植物学报 Chine Bulletin of Botany 2011, 46 (3): 285–292,
doi: 10.3724/SP .J.1259.2011.00285 ——————————————————
收稿日期: 2010-10-18; 接受日期: 2011-01-14 基金项目: 国家自然科学基金(No.30900973) * 通讯作者。E-mail: wzc@henu.edu
甘露醇对拟南芥基因组DNA 甲基化的影响
杜亚琼, 王子成*项目建设的必要性
河南大学生命科学学院植物种质资源与遗传工程实验室, 开封 475004
摘要 以拟南芥(Arabidopsis thaliana )为材料, 研究不同浓度甘露醇处理下拟南芥幼苗生长发育及其基因组DNA 的甲基化
水平和变化模式。结果表明, 用50、100、150和200 mmol·L ―1
甘露醇处理拟南芥种子会对拟南芥幼苗的形态特征和生长态
势产生影响; 甲基化敏感扩增多态性(methylation-nsitive amplification polymorphism, MSAP)分析表明,
经50、100、150
和200 mmol·L ―1
甘露醇处理后, 基因组DNA 甲基化比率分别为17.75%、21.15%、15.49%和46.10%。甘露醇处理使拟南
西湖游记芥发生基于DNA 甲基化水平和模式改变的表观遗传变异。与对照相比, 在50、100、150和200 mmol·L –1甘露醇处理下拟南芥幼苗基因组DNA 的甲基化和去甲基化比率分别为5.78%、15.48%、10.71%、33.73%及10.98%、5.36%、8.33%、7.69%。由此推测, 5-甲基胞嘧啶百分含量随着甘露醇胁迫的增强而发生不同程度的变化。 关键词 拟南芥, DNA 甲基化, 甘露醇, MSAP
杜亚琼, 王子成 (2011). 甘露醇对拟南芥基因组DNA 甲基化的影响. 植物学报 46, 285–292.
甘露醇(mannitol)是一种植物组织相容性溶质, 对植物培养细胞无毒害, 在生理学研究中可被用作组织液吸收剂, 被认为是比PEG26000更好的水分胁迫因子(赵宇玮等, 2005)。研究发现, 甘露醇预处理比低温预处理和对照能明显地提高大麦(Hordeum vulgare )花粉粒存活率和质量, 有利于进一步分裂形成胚状体和愈伤组织; 并能明显提高大麦花药培养愈伤组织诱导率、绿苗分化率及绿苗产量(刘辉等, 2009)。甘露醇高渗处理可促进根癌农杆菌对石斛兰(Dendrobium )的转化效率(冯莹和赖钟雄, 2009)。
在进行植物组织培养时, 添加一定浓度的甘露醇可以抑制植物的生长, 因而甘露醇被普遍用来保存种质资源, 保存时间为1–2年。而Harding(1994)发现高渗透胁迫能够影响植物DNA 甲基化, 甘露醇处理可影响马铃薯(Solanum tu-berosum )基因组DNA 和rDNA 的甲基化状态。
DNA 甲基化是表观遗传学研究的热点之一。在生物进化历程中, 甲基化参与了越来越多的生物学过程, 包括基因的表达调控、胚胎发育、细胞分化、基因组印迹、X 染色体失活等(Zilberman, 2008)。植物的表观遗传调控如DNA 甲基化, 不改变DNA 序列, 而通过对基因组进行可塑性的修饰, 使植物能够相对快速地适应新的环境条件(Cauvic et al., 2005)。DNA
洙
甲基化水平的降低对植物的一些重要性状会产生极为重要的影响, 非生物胁迫能够造成全基因组和特定位点胞嘧啶甲基化水平的升高或降低(Lukens and Zhan, 2007)。植物在应对环境胁迫时甲基化水平的改变是动态的, 如铝(Choi and Sano, 2007)、重金属(Aina et al., 2004)和水分胁迫(Labra et al., 2002)也会造成全基因组和特定位点胞嘧啶甲基化水平的增加或降低(Zhao et al., 2010)。
