白序列都 高度相似。Sanderfoot 等(2000)的研究表明, 序列同源性高的Syntaxin功能相似, 亚细胞位 置相同, 在基因结构上表现为内含子的数目和 位置相同。 2.2 SNAP25类蛋白 SNAP25类蛋白首先是在哺乳动物中发现 的, 此类蛋白在结构上的特征是有2个螺旋结 构(Qb- 和 Qc-SNARE 结构域), 分别位于 N 端 和 C 端, 共同参与了 SNARE 核心复合体的形 成。SNAP25 类蛋白没有跨膜结构域但能牢 固地附着于膜上, 主要因为中间的富半胱氨酸 结构域(cysteine-rich domain), 半胱氨酸残基 的数目一般为 4 个左右, 其数目和位置对 SNAP25类蛋白功能起决定性的作用( Salaü n et al., 2004)。 2.3 VAMPs VAMPs 也叫小突触囊泡蛋白, 其 C 端有 一个跨膜结构域“锚定”于小囊泡膜上, 紧 邻跨膜结构域的是一个螺旋结构R-SNARE结 构域(Arg 位于中央), 与 Q-SNAREs 的 3 个螺
旋结合形成 SNARE 核心复合体。
3 植物SNARE蛋白介导的膜融合 机制
SNARE蛋白参与的膜融合过程是按照一 定的流程进行的(图2B)。 在膜融合开始阶段, 首先是小囊泡停靠在质膜表面, Syntaxin 与 Sec类蛋白特异结合(Sec类蛋白与Syntaxin的 Ha-Hb-Hc 部位结合, 使得 Syntaxin 的 QaSNARE 结构域暴露出来可以和其他 SNARE 结构域结合形成SNARE复合体, 形成松散型 反式SNARE复合体(loo trans-complex), 随 后 SNARE 核心复合体装配, 使两膜靠近、弯 曲, 形成严紧型反式 SNARE 复合体(tight trans-complex), 当两膜近端结合后, 顺式 SNARE复合体(cis-complex)形成, 融合孔逐渐 变大, 囊泡中的物质释放, 融合完毕。然后 NSF发挥ATP水解酶的作用, 使SNARE复合 体解聚, 处于游离状态的syntaxin﹑ SNAP-25 和VAMP经再循环进入到下一个膜融合过程 中(张弗盈等,2004)。 顺反式SNARE复合体的 区别在于 R-SNAREs 和 Q-SNAREs 是否“锚 定” 在同一个膜上, 膜融合前R-SNAREs和QSNAREs 分别“锚定 ”在囊泡膜和靶目标膜 上称之为反式SNARE复合体, 膜融合时囊泡 膜和靶目标膜融合为同一个膜, 此时SNARE 复合体由于“锚定 ”在同一膜上称之为顺式 SNARE复合体(Pratelli et al., 2004)。
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4.1
植物SNARE蛋白功能
与植物细胞板形成有关 L u k o w i t z 等( 1 9 9 6 ) 在拟南芥中发现
SNARE蛋白能够促进细胞板的形成。 Lauber 等(1997)发现KNOLLE(一种Syntaxin)是与细 胞板形成相关的蛋白。以下蛋白也被相继证 明与细胞板形成有关: 1 ) A t S N A P 3 3 (synaptosomal-associated protein 33 kD), 是 SNAP25的一个同源蛋白( Hee et al., 2001);
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2) NPSN11(novel plant-specific SNARE), 植物 特有的 SNARE 蛋白(Zheng et al., 2002); 3) KEULE, Sec 类蛋白(Assaad et al., 2001)。另 外, 拟南芥中 AtCDC48 蛋白也与细胞板形成 相关(Rancour et al.,2002)。这些 SNARE 蛋 白通过参与细胞融合过程而促进植物细胞板 形成(Mayer et al., 2004)。 4.2 与植物离子通道蛋白相互作用 植物SNARE蛋白可以与离子通道蛋白相 互作用, L e y m a n 等( 1 9 9 9 ) 在烟草中发现 NtSyp121(Nt-Syr1)基因编码Qa-SNARE蛋白, 且在烟草植株的各个部位都有表达, 它的表达 还受到 ABA ﹑ 盐﹑ 干旱和伤害的诱导, 删去 NtSyp121部分序列或使用该基因编码蛋白的 抑制剂BotN/C, 使叶片保卫细胞中ABA对K
－ +初一学习方法
AtSyp22 和 AtVti11 分别编码拟南芥中的 QaSNAREs 和 Qb-SNAREs 蛋白, AtSyp22 或 AtVti11 基因的突变体茎部形态异常, 且植株 的生长不受重力作用(Morita and Tasaka, 2 0 0 4 ) 。A t S y p 2 2 单核苷酸突变造成离体 SNARE核心复合体结构不稳定, 推测SNARE 复合体结构的改变使得液泡内造粉体沉积受 到影响, 而导致细胞不能感知重力(Kato et al., 2002; Yano et al., 2003)。
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植物SNARE蛋白研究展望
McNew等(2000a)对人类﹑果蝇﹑酵母和
