植物学报 Chine Bulletin of Botany 2014, 49 (2): 1–1,
doi: 10.3724/SP .J.1259.2014.00000 ——————————————————
收稿日期: 2013-02-26; 接受日期: 2013-07-12 * 通讯作者。E-mail: laxu@njfu.edu
LysM 结构域及其与植物–真菌相互作用的关系
江聪1, 2, 黄敏仁1, 徐立安1*
班长的职务描述1
南京林业大学森林资源与环境学院, 南京 210037; 2
西北农林科技大学西农-普度联合研究中心, 杨凌 712100
摘要 在长期的进化过程中, 植物与真菌之间形成了复杂而又紧密的联系, 其中最主要的就是侵染与防御的关系。植物的抗病性由于涉及农作物、林木的生长与产量, 逐渐成为研究热点。在植物免疫系统中, 对病原真菌的识别是一个重要环节。目前认为在这一过程中, LysM 结构域起到了极为关键的作用。植物细胞膜上有含LysM 结构域的识别受体, 该受体可以结合真菌细胞壁上的几丁质, 并将信号传递到胞内, 从而
启动免疫反应。在真菌中, 同样具有含LysM 结构域的基因, 主要是一类效应因子。它们可能参与真菌在侵染过程中的“伪装”, 以逃避植物的识别。该文以LysM 结构域在植物–真菌相互作用中扮演的角色为着眼点, 讨论有关研究的意义与趋势, 并对如何利用LysM 结构域的相关研究进行有效的抗病育种提出了新的设想。
关键词 LysM, 结构域, 真菌, 相互作用
江聪, 黄敏仁, 徐立安 (2014). LysM 结构域及其与植物–真菌相互作用的关系. 植物学报 49, 1–1.
真菌病害占植物病害的80%以上, 它们影响着植物生长发育的各个阶段, 是限制农作物及林木产量和质量的重要因素。如何防治真菌病害, 已成为当前农林业生产中迫切需要解决的难题。深入研究植物与真菌相互作用的分子机制, 并以此为基础进行抗病品种的培育, 是植物抗病育种的新思路、新途径。
植物和真菌的相互作用是一个非常复杂的过程, 有大量的基因参与其中。然而迄今为止, 仅有少量基因功能得以确定。植物和真菌的相互作用可能发生在植物免疫的各环节中。植物自身有一套完整的免疫系统, 可以抵御病原真菌的侵染(王忠华等, 2004)。其中第1层防御系统又被称为病原相关分子触发式免疫, 病原相关分子来源于病原真菌, 植物通过膜上识别受体识别物质, 从而激活自身的免疫系统(Jones and Dang, 2006)。由于多数病原相关分子对病原真菌的正常生命活动至关重要, 所以病原真菌无法通过“丢弃”这些物质来逃避植物的识别(Jones and Dang, 2006)。因此, 病原真菌逐渐进化出能够
帮助其破坏或者抑制植物防御系统的物质, 这就是效应因子。效应因子可以干扰植物膜上识别受体对病原相关分子的识别, 阻断植物胞内信号转导以及抑制抗病基因的表达(Stergiopoulos and de Wit, 2009)。效应因子在
帮助病原真菌完成侵染的同时, 也触发了植物的第2层防御系统, 即效应因子触发式免疫(Jones and Dang, 2006)。
在病原真菌与植物相互作用的过程中, 有3类物质起着相对关键的作用, 它们分别是来源于病原真菌的病原相关分子、效应因子以及植物细胞膜上的识别受体(Chisholm et al., 2006)。其中, 几丁质是唯一能够确定的病原相关分子。而关于植物膜上识别受体的研究同样不够深入, 仅在拟南芥(Arabidopsis thaliana )、水稻(Oryza sativa )等少数几个模式生物中鉴定出几丁质的识别受体(Kaku et al., 2006; Wan et al., 2008)。针对真菌效应因子开展的研究仅处于起步阶段。
呢喃细语目前已发现的植物膜上识别受体及效应因子中都含有一类典型的结构域, 称为LysM 结构域(Kaku et al., 2006; Bolton et al., 2008; Wan et al., 2008)。这类结构域在植物和真菌中普遍存在, 并扮演着不同的角色。对LysM 结构域及含LysM 结构域基因的功能分析是研究植物–病原真菌互作的核心内容和突破点。
1 LysM 结构域及含LysM 结构域蛋白
LysM 结构域最早是在芽孢杆菌噬菌体溶菌酶中被发
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现的, 该酶通过降解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的糖苷键来降解细胞壁(Garvey et al., 1986)。LysM结构域位于该蛋白质的C端, 由44个氨基酸组成(Garvey et al., 1986)。此后, 又陆续在其它原核生物的蛋白质中发现了LysM结构域。进一步研究发现, LysM结构域不仅存在于原核生物的蛋白质中, 而且出现在真核生物甚至病毒的蛋白质中(Buist et al., 2008)。
