大肠杆菌（E.coli）超级感受态细胞制备
H. Inoue, H.Nojima, and H. Okayama (1990)
High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96:23-28
溶液：
adoptSOB培养基 1L 500ml 1000
2％ Bacto tryptone 20g 10g
0.5% yeast exctract 5g 2.5g
10 mM NaCl 0.6g/L 0.3g
2.5mm KCl 0.18g/L 250mM 5ml 10ml
10mM MgCl2 2.03g/l. .6H2O 2M 2.5ml 5ml
10mM MgSO4 2.46g/l. .7H2O 1M 10ml 20ml
培养细菌用。
TB buffer (transformation buffer):
炸油条技术
10mM Hepes (or Pipes) 2.5g/l Hepes
15mM CaCl2 2.27g/l (.2H2O)
250mM KCl 18.6g/l
55mM MnCl2 10g/l
除MnCl2外，所有组分以固体加水中溶解和搅拌混匀，并以KOH调pH6.7，再将MnCl2 溶解上述溶液中，用0.45μm滤膜抽滤除菌，存放于4℃备用。
4℃预冷所需的器皿：离心机转子、移液管、枪尖 和eppendorf管。
步骤：
1， 取5ml SOB 加到100ml 的小烧瓶中，从新培养的平板上接种一个单克隆。过夜培养。
2， 在一个2L的烧瓶中加200ml SOB，接种预培养的菌液1ml。在18℃，置于摇床剧烈振荡（200-250rpm）培养至OD660=0.6，大约需要1.5-2天。
（注：下面所有处理应该在低温下操作）
3， 将培养物和低温离心管放置冰中，10min，将培养物转到预冷的离心管中。
4，离心收集：4℃、3000rpm、10min。去上清，倒置于面纸上。加原体积1/3 （17ml）的冷的TB buffer，冰上冷浴10min。
5，离心收集：4℃、3000rpm，10min。去上清，倒置于面纸上。小心地将细胞重新悬浮于原体积 1/12 （4ml）的冷TB buffer。再加DMSO 280μl，轻旋振，置冰上10min。
6，分装细胞悬浮液，每200μl 为单位加到预冷的 eppendorf管中，立刻放于液氮中冷冻。
7，取出，存放于-80℃。至少可存放1个月而无明显的效率下降。
备注：
1，感受态细胞脆弱易碎，其细胞壁具缝，因此在准备中需要轻柔操作，不可剧烈振荡或以移液管吸取吹打来悬浮细胞。离心时也不可转速过大，5000g可以引起细胞裂解。
2，制备过程中，总是保持细胞低温冷却，不能使温度上升。
3，液氮冷冻可以使感受态细胞转化效率明显高一些。
5，此法不适于BL21菌株，因此用BL21菌株制备感受态细胞时的培养温度应该是30或37度。有证据显示，以Inoue 方法制作的感受态效率可以用下面的处理得以提高：在冷冻之前， 用DT T加以处理（加3.5％ v/v 2.2M DTT，10mM KAc pH 6 溶液，然后置于冰冷浴10min）。
6，热休克时间因菌株而异。DH5α 或 JM109 取30-45c，而 BL21 取120c。
7，在转化前，要降低连接酶的活性。连接酶可以降低转化效率。
端午节粽子8，稀释连接体系的浓度（-5x）也可以提高转化效率，因为降低了可能影响转化的试剂的
浓度。同样，建议苯酚/氯仿处理，也可以提高转化效率，但是会使得步骤繁琐。
9，所加DNA不得多于感受态细胞量的5％，其终浓度不得超过5ng/ul。
10，上述方法可产生的转化效率达到1μg pUC质粒转化到108荷花淀赏析个单克隆，甚至109。
11，转化效率与质粒大小有个粗略的反比例关系。具有deoR苏州好玩的地方突变基因的细胞（DH5α）可以提高对于大质粒的转化效率，非严谨质粒转化效率约为超螺旋的3/4左右。
12，可以同时用两个不同的质粒来做转化，或先后转化。但他们必须是兼容的，不能具有相同的复制子。
13，对于常规的转化，转化效率并不重要，某些步骤可以简化或省略。如热休克就不是必需的，37度恢复孵育时间就可以缩短或省略（注：这依赖于用来筛选所用的抗生素，如氨苄青霉素，孵育时间就无所谓了，如果乐意就可以在热休克后直接涂平板；但对于别的抗生素而言，孵育时间是基本步骤）。
14，细胞涂布平板于干的1.5％琼脂糖平板，使用前先将之倒置放于37度2-4hr晾干，使得
可以吸收1ml左右液体培养基。对于蓝-白斑筛选，不必制作X-gal 平板，就直接加X-gal +IPTG到细胞中混匀了再涂布平板。国家法定节日
15，去污剂会损害感受态细胞的转化率，所以用来制作感受态细胞的玻璃器皿等不能用去污剂洗涤。聚碳酸酯烧瓶也可以用来代替玻璃瓶，DMSO会溶解聚苯乙烯，所以使用聚丙烯管子。
16， 如果克隆困难，只有不稳定的测序结果（如回文序列、重复片段。LTR序列），它将有助于生长出转化子，在较低温度下（25-30度或室温）在非常丰富的培养基中（如Terrific Broth）。
额头
18，如果没有可用的低温摇床，可以在室温下培养细胞。
ULTRA-COMPETENT E. COLI CELLS (3.109 cfu/μg pUC18 DNA)
公出是什么意思
Reference: H. Inoue, H. Nojima and H. Okayama (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96: 23-28.
Solutions:
SOB medium:
2% Bacto tryptone
0.5% yeast ectract
10 mM NaCl 0.6 g/l
2.5 mm KCl 0.18 g/l
10 mM MgCl2 2.03 g/l .6 H2O
10 mM MgSO4 2.46 g/l .7 H2O
TB Buffer (transformation buffer):
10 mM Hepes (or Pipes) 2.5 g/l Hepes
55 mM MnCl2 10 g/l
15 mM CaCl2 2.27 g/l (.2 H2O)
250 mM KCl 18.6 g/l
All components except MnCl2 are mixed and pH is adjusted to 6.7 with KOH.
Then MnCl2 is dissoved and the solution sterilized by filtration through 0.45 μm filter unit and stored at 4undefinedC. All salts were added as solids.
Procedure:
1. Inoculate a colony of a fresh plate in 5 ml SOB in 100 ml flask and let grown during the day or overnight.
2. Inoculate 200 ml of SOB in 2 l flask with 1 ml of the preculture.
Grow the cells with vigorous shaking (200-250 rpm) at 18undefinedC until OD660 of 0.6. This takes approximately 1.5-2 days.
3. Precool the rotor (SLA-600TC) at 4undefinedC). Place all the glass- and plastic ware needed such as 10 ml and 25 ml pipets, tips and eppendorf tubes in the cold room.
Place culture and 50 ml flalcon tubes for at least 10 min on ice.
Transfer culture to 4 precoolded 50 ml tubes ans spin at 3000 rpm for 10 min at 4undefinedC.
All handlings should be performed in the cold room.
4. Remove supernatant (place upside down on tissue) and resuspend the pellet in 1/3 of the original cvolume (17 ml) cooled TB, incubate for 10 min on ice (slowly).