目前, 有关甘露醇对植物基因组DNA 甲基化的影响尚未见报道。为此, 本文以拟南芥(Arabidopsis thaliana )为材料, 通过用不同浓度甘露醇处理拟南芥种子, 测定处理后植株的形态特征及生长态势, 并采用甲基化敏感扩增多态性(methylation-nsitive am- plification polymorphism, MSAP)方法分析其对拟南芥CCGG 位点胞嘧啶甲基化水平和模式的变化造成的影响, 为从DNA 水平上揭示植物对甘露醇处理的反应机制提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
以拟南芥(Arabidopsis thaliana )Col-0生态型为实验
·研究报告·
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牧草种植
材料。甘露醇为分析纯, 购于天津市化学试剂三厂。
1.2 培养条件与处理方法
取干燥的种子经75%乙醇表面消毒30秒, 再用0.1%升汞表面消毒5–8分钟, 用无菌水冲洗6–8次后, 点种于MS固体培养基(MS盐+3%蔗糖+0.6%琼脂, pH5.8)上。于4°C条件下春化3天, 光照条件为16小时光照/8小时黑暗, 温度18–22°C, 光照强度为150 μmol·m–2·s–1, 相对湿度为80%, 于培养间培养2周后备用。将甘露醇直接加入MS培养基中, 甘露醇浓度分别为50、100、150和200 mmol·L–1, 对照为无甘露醇的普通MS培养基, 灭菌后使用。用甘露醇处理14天, 每个处理100株, 重复3次。生长2周的幼苗从培养皿转移到蛭石：营养土=1:1(v/v)的土壤中, 于培养间培养。用透明塑料罩遮盖, 保持幼苗处于湿度较高的环境。约2周后摘掉罩子, 9周后收获成熟种子。
1.3 生长状况测定
统计点种1–6天时的萌发率。甘露醇处理21天后, 测定幼苗的形态特征和生长态势。每个处理100株, 重复3次。
1.4 DNA提取
幼苗培养14天后进行DNA提取。每一处理分别取30–40株幼苗的嫩叶混合。采用CTAB法(Micheli et al., 1994)提取DNA。去除RNA纯化后的DNA质量和浓度检测采用0.8%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法。DNA样品于−20°C冰箱中保存备用。
1.5 MSAP分析
MSAP分析操作过程参照何艳霞等(2007)所述方法。分子标记检测所用的接头及引物均由上海生工公司合成。
2结果与讨论
2.1 甘露醇对拟南芥幼苗生长发育的影响
统计不同浓度甘露醇处理后拟南芥种子的萌发率。结果表明, 在50和100 mmol·L–1甘露醇处理下种子萌发率与对照无显著差异, 而150和200 mmol·L–1甘露醇处理则抑制种子萌发(图1)。甘露醇处理可影响拟南芥幼苗的形态特征和生长态势(图2)。甘露醇处理造成幼苗水分胁迫, 致使植株较矮, 株型紧凑; 叶面积小, 叶狭长, 叶片薄; 根毛显著伸长, 根系发达, 向四周
图1 不同浓度甘露醇处理的拟南芥种子萌发率
Figure 1 The germination rate of Arabidopsis eds treated by different concentrations of mannitol
图2 不同浓度甘露醇处理21天的拟南芥幼苗
(A) 0 mmol·L–1; (B) 50 mmol·L–1; (C) 100 mmol·L–1; (D) 150 mmol·L–1; (E) 200 mmol·L–1
Figure 2 Arabidopsis edlings grown for 21 days treated by different concentrations of mannitol