拟南芥的全基因组序列进行SNARE蛋白基因 的预测, 发现它们所含SNARE蛋白家族成员 的数目分别为 35 ﹑ 20 ﹑ 21 和 68, 拟南芥中 SNARE蛋白数目明显高于其他物种, 且组成 复杂。该研究从全基因组的水平上反映出植 物SNARE蛋白分布的广泛性, 为深入研究植 物 SNARE 蛋白的功能提供了重要的理论依 据。目前许多真核生物全基因组测序已经完 成, 这为弄清SNARE蛋白家族在不同真核生 物基因组范围内的分布和推测其功能提供了 大量的信息, 也有利于发现更多新的SNARE 蛋白, 如拟南芥 SNARE 蛋白 SYP22 的鉴定 (Carter et al., 2004a)。拟南芥中 NPSN 家族 的3个成员为植物特有SNA
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RE蛋白(Zheng et al., 2002), 目前已证明该家族蛋白参与植物细 胞内膜融合过程, 这些蛋白既然是植物所特有 的, 它们在植物特殊的生理环境中是否还起着 其他作用呢？如果将生物化学和基因组蛋白 质组学方法结合起来, 利用更多类似于GFP的 标记将参与膜融合过程的各个SNARE蛋白区 别开来, 将有利于深入研究SNARE蛋白在植 物细胞代谢过程中的功能( C a r t e r e t a l . , 2004b)。 从植物 SNARE 蛋白功能研究进展来看, SNARE蛋白的基本功能是参与囊泡运输过程, 后来发现可以促进植物细胞板形成, 与离子通
和CI 离子通道的调节受阻, 表明该蛋白在烟 草叶片气孔关闭活动中起作用, 并且与部分离 子通道蛋白相互作用。 4.3 与植物抗病作用有关 Nü h等(2003)采用蛋白质组学的方法发 现 AtSyp121 同源基因 AtSyp122 的磷酸化受 到细菌鞭毛蛋白激发子 flg22 的诱导, 并且该 蛋白的离体磷酸化过程与 Ca
2+ 2+
相关, 表明
AtSyp122的磷酸化可能与细菌激发子诱导的 Ca 信号通路相关, 进而参与了拟南芥的抗病 过程。Collins 等(2003)在拟南芥和大麦中分 别发现了 NtSyp121 的同源基因 A t S y p 1 2 1 (PEN1)和HvSyp121(ROR2), 它们在植物叶片 抵抗大麦白粉病菌丝侵染的过程中起着重要 作用。Wick 等(2003)的研究发现 AtSNAP33 的表达受到多种病害( P l e c t o s p o r i u m tabacinum, Peronospora parasiti
ca, P s e u d o m o n a s s y r i n g a e ) 的诱导, 并发现 AtSNAP33 参与依赖于 SA 和不依赖于 SA 的 两种抗病信号途径, 表明植物SNARE蛋白通 过参与抗病信号途径而增强植物的抗病性。 4.4 与植物的向重力性有关 S N A R E 蛋白与植物的向重力性有关,
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道蛋白相互作用, 提高植物的抗病性及参与植 物的向重力性作用。目前, 除了已发现植物 SNARE蛋白通过参与膜融合过程促进植物细 Collins等(2003)在研究与大麦非寄主抗性相关 基因HvSyp121时, 发现其突变体叶片被侵染 部位聚集大量载着 H2O2 的囊泡, 推测突变体 中囊泡未能与质膜融合, H2O2介导的抗病信号 转导途径受阻, 使得病原菌分泌的有毒物质进 入植物体内致病(Dangl et al., 2001; Tsanko et al., 2005)。 植物SNARE蛋白参与膜融合过程 的作用是针对单个细胞活动而言的, 要想弄清 SNARE蛋白对整个植株的作用是否基于在膜 融合过程中的基本作用, 细胞学水平上的研究 应该是解决这个问题的关键所在。 许多植物SNARE蛋白已经被发现, 植物 SNARE蛋白不仅对植物生长发育起作用, 在 抵御生物与非生物胁迫过程中也起重要的作 用(Pratelli et al., 2004)。 Zhu等(2002)在拟南 芥中发现 OSM1/SYP61 基因与渗透胁迫及气 孔关闭有关, 推测部分SNARE蛋白同时参与 了植物中依赖于 ABA 和不依赖于 ABA 的非
生物胁迫信号转导过程。在动物中, SNARE 蛋白可以与 G 蛋白受体 CIRL 作用, 从而调控 了神经递质的传递(Fujita et al., 1998), 植物中 迫条件下的信号转导途径。弄清 SNARE 蛋 白在信号转导网络中的具体位置和囊泡内装 载的“货物”成分应该也是今后研究的重 点。植物中 SNARE 蛋白与植物的基本抗病 性即非寄主抗性相关, 人们很容易会想到植物 和动物在抗病方面的联系, 目前越来越多的证 据表明植物和动物一样体内存在着一个免疫 系统, 如植物的系统获得性抗性(SAR)(Dong, 2001; Holt et al., 2003; Forouhar et al., 2005)。 如果能从SNARE蛋白家族着手来进一步研究 动植物内膜系统的差异可能会发现动植物免 疫系统的区别和联系。此外, 通过基因工程 的方法将 SNAREs 家族的部分重要基因转入 作物用于改良作物的抗病性和生长状况将是 一个非常有意义的研究内容。 致谢 南京农业大学生命科学学院张炜教 授在本文的完成过程中提出了许多宝贵的 意见, 特此致谢！
胞板形成外, 其余功能的作用机制还不清楚。 SNARE蛋白也可能通过与G蛋白作用参与胁
参 考 文 献
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