随着研究的深入, 发现含LysM结构域的蛋白质多是分泌蛋白或膜蛋白, 且该结构域不仅只存在于蛋白质的C端, 还出现在蛋白质的任意位置。不过, 该结构域在不同位置出现的几率有所不同。据统计, LysM 结构域偏好出现在蛋白质的N端和C端, 在中心位置出现较少(Buist et al., 2008)。同一蛋白质中可能会同时存在几个LysM结构域, 这些结构域之间的连接序列富含丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸以及脯氨酸(Ohnuma et al., 2008)。这些氨基酸有助于在稳定的LysM结构之间形成一个相对灵活的区域(Ohnuma et al., 2008)。多数情况下, 结构域之间的连接序列在长度、氨基酸组成上都有着很丰富的变异。比较特殊的是在植物中一类受体激酶中发现的在随机氨基酸两端含保守半胱氨酸的结构(Cys-X-Cys结构), 该结构位于LysM结构域之间的区域, 可能与蛋白质胞外部分的稳定性有关(Madn et al., 2003; de Jo
nge and Thomma, 2009)。
LysM结构域家族是一个结构域构架极其丰富的家族(Zhang et al., 2009)。其原因主要有3方面: (1) LysM结构域本身的多样性; (2) LysM蛋白含LysM结构域的数目具多样性(1–12个不等); (3) LysM结构域可以与多种其它蛋白结构域组合出现在蛋白质中。据统计, LysM结构域可以与50多种结构域组合形成241种不同的蛋白结构域构架。在所有的结构域构架中, 最为常见的有2种, 一种仅含1个LysM结构域, 在所有LysM结构域参与形成的结构域构架中, 这是最简单的一种, 它普遍存在于所有物种中(Zhang et al., 2009)。第2种含2个LysM结构域和1个肽酶结构域, 它存在于原核生物、绿藻以及非维管植物中(Zhang et al., 2009)。以上2种结构域构架存在范围比较广, 反映了起源初期LysM结构域可能的存在形式。相比之下, 原核生物具有更为丰富的结构域构架(Buist et al., 2008)。
在进化过程中, 不同物种中出现了具有不同功能的特有结构域构架。例如细菌中的酰胺酶(amida)、糖基转移酶(SLT)与LysM结构的组合; 真菌中几丁质结合结构、糖苷水解酶(glycol_hydro_18)与LysM结构的组合; 植物中LysM结构域与激酶结构域的组合(Zhang et al., 2009)。
一个典型的LysM结构域由44个氨基酸组成, 其中位于N端的16个氨基酸和位于C端的10个氨基酸相对保守, 两者中间的区域则保守性较差, 除了第23和30个氨基酸位置的亮氨酸/异亮氨酸和第27个氨基酸位置的天冬酰胺比较保守以外, 其余位置上的氨基酸均有相对较大的变化(图1A)(Buist et al., 2008)。
原核生物的LysM结构域含有大量的二级结构(α-螺旋、β-折叠、β-转角等)和氢键以形成稳定的三级结构; 而真核生物中的LysM结构域则主要依靠二硫键来保持其结构(Ponting et al., 1999)。截至目前, 已经分别利用核磁共振以及多波长异常散射法成功地解析了大肠杆菌膜结合的溶胞壁质转移酶MltD以及枯草芽孢杆菌的YkuD蛋白中的LysM结构(Bateman and Bycroft, 2000; Bielnicki et al., 2006)。这2个蛋白质中的LysM 结构很相似, 它们均含有1个βααβ的二级结构, 2个α螺旋出现在2个反向平行的β折叠的同一边。
LysM结构域广泛存在于细菌、真菌、植物、动物的蛋白质中, 但迄今为止还没有在古细菌中发现该结构(Punta et al., 2012)。有关LysM结构的起源与进化问题, 如LysM结构是在何时产生的？起源于何类生物？是如何在不同物种间转移的？目前存在2种观点。一种认为LysM结构起源较早, 它存在于所有物种的共同祖先中, 在进化的过程中, 很多分支都保留了这一结构, 但是在古细菌这一分支中, 这个结构丢失了; 另一种观点认为LysM结构起源较迟, 是在细菌、古细菌以及真核生物分离之后产生, 它产生于细菌或真核生物中, 并且在产生之后转移到另一分支中(Ponting et al., 1999)。这种结构域在不同物种间的转移确实存在, 而且在真核生物与细菌间的转移要远比真核生物与古细菌间的转移普遍(Ponting et al., 1999)。LysM结构域在细菌与真核生物中承担着不同的功能。在细菌中, 它主要负责肽聚糖的结合; 而真核生物的LysM结构则被公认为几丁质的结合结构(Tanaka et al., 2013)。