(A) 0 mmol·L–1; (B) 50 mmol·L–1; (C) 100 mmol·L–1; (D) 150 mmol·L–1; (E) 200 mmol·L–1
杜亚琼等：甘露醇对拟南芥基因组DNA甲基化的影响 287
扩散的范围较大; 幼苗的抗旱能力增强。随着甘露醇浓度的增加, 植株逐渐变矮。经甘露醇处理的拟南芥在解除胁迫9周后, 株高与对照无显著差异。与对照相比, 浓度大于100 mmol·L–1的甘露醇胁迫均延迟了抽薹和开花时间, 且浓度越高抑制作用越显著。
2.2 甘露醇处理引起的甲基化水平变化
Hpa II和Msp I是一组同裂酶, 二者均识别并切割5'- CCGG-3'序列。Hpa II对胞嘧啶的甲基化极其敏感, 它不能切割任何1个或2个胞嘧啶均甲基化的序列, 但是若只在单链发生甲基化, 它能够识别并切割。Msp I 只对外部胞嘧啶的甲基化敏感。样品DNA经Hpa II/ Eco RI(H)和Msp I/Eco RI(M)酶切后通常产生4种甲基化带型, 但是在聚丙烯酰胺凝胶电泳分析胶上只能检测出3种甲基化带型。I型带是在Eco RI/
Hpa II和Eco RI/ Msp I两种酶切组合中均出现的带, 表明CCGG位点未发生甲基化(图3中D1所示); II型带是在Eco RI/ Hpa II酶切中不出现但在Eco RI/Msp I酶切中出现, 表明CCGG位点发生全甲基化(图3中D2所示); III型带是在Eco RI/Hpa II酶切中出现但在Eco RI/Msp I中不出现的带, 表明CCGG位点发生半甲基化(图3中D3所示)。用Eco RI和Hpa II–Msp I的16对引物组合共扩增出1 608条带。带型分布见表1。
利用不同的引物组合对来自对照和甘露醇处理的拟南芥幼苗基因组DNA进行MSAP分析, 检测拟南芥在响应甘露醇处理过程中的DNA甲基化模式变化。甘露醇处理导致了拟南芥幼苗全基因组DNA胞嘧啶甲基化水平的改变, 而且100和200 mmol·L–1甘露醇处理组半甲基化率高于全甲基化率, 50和150 mmol· L–1甘露醇处理组半甲基化率均低于全甲基化率(表1)。由此推测, 拟南芥经甘露醇处理后存在基于DNA 甲基化水平和模式改变的表观遗传变异。对照所检测到的内侧C完全甲基化水平高于外侧C半甲基化水平, 甘露醇处理材料所检测到的内侧C完全甲基化和外侧C半甲基化水平均有升有降, 表现出不同程度的变异, 但无统一规律。用100和200 mmol·L–1甘露醇分别处
图3 甘露醇处理与对照之间拟南芥幼苗基因组的甲基化敏感性扩增结果
H1、H2、H3、H4和H5为Hpa II/Eco RI酶切, M1、M2、M3、M4和M5为Msp l/Eco RI酶切; H1和M1
泳道为对照组的MSAP带型; H2、H3、H4、H5和M2、M3、M4、M5泳道为处理组的MSAP带型; A1–A4、B1–B4、C和D1–D3所示带型见表2。
烧汁茄子Figure 3 Profiles of methylation-nsitive amplification polymorphism (MSAP) in Arabidopsis edlings between mannitol treatments and control
H1, H2, H3, H4, H5 reprent digestion with Hpa II/Eco RI, and M1, M2, M3, M4, M5 reprent digestion with Msp l/Eco RI; Lanes H1 and M1 are MSAP patterns of the controls, while lanes H2, H3, H4, H5 and M2, M3, M4, M5 are tho of mannitol treatments; Band patterns of A1–A4, B1–B4, C and D1–D3 are referred to Table 2.
