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CNV-q结合STR多态性分析在检测孕早期流产物中潜在葡萄胎病例的应用价值
作者：郭芳芳 彭海山 万志彬 李怡 杨洁霞
来源：《新医学》2021年第07期
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【摘要】目的 評估基因组拷贝数变异测序（CNV-q）结合短串联重复序列（STR） 多态性分析技术在检测孕早期（≤9周）流产物组织中潜在葡萄胎病例的应用价值。方法 收集行流产物组织CNV-q结合STR多态性检测的孕早期病例，挑取部分新鲜绒毛组织进行CNV-q结合STR多态性检测，其余组织常规固定后进行病理组织学检测。结果 共纳入782例孕早期病例，经CNV-q结合STR多态性检测共检出66例（8.44%）潜在葡萄胎病例，其中57例（7.29%）为三倍体，9例（1.15%）为全基因组同源单亲二倍体。57例三倍体中有52例随访到病理形态学结果，其中19例提示为宫腔内绒毛，12例为部分绒毛间质水肿，12例为偶见绒毛、极少许绒毛和少许绒毛，9例未见绒毛。病理形态学提示未见绒毛和少许绒毛的3例三倍体病例的STR基因分型检测示染色体异常三倍体2例、部分性葡萄胎1例。9例全基因组同源单亲二倍体中，经病理形态学及p57Kip2蛋白免疫组织化学染色提示为完全性葡萄胎8例，余1例病理形态学提示少许绒毛，随后经STR基因分型检测证实该病例也为完全性葡萄胎。结论 CNV-q结合STR检测孕早期流产物对发现潜在的葡萄胎病例有一定的价值，特别是完全性葡萄胎;相较于病理组织学检测，STR基因分型检测在孕早期葡萄胎标本中更易获得可靠的结果。
【关键词】孕早期;葡萄胎;短串联重复序列多态性分析;产前诊断;基因分型
猴子王>梧桐花语 CNV-q combined with STR polymorphism in detection of potential hydatidiform mole in abortion tissues of early pregnancy women Guo Fangfang， Peng Haishan， Wan Zhibin， Li Yi， Yang Jiexia. Medical Genetics Center， Guangdong Women and Children Hospital， Guangzhou 510010， China Corresponding author， Yang Jiexia， E-mail： yjxfimmu@ 126. com
【Abstract】Objective To evaluate the value of CNV-q combined with short tandem repeat （STR） polymorphism in the detection of potential hydatidiform mole in abortion tissues of early pregnancy women （≤ 9 weeks）. Methods Clinical data of early pregnancy women who abortion tissues were subjected to CNV-q combined with STR polymorphism analysis were collected. The villi tissues were partially prepared for CNV-q combined with STR detection， and the remaining tissues were routinely fixed for histopathological diagnosis. Results A total of 782 early pregnancy women were recruited. Among them， potential hydatidiform mole was detected in 66 cas （8.44%） by CNV-q combined with STR including 57 cas of triploid （7.29%） and nine cas of whole genome isodisomy （1.15%）. Pathomorphological results were obt
手机快速充电ained in 52 of the 57 triploid cas. Normal villi were obrved in 19 patients. Partial villi stromal edema was en in 12 cas. Villi were occasionally noted or a slight or extremely slight amount of villi could be found in 12 cas. No villis were en in nine cas. Pathomorphological examination prompted that among three triploid cas with no villi and a slight amount of villi receiving STR genotyping， two patients were diagnod with chromosomal abnormal triploid and one ca of partial hydatidiform mole. Among nine cas of whole genome isodisomy， eight patients were indicated as complete hydatidiform mole by pathomorphological diagnosis and p57Kip2 immunohistochemistry， and the remaining one patient with a slight amount of villi was subquently confirmed as complete hydatidiform mole by STR genotyping. Conclusions The combination of CNV-q and STR has certain value in the detection of potential hydatidiform mole in the abortion tissues of women with early pregnancy， especially for complete hydatidiform mole. Compared with pathomorphological diagnosis， STR genotyping is more likely to obtain reliable results in detecting potential hydatidiform mole in early pregnancy women.