将LysM结构域与细菌中广泛存在的另外2个糖
捡鸡蛋
江聪等:LysM结构域及其与植物–真菌相互作用的关系
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图1 LysM结构域的序列特征及植物中含LysM结构域的蛋白
(A) LysM结构域的序列特征(来源于Pfam网站); (B) 植物中含LysM结构域蛋白的分类; (C) 植物中含LysM结构域蛋白的功能
Figure 1 Connsus quence of LysM domain and the catalogue of LysM-contained proteins in plant and their functional characterization
(A) Connsus quence of LysM domain (from Pfam web site); (B) The classification of plant LysM-contained proteins; (C) The function of plant LysM-contained proteins
结合结构域(胆碱结合结构域以及脂壁酸结合域)相比较, 发现这3种结构域均含有1个保守的基序, 称之为YG基序(Turner et al., 2004)。这意味着3种结构域很可能有着相同的起源。
2植物中含LysM结构域蛋白
植物中含LysM结构域的蛋白质主要是一些膜上识别受体(Gust et al., 2012; Tanaka et al., 2013), 它们通过直接或间接的方式识别几丁质等葡聚糖从而发挥功能(图1B, C)。这一类蛋白根据亚细胞定位的预
测和结构域的差异, 可以分为LysM受体类激酶(LysM- containing receptor-like kinas, LYKs)、LysM受体类蛋白(LysM-containing receptor-like protein, LYPs)、细胞外LysM蛋白(extracellular LysM, LysMe)及非分泌型胞内LysM蛋白(intracellular non-cre- tory LysM genes, LysMn)(Zhang et al., 2009)。LysM 受体类激酶根据受体类激酶激酶区域特点的差异, 可将其分为LYKs以及类LYKs, 也称LYRs。其中LYRs 由于具有1个异常的激酶区, 导致其缺少部分或全部激酶活性(Zhang et al., 2009)。
大多数的LYPs均含有2个LysM结构域, 而LysMe和LysMn则只含1个LysM结构域, LYKs和LYRs所含LysM结构域数目也不超过3个(Zhang et al., 2009)。与植物相比, 真菌的LysM类蛋白中含LysM结构域最多, 可达9个。可见, 不同物种的单个蛋白含LysM结构域的数量有所不同, 这是长期进化导致的差异, 且与蛋白的功能相关(de Jonge and
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Thomma, 2009)。
几丁质普遍存在于真菌细胞壁中, 对维持真菌细胞的形态结构至关重要, 然而这类物质却不存在于植物细胞中, 因此真菌病原入侵植物时, 植物就可以通过识别几丁质来启动自身的防御反应(Kaku et al., 2006)。在植物的识别体系中, 包括在水稻中发现的几丁质触发子结合蛋白(chitin elicitor binding protein, CEBiP)属于质膜糖蛋白。敲除编码该蛋白的基因后, 几丁质诱导的活性氧爆发得到抑制, 这说
孙校长明该基因在感知几丁质触发子存在以及将信号传递到胞内等环节中发挥作用(Kaku et al., 2006)。进一步的研究发现, 水稻中的几丁质触发子受体激酶(chitin elicitor re-ceptor kina, CERK)OsCERK1同样是几丁质诱导的信号途径的重要一环。与CEBiP不同的是, OsCERK1除了含有LysM结构, 还含有胞内的激酶区域。酵母双杂交实验结果显示, 该蛋白具有与水稻CEBiP形成异源或同源聚合体的潜在可能(Shimizu et al., 2010)。通过以几丁质处理水稻细胞膜的免疫共沉淀实验, 表明这两者可以形成几丁质诱导的受体复合物结构(Shimizu et al., 2010)。