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表1 不同浓度甘露醇处理对拟南芥幼苗基因组DNA 甲基化水平的影响
Table 1 Effects of different mannitol concentrations on the levels of genomic DNA methylation in Arabidopsis edlings
Types of amplified bands The CCGG loci of methylated
The CCGG loci of non-methylated Fully methylated loci Half methylated loci
Mannitol
concentration (mmol·L –1
) Type I
Ratio (%)
Type II
Ratio (%)
Type III
Ratio (%)
Total
amplified bands Total methylated bands
Methylated bands ratio (%)
0 (CK) 254 74.71 64 18.82 22 6.47 340 86 25.30 50 278 82.25 36 10.65 24 7.10 338 60 17.75 100 246
78.85
22
7.05
44
14.10
小站练兵园312
66
21.15 150 262 84.52 42 13.55 6
1.94 310 48
15.49 200
166 53.90 34
11.04 108 35.06 308 142
46.10
总扩增带数=类型I+类型II+类型III; 总甲基化带数=类型II+类型III; 完全甲基化比率=类型II/总扩增带数; 半甲基化比率=类型III/总扩增带数; 甲基化带比=总甲基化带数/总扩增带数
Total amplified bands=Type I+Type II+Type III; Total methylated bands=Type II+Type III. Fully methylated loci ratio=Type II/ (Type I+Type II+Type III); Half methylated loci ratio=Type III/(Type I+Type II+Type III); Methylated bands ratio=(Type II+Type III)/ (Type I+Type II+Type III)
理时, 拟南芥基因组CCGG 位点发生甲基化的方式以双链半甲基化(m CCGG)为主; 用50和150 mmol·L –1甘露醇分别处理时, 拟南芥基因组CCGG 位点发生甲基化的方式则以双链全甲基化(C m CGG)为主; 浓度达375 mmol·L –1以上甘露醇处理组幼苗全部死亡。
2.3 甘露醇处理诱导甲基化状态的变化
利用不同的引物组合对4种不同浓度甘露醇处理和对照样品DNA 的Hpa II/Eco RI(H)和Msp I/Eco RI(M)
的酶切产物进行选择性扩增。通过比较分析MSAP 电泳图谱(图3), 可对某一特定CCGG 位点的甲基化模式变异进行分析。怎样清洗油烟机
甘露醇处理与对照的甲基化敏感性扩增共出现12种带型。甲基化带型主要有多态性和单态性2类。多态性即对照与处理在甲基化模式上不同, 表明CC- GG 位点甲基化状态在甘露醇处理后发生改变。该多态性又有3种状态, 即甲基化(A 型)、去甲基化(B 型)和不定类型(C 型)。A 型中的A1和A2为重新甲基化(对照H 和M 泳道都有带, 而处理仅H 或M 泳道有带), A3和A4为超甲基化(对照仅H 或M 有一条带, 而处理H 和M 泳道都无带)。A 型表明甘露醇诱导拟南芥幼苗基因组DNA 发生了甲基化水平增加的变化。B 型含B1、B2、B3和B4, 为去甲基化类型, B 型甲基化状态与A 型相反, 表明甘露醇处理后基因组DNA 甲基化水平下降。
C 型为不定类型, 对照组与处理组中DNA 甲基化程度的差异无法确定。单态性即对照与处理之间有相同的带型(
D 型), 表明甘露醇处理后CCGG 位点的甲基化状态未改变。D1型为未甲基化, D2和D3型为半甲基化(李雪林等, 2009)。处理与对照的甲基化模式带型A 、B 、C 和D 及相应的位点数见表2。
与对照相比, 用50、100、150和200 mmol·L –1
美国绿卡条件
甘露醇处理的拟南芥幼苗基因组DNA 甲基化(A 型)位点数分别占总甲基化多态性扩增位点数的5.78%、15.48%、10.71%和33.73%; 去甲基化(B 型)位点数分别占总甲基化多态性扩增位点数的10.98%、5.36%、8.33%和7.69%; 总甲基化多态性分别为17.92%、21.43%、19.05%和47.33%(表3)。甘露醇处理使拟南芥幼苗基因组DNA 的甲基化状态发生了不同程度的变化; 在扩增的甲基化位点中, 50 mmol·L –1甘露醇诱导去甲基化的位点数稍高于发生甲基化的位点数, 100、150和200 mmol·L –1甘露醇诱导甲基化的位点数均高于发生去甲基化的位点数(图4), 同时基因组DNA 甲基化多态性也随之升高。拟南芥幼苗基因组DNA 甲基化和去甲基化之比随着甘露醇胁迫的增强而发生不同程度的变化。