【Key words】Early pregnancy;Hydatidiform mole;Short tandem repeat polymorphism;Prenatal diagnosis;Genotyping
葡萄胎主要包括完全性葡萄胎和部分性葡萄胎，几乎所有的完全性葡萄胎为完全父源性单亲二倍体，部分性葡萄胎是具有双雄单雌来源的三倍体[1]。随着检测技术的进步，越来越多的孕早期流产妊娠物被发现为葡萄胎。但是，孕早期葡萄胎往往没有典型的临床症状，超声对孕早期葡萄胎的总体检出率也仅为50%左右[2]。2018年我国发布的妊娠滋养细胞疾病诊断与治疗指南（第四版）中，明确了病理组织学检测是葡萄胎最重要和最终的诊断方法[3]。但是孕早期葡萄胎病理组织形态学表现可能不典型，水肿性流产与葡萄胎病理组织形态学表现差异可能会不明显，且病理学家对此的解读也存在一定的主观性[4]。因此，对孕早期流产妊娠中葡萄胎的精准诊断仍然存在挑战。近年来，国内外学者对基于下一代测序技术的基因组拷贝数变异测序（CNV-q）临床应用的相关探索表明，CNV-q结合短串联重复序列（STR）多态性分析技术可应用于流产物样本分析，以检测覆盖全染色体非整倍体、大片段缺失/重复及全基因组CNV，与此同时还可以发现三倍体及同源单亲二倍体[5]。为此，本研究回顾性分析了经CNV-q结合STR多态性检测在孕早期（≤9周）流产物中发现的潜在的66例葡萄胎病例，希望为此类病例的临床管理提供一定的依据。
材料与方法
一、标本来源
收集2019年1月至2020年1月在广东省妇幼保健院进行流产物CNV-q结合STR检测的孕早期（≤9周）782例病例基本资料及其流产物组织（自然流产排出或稽留流产清宫术取出）。从新鲜流产物中挑取少量绒毛组织用于CNV-q及STR检测，剩余标本常规固定后用于病理组织学检测。所收集病例基本资料包括年龄、孕周、超声检查结果等。本研究已通过广东省妇幼保健院伦理委员会审批，检测前患者均已签署知情同意书。
二、病理组织学检查
将流产物组织置入适量的4%中性甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋并制作HE切片，由2位病理医师对HE 切片进行组织形态学观察，判断是否有绒毛水肿并记录其程度，具体指标包括绒毛积液水肿程度、是否有绒毛水池形成（大小超过绒毛的50%）、是否有细胞滋养叶细胞增生及其增生程度等[6]。对所有的经CNV-q及STR检测提示为同源单亲二倍体的标本进行p57Kip2蛋白免疫组织化学染色（免疫组化），采用广州安必平医药科技股份
有限公司的p57Kip2鼠抗人单克隆抗体行链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）染色检测p57Kip2蛋白在绒毛和蜕模组织中的表达情况，若绒毛间质细胞和细胞滋养叶细胞无棕色或者棕黄色染色，结果判定为阴性，即完全性葡萄胎，见图1。
三、STR检测
1. STR多态性检测流程
提取流产物组织及其母体外周血DNA，具体操作流程参照Magen磁珠法通用核酸提取试剂盒说明书。NanoDrop 2000评估所提取 DNA的浓度和纯度。将DNA浓度稀释至20 ～ 40 ng/μl，利用荧光标记多重PCR技术扩增13个常染色体STR位点（21号染色体5个、18和13号染色体各4个）。扩增产物经ABI 3500 xL测序仪毛细管电泳检测出各基因座的等位基因电泳数据，将电泳数据导入数据分析软件GeneMarker V2.2.0，进行数据分析及结果判断。根据GeneMarker V2.2.0软件分析结果，计算各个位点峰面积比值得出染色体倍体正常或异常的结论（二倍体、同源单亲二倍体、三倍体）。星期日英语
2. STR葡萄胎基因分型检测流程
将经STR多态性检测为同源单亲二倍体及三倍体的流产物病例，进一步与母体外周血DNA STR位点进行比对，分析其亲代来源，从而鉴定出完全性葡萄胎（单雄来源单亲二倍体）及部分性葡萄胎（双雄来源三倍体），见图2。
四、CNV-q检测
取流產物组织DNA 100 ng进行片段化处理，具体操作流程参照试剂盒NEBNext dsDNA Fragmenta Kit说明书进行。按照晶芯® 胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒说明书对片段化后的DNA进行文库构建及定量，然后上机测序。测序完成后，将样本的DNA序列与已知人类参考基因组序列进行比对，运用环状二元分割算法分析样本的CNV情况。通过检索数据库及查阅文献，参考美国医学遗传学会指南，对这些变异进行五分类（致病性、可能致病、临床意义不明确、可能良性、良性），判断样本是否存在全基因组致病性及可能致病性拷贝数变异[7]。
五、统计学处理
连续型变量如符合正态分布以表示，否则以中位数（最小值 ～ 最大值）表示;分类资料以例（%）或例（相对比）表示。
结果
一、一般资料
2019年1月至2020年1月在广东省妇幼保健院进行流产物CNV-q结合STR检测的孕早期（≤9周）病例共782例，其中潜在的葡萄胎妊娠共66例（8.44%），包括57例（7.29%）三倍体和9例（1.15%）同源单亲二倍体。57例三倍体病例妊娠年龄为30 （24 ～ 41）岁，检测时孕周为6 （5 ～ 9）周。9例同源单亲二倍体妊娠年龄为28（24 ～ 31）岁，检测时孕周为6（6 ～ 7）周。
二、57例三倍体病例分析
1. 总体情况
57例三倍体中，以69，XXY最常见（25例，43.85%），69，XXX次之（20例，35.09%），69，XYY 最少见（2例，3.51%），其余病例包括1例亚三倍体、8例超三倍体以及1例三倍体合并染色体部分三体和部分单体，即69，XXY， 3p12.1-pter（dup）， 3q11.2-qter（del）， 13q21.1-qter（del）。其中52例随访到病理组织形态学结果，提示
关于笑的四字词语为宫内绒毛及蜕膜组织19例、提示为部分绒毛间质水肿12例，提示为偶见绒毛、极少许绒毛和少许绒毛12例，未见绒毛9例。