拟南芥AtCERK1是另一个研究得比较透彻的受体激酶(Miya et al., 2007; Wan et al., 2008)。它是由3个胞外LysM结构和1个胞内激酶结构组成, 在几丁质触发的信号途径中起着关键作用。对其进行敲除后, 植物几乎丧失了几丁质触发的所有反应, 包括活性氧爆发、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应启动、防御基因的表达等, 从而使得植物对病原真菌的免疫力大大下降。这充分说明作为植物LYKs 的一种, 拟南芥的AtCERK1在植物免疫系统中充当了重要角色。最近的研究通过对拟南芥AtCERK1的胞外区与五聚几丁质复合物的结构进行解析, 认为AtCERK1对几丁质的结合是通过1个LysM结构与3个几丁质残基来介导的(Liu et al., 2012)。AtCERK1是通过胞外的LysM结构域识别几丁质上的N-乙酰基团, 而当识别几丁质后, AtCERK1通过胞外LysM结构域的二聚化来完成感应并激活下游信号通路(Liu et al., 2012)。正是由于植物细胞膜上的几丁质受体的重要作用, 使得它成为很多病原菌效应因子的攻击目标, 细菌的AvrPtoB就可以使CERK1的激酶区域泛素化, 从而降解该类蛋白, 提高侵染的成功率(Gimenez- Ibanez et al., 2009; Zeng et al., 2012)。
除了对病原真菌病原相关分子的识别, 植物中LysM激酶受体还涉及对共生菌信号分子的识别。在土壤微生物与植物间存在着2种常见的共生关系, 一种是根瘤菌与豆科植物形成的固氮根瘤共生(root nodule symbiosis, RNS); 另一种是丛枝菌根真菌与多种植物的丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza, AM)共生(李海燕等, 2001)。这2种共生关系是植物获取氮和磷供应的重要途径。RNS共生在进化上出现较晚, 可能是从AM共生演变而来, 二者的部分信号转导途径是重合的(Gust et al., 2012)。这2种共生关系均有LysM激酶受体的参与。
结瘤因子(nodulation factors, NFs)是一类脂壳寡糖, 负责对其识别的是豆科植物的一类含胞外LysM结构域的丝氨酸/苏氨酸激酶(Bensmihen et al., 2011)。在豆科植物日本百脉根(Lotus japonicus)中发现的NFR1和NFR5是这类蛋白质的代表(Madn et al., 2003; Radutoiu et al., 2003)。作为典型的植物受体激酶, 它们均含有1个胞外LysM结构域、1个跨膜区域和1个丝氨酸-苏氨酸激酶结构, 主要负责植物对根瘤菌侵染的早期应答。这2个基因的突变体对相应的结瘤因子不敏感, 且在接种百脉根根瘤菌之后无法与其形成共生关系(Radutoiu et al., 2003)。NFR1与NFR5可以形成异源二聚体从而参与结瘤因子识别及信号转导过程(Madn et al., 2011)。除了LjNFR1和LjNFR5, 在其它物种中有相似功能的LysM受体激酶也陆续被报道。截形苜蓿(Medicago truncatula)中发现的NFP和LYK3、豌豆(Pisum sativum)中的Sym10和Sym37, 都被证明其在结瘤过程中发挥了必不可少的作用(Arrighi et al., 2006; Smit et al., 2007; Zhukov et al., 2008)。
AM真菌可以释放一类被称为Myc因子的信号分子, 它同样属于脂壳寡糖。榆科山黄麻(Parasponia andersonii)NFP基因就是一个MF受体(Op den Camp et al., 2011)。它在结构上与LjNFR5和MtNFP 相似, 除了在AM共生过程中发挥作用, 还是唯一参与根瘤共生的非豆科植物的LysM激酶受体。对该基因进行RNA干扰实验证实其对AM和RNS共生均是必不可少的(Op den Camp et al., 2011)。
3 真菌中含LysM结构域蛋白
20世纪80年代, 人们就在酵母Kluyveromyces lactis
阿喀琉斯之踵江聪等:LysM结构域及其与植物–真菌相互作用的关系 5