2.4 讨论
甘露醇作为一种生长延缓剂, 在组织培养过程中可以
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表2 甘露醇处理拟南芥幼苗与对照的甲基化状态
Table 2 Patterns of DNA methylation in the mannitol-treated Arabidopsis edlings
Digestion *
Changes of methylation status Number of sites
H M H M Before treatment After treatment CK-50 CK-100CK-150 CK-200
Band
pattern **0 0 0 1 CCGG GGCC CCGG GGCC 2 0 1 9 B3 0 0 1 1 CCGG GGCC CCGG GGCC 2 1 1 2 B4 0 1 1 1 CCGG GGCC CCGG GGCC 14 8 11 2
B1
1 0 1 1 CCGG GGCC CCGG CCGG GGCC GGCC 1 0 1 0 B
2 1 1 1 0 CCGG GGCC CCGG CCGG GGCC GGCC 4 10 0 36 A2 1 1 0 1 CCGG GGCC CCGG GGCC 0 0 5 1 A1 0 1 0 0 CCGG GGCC CCGG GGCC 0 12 6 14 A
3 1 0 0 0 CCGG CCGG GGCC GGCC CCGG GGCC 6
4 7 6 A4 0 1 1 0 CCGG GGCC CCGG CCGG GGCC GGCC 2 1 0 10 C 1 1 1 1 CCGG GGCC CCGG GGCC 122 114 118 79
D1
1 0 1 0 CCGG CCGG GGCC CCGG CCGG CCGG GGCC GGCC 4 7 3 4 D
2 0 1 0 1
CCGG GGCC
CCGG GGCC
16 11 15 6
D3
* H 和M 分别代表Hpa II/Eco RI 和Msp I/Eco RI 酶切 1: 有带; 0: 无带; ** 带型如图3所示; C 和CC 均表示甲基化的胞嘧啶
* H reprented digestion with Hpa II/Eco RI, M reprented digestion with Msp l/Eco RI 1: Prence of band; 0: Abnce of band; ** Band patterns were shown in figure 3; C and CC reprented methylated cytosine
表3 不同浓度甘露醇处理对拟南芥幼苗基因组DNA 甲基化状态的影响
Table 3 Effects of different concentrations of mannitol on the patterns of genomic DNA methylation in Arabidopsis edlings Polymorphism bands Monomorphism bands Mannitol concentration (mmol·L –1) Methy-lated bands
Type A Ratio (%) Type B Ratio (%) Type C Ratio (%) Polymorphism bands Ratio (%) Type D Ratio
(%) CK-50 173 10 5.78 19 10.98 2 1.16 31 17.92 142 82.08 CK-100 168 26 15.48 9 5.36 1 0.60 26 21.43 132 78.57 CK-150 168 18 10.71 14 8.33 0 0 32 19.05 136 80.95 CK-200 169 57 33.73 13 7.69 10 5.92 80
47.33 89
52.67
甲基化带数=类型A+类型B+类型C+类型D; 多态性带数=类型A+类型B+类型C; 总甲基化多态性比率=类型A+类型B+类型C/甲基化带数; 单态性比率=类型D/甲基化带数
Methylated bands=Type A+Type B+Type C+Type D; Polymorphism bands=Type A+Type B+Type C;
Methylated polymorphism loci ratio=Type A+Type B+Type C/methylated bands; Monomorphism loci ratio=Type D/methylated bands
