菌落总数测试片定量检测的方法验证
苏妙仪，严家俊，张 娟
（广东产品质量监督检验研究院，广东佛山 528300）
摘 要：本试验应用菌落总数测试片方法，探究其在奶及奶制品、饮料、冷冻食品、肉制品、方便食品和宠物食品这6类食品中快速测定大肠埃希氏菌总数的可行性，并与国家标准检测方法《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》（GB 4789.28—2013）比较，进行定量检测结果符合率、相关性和差异性的分析，验证菌落总数测试片测定结果的准确性。
结果显示，菌落总数测试片法与国标检测方法测定结果的符合率达100%；不同类型样品菌落测试片法与国标检测方法的测定结果均为强相关，R²值均达0.999以上；F值均小于F crit，且P 值大于0.05。两种方法检测结果无显著性差异。菌落测试片法具有快速、简便、能抑制菌落蔓延且易于观察等优点，相比国标检测方法菌落计数时长缩短1/2。在实际应用中，既可确保检测的准确性，又可提高检测效率。
关键词：菌落总数测试片法；国家标准检测方法；符合率；相关性；差异性Verification of Quantitative Detection Method of Colony Test
Piece Technique
SU Miaoyi, YAN Jiajun, ZHANG Juan
(Guangdong Product Quality Supervision and Inspection Institute, Foshan 528300, China) Abstract: Utilize the colony test piece technique to asss the viability of its rapid detection of total Escherichia coli in six different food categories, including milk and dairy products, beverages, frozen foods, meat products, convenience foods, and pet foods. Additionally, the accuracy of the colony test piece technique was confirmed by using the results of GB 4789.28—2013 test for the compliance rate, correlation, and significance analysis. The outcomes demonstrated that the coincidence rate between the colony test piece technique and the national standard test method was 100%. In tests using various types of samples, both results were highly correlated, with R2 values above 0.999. Additionally, neither F value is larger than F crit, and P value is less than 0.05, showing that there is no significant different between the results of the two methods. The colony test piece technique has the benefits of being rapid, ur-friendly, capable of stopping the spread of colonies, and easy to monitor. Compared to the national standard method, the time spent was cut in half. In actuality, it may ensure detection accuracy while also improving detection effectiveness.
Keywords: colony test piece technique; national standard method; compliance rate; correlation; significance
微生物检验是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定食品食用安全性的科学依据之一。我国国家卫生和计划生育委员会颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌3项。菌落总数是指食品样品经过处理，在一定条件下培养后所得1.0 g或1.0 mL检测样品中所含细菌菌落的总数[1]。菌落总数是判定食品是否安全的重要指标之一[2]。微生物快速测试片法是直接将食品样液接种后于一定温
基金项目：广东食品药品学院科研项目（2021SG03）；2022年度广东质检院内部科技项目（2022GQI02）。
作者简介：苏妙仪（1985—），女，广东佛山人，本科，工程师。研究方向：食品、化妆品及相关产品检测技术研究与开发。
度下培养，最终观察并计数的一种测定样品中微生物指标的方法[3]。与现有标准《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》（GB 4789.2—2016）相比，菌落总数定量测试片法无需配制培养基[4-5]，可有效降低实验误差[6]，操作简便快捷，检测时间短，适合户外操作，或将纳入国家标准检测方法。
目前，快速定量测试片主要分为滤纸、无纺布和冷水溶性凝胶3种类型[7]。其中滤纸和无纺布虽然成本低廉，但保水性差，孔隙大，且菌落显色不清晰，给菌落计数增加难度[8-9]。而冷水可溶性凝胶透明、结构稳定、回收率高，易挑菌，更适用于微生物快速检测[10-11]。吴许文等[12]研究发现，冷水
淀粉怎么用可凝凝胶测试片适合用于食品菌落总数检测，与国家标准测定方法结果无显著性差异。