白蔷薇花语中发现了含LysM结构域的蛋白质, 它是一种几丁质酶, 可以抑制酵母细胞的生长(Stark and Boyd, 1986)。此后又陆续在一些真菌的几丁质酶中发现了此类结构域, 在已完成基因组测序的近百种真菌中, 仅在9种真菌中未发现含LysM结构域蛋白质(de Jonge and Thomma, 2009)。虽然含LysM结构域的蛋白质在真菌中广泛存在, 针对其开展的研究却一直不够深入。番茄叶霉病菌(Cladosporium fulvum)的分泌蛋白ECP6的发现(Bolton et al., 2008)使LysM结构域与效应因子联系起来, 同时推动真菌LysM蛋白质研究进入了一个新的阶段。在对番茄叶霉病菌侵染番茄叶片的分泌蛋白进行分析后发现一些新的蛋白质, 其中包括ECP6。进而对编码该蛋白质的基因进行克隆后发现其含有3个LysM结构域。表达与初步功能分析的结果显示, 该基因在病原菌侵染宿主时特异表达, 并且对病原菌致病至关重要(Bolton et
al., 2008)。进一步的功能研究发现, ECP6是通过与几丁质的互作发挥作用。在病原菌致病过程中, 几丁质一旦被宿主识别, 宿主就会产生相应的免疫反应, 从而抑制病原菌生长和进一步的侵染。而ECP6被分泌出体外后, 就可以与细胞壁上的几丁质结合, 有效“伪装”病原菌, 提高其侵染的成功率(de Jonge et al., 2010)。在阐明ECP6的功能以后, 其它物种中的同源基因也陆续得到了研究。在小麦壳针孢(Mycosph- aerella graminicola) 中发现了3个含LysM结构域的效应因子(Marshall et al., 2011), 其中Mg1LysM和Mg3LysM在侵染中大量表达。实验证明它们编码的蛋白质均具有结合几丁质的能力, 而且它们还可以保护真菌菌丝不受宿主酶的降解, 而ECP6不具备这一功能。对这2个基因进行敲除后发现, 缺少Mg3LysM 基因的病原菌侵染能力大大削弱, 无法形成无性孢子。而敲除了Mg1LysM基因则没有造成病原菌致病力的下降(Marshall et al., 2011)。这说明在不同的LysM效应因子中已经发生了初步的功能分化。
真菌中含LysM结构的蛋白质可以大致分为5类(de Jonge and Thomma, 2009)。第1类以ECP6为代表, 不含除LysM以外的任何结构域, 参与侵染宿主的过程, 被认为是可能的LysM效应因子。这一类蛋白质含有1–7个数量不等的LysM结构域, 其中大多数仅含1个LysM结构域。该类LysM蛋白质成员众多, 在很多真菌中都是数量最庞大的一类; 甚至有些物种仅含有这一类LysM蛋白质。第2类主要是几丁质酶, 它们除了含LysM结构域外, 还含有1个富含半胱氨酸的几丁质识别区域(Pfam ID: PF00187)和1个具有水解活性的酶区域(Pfam ID: PF 00704)。这类蛋白质的主要功能是降解真菌自身细胞壁, 从而便于孢子
除湿第一的中草药的萌发及菌丝的伸长。上述2类蛋白质目前研究得最为透彻。第3类是较为特殊的一类, LysM结构是包含在另一个结构域CVNH(Pfam ID: PF08881)中的。这一结构域与糖结合的抗病毒蛋白CV-N同源, 被认为是1个抗HIV病毒的结构域。第4类蛋白质是由几丁质结合结构域和LysM结构域组成。第5类属于N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。它含有1个可以降解细菌细胞壁的酶区域(Pfam ID: PF01510)。
以上5类蛋白质中, 第1、4、5类的所有成员及第2类的部分成员均含有信号肽, 是分泌蛋白; 而第3类, 也就是CVNH-LysM蛋白质, 在CVNH结构域的上游有核定位信号(nuclear localization signal, NLS), 说明这一类蛋白质在细胞核中表达。
4 LysM结构域进一步研究的意义及重要方向
老年痴呆症LysM结构域在植物与真菌中均存在。在植物中, 由LysM结构域构成的基因是植物防御体系的重要一环; 而在真菌中, 含LysM结构域的基因又成为病原真菌完成侵染的重要武器。那么它们之间是否存在联系且这种联系对植物和病原真菌的对抗又会产生什么样的影响呢？首先可以确认的是它们的联系是围绕着几丁质建立的。最近在稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)中发现了一类效应因子, 它含有2个LysM结构域, 研究者将其命名为slp1效应因子, 它可以与几丁质结合从而抑制植物的免疫反应。更为重要的是, 该效应因子可以与植物的CEBiP竞争结合几丁寡糖(Mentlak et al., 2012)。这种竞争与植物能否完成对病原真菌的识别并启动自身的防御反应相关。而除此之外, 还可能存在另一种竞争。在植物中, 有2类几
丁质膜上识别受体, 即CERK与CEBIP, 这2类受体可以形成同源及异源二聚体, 病原真菌中含LysM结构域的效应因子能否具有破坏这种二聚体形成的能力同样值得关注。至今尚未出现关于此种竞争关系的报道。无论植物及真菌中的含LysM结构域基因以何种