本研究选择大肠埃希氏菌为测定菌，所使用的菌落总数定量测试片是一种预先制备好的一次性培养基产品，含标准营养琼脂、吸水凝胶和脱氢酶指示剂氯化三苯基四氮唑（TTC）。TTC是一种氧化还原指示剂，水溶液无颜色。细菌在代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶可将无色的TTC还原为红色的三苯甲臢，使菌落变成红色，通过红色菌点进行结果判定[13-14]。在6类不同食品中进行加标，对比菌落总数定量测试片法和国家标准检测方法的测定结果，评价其测定的准确性和应用可行性，为研发适用于食品的新型快速微生物定量检测方法提供实践参考。
1 材料和方法
1.1 设备
HV A-85高压灭菌锅：日本HIRAYAMA公司；1300 SERIES A2生物安全柜；DiluFlow全自动电子稀释仪；Bagmixer 400SW拍打式均质器；GHP-9160隔水式恒温培养箱：上海一恒科技有限公司。
1.2 材料与试剂
奶及奶制品、饮料、冷冻食品、肉制品、方便食品和宠物食品：客户送样；平板计数琼脂：北京陆桥检测技术有限公司；菌落总数定量测试片：某品牌有限公司。
1.3 标准菌株
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）：广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心。
1.4 方法
1.4.1 样品制备
选取6种食品类别，每个类别选取5种样品。分别取25 g（mL）样品于装有225 mL灭菌生理盐水的均质袋中，用均质机混匀，配制成1∶10的样品液，每个样品制备3份同样的样品液。取1 mL 0.5麦氏浓度的大肠埃希氏菌标准菌液加入上述1份样品匀液中混匀，静置30 min后，得到高浓度污染样品。再分别稀释100倍和1 000倍加入样品中，制备中浓度和低浓度污染样品。
1.4.2 样品接种
依据GB 4789.2—2016的方法，选择2～3个适宜稀释度的样品液进行实验。分别吸取1 mL样品液接种于菌落总数测试片及国标检测方法平皿中，每梯度进行5个重复。
1.4.3 培养与结果观察
菌落总数测试片置于（36±1）℃的恒温培养箱中培养24 h后观察结果，选取菌落数30～300 CFU的定量测试片进行结果判定。平皿按国家标准检测方法，于（36±1）℃恒温培养48 h后观察结果。
1.4.4 统计方法
对菌落总数测试片和国标检测方法测得的菌落总数结果的符合率、相关性和差异性进行汇总分析。试验数据均用EXCEL软件和SPSS19.0软件进行处理。
2 结果与分析
2.1 菌落测试片与国家标准检测方法检测结果比较
将30份样品分别经过高、中、低浓度污染后进行接种，计算生长率P R，并分析符合率[15]。菌落总数定量测试片方法与国家标准检测方法结果的生长率均≥0.7（图1），符合率达100%，可认为两种方法检测结果是一致的，菌落总数定量测试片方法能满足食品样品的检测需求。
此外，菌落总数定量测试片在不同种类食品中检测效果也有所不同。由图1可知，奶制品与宠物食品在高、中、低不同浓度大肠埃希氏菌污染下检测的菌落总数生长率接近，且在中和低污染浓度下检测结果更趋向于1.0；肉制品在低的污染浓度下生长率趋向于1.0，中、高浓度时两种检测结果基本一致；饮料、冷冻食品和方便食品在3个污染浓度下检测的生长率在1.0～1.2。总体而言，在6类食品的
测试中，菌落总数定量测试片方法与国标检测方法测定效果有较好的一致性。此外，不同基质样品在菌落总数定量测试片均长出鲜红色菌点，清晰可见，有利于菌落区分，计数时长可缩短1/2，有效提高工作效率。
图1 菌落总数测试片法与国家标准检测方法
生长率比较(n=5)2.2 菌落总数定量测试片法与国标检测方法的相关性分析
根据样品接种试验结果，以菌落测试片结果对数值log(CFU·g-1)为横轴（x），以国标检测方法结果对数值log(CFU·g-1)为纵轴（y），分别绘制不同类别食品样品的拟合曲线。6类样品的回归方程和决定系数分别如图2所示，R2均大于0.999 0，不同类型样品菌落测试片法与国标检测方法的检测结果均为强相关，即两种方法的变化趋势非常
一致。
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（a）奶及奶制品（b）饮料
（d）肉制品
（e）方便食品
（c）冷冻食品
（f）宠物食品
图2 菌落总数测试片法与国标检测方法检测结果的线性关系
2.3 菌落总数定量测试片与国标检测方法的差异性分析
使用SPSS软件，采用单因素方差分析菌落测试片法与国标法的差异性。如表1所示，不同类型样品的
F值均小于F crit，且P＞0.05，说明菌落测试片检测结果与国标检测方法测定结果无显著性差异，两者检测结果基本一致。
表1 菌落总数测试片法与国标检测方法差异性分析(n=5)
样品
港珠澳跨海大桥国标检测方法测试片法
F P F cri t 平均值/log(CFU·g-1)方差平均值/log(CFU·g-1)方差
奶及奶制品 5.196 00.000 8 5.206 00.000 20.495 00.501 6 5.317 7饮料 5.140 00.000 9 5.166 00.000 5 2.363 60.162 7 5.317 7冷冻食品 5.140 00.000 9 5.164 00.001 2 1.352 10.278 4 5.317 7肉制品 5.210 00.002 0 5.224 00.000 60.372 60.558 5 5.317 7方便食品 5.162 00.008 5 5.212 00.004 50.962 30.355 3 5.317 7宠物食品 5.254 00.003 4 5.238 00.002 60.213 30.656 5 5.317 7
3 结论
本研究通过比较菌落总数测试片法与GB 4789.2—2016对6种不同类别食品菌落总数的检测，探索测试片法在快速检测食品中菌落总数领域的应用可行性。结果表明，采用菌落测试片法具有快速、简便
、结果便于判定等优点；在菌落计数方面，时长可缩短一半，能够有效提高工作效率。与国标检测方法加标检测结果一致，准确性好，检测结果无显著性差异。在实际检测工作中，可根据检测环境、设备配置情况及样品的特性选择合适的方法，既可提高检测效率，又可确保检测结果的准确性。
参考文献
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