2021年4月
第31卷㊀第4期
中国比较医学杂志
CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVE MEDICINE散文投稿
April,2021
Vol.31㊀No.4
吴军，关涛，田峰，等.瑞香素对脊髓损伤大鼠运动功能改善作用的TRL4/NF-κB 信号通路机制研究[J].中国比较医学杂志,2021,31(4):84-90.
Wu J,Guan T,Tian F,et al.Effects of daphnetin on motor function of spinal cord injury bad on the TRL4/NF-κB signaling pathway in rats [J].Chin J Comp Med,2021,31(4):84-90.doi:10.3969/j.issn.1671-7856.2021.04.013
[基金项目]宁夏回族自治区重点研发项目(2018BEG03046)㊂
[作者简介]吴军(1980 )，男，副主任医师，研究方向：脊柱脊髓损伤㊂E-mail: [通信作者]赵芬芬(1980 )，女，主治医师，研究方向：脊柱脊髓损伤㊂E-mail:
瑞香素对脊髓损伤大鼠运动功能改善作用的
TRL4/NF-κB 信号通路机制研究
吴㊀军，关㊀涛，田㊀峰，刘学起，马㊀剑，王庆峰，赵芬芬∗
(宁夏回族自治区人民医院骨科，银川㊀750021)
㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀探讨瑞香素激活Toll 样受体4/核转录因子kappa B(Toll like receptor 4/NF-κB,TRL4/NF-κB)信号通路对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后神经再生及功能恢复的影响，为促进SCI 的分子机制研究提供依据㊂方法㊀建立脊髓损伤实验大鼠模型，并分别于术后1d㊁8d㊁14d㊁21d 和30d，采用Basso Beattie
遮挡车牌扣几分Bresnahan(BBB)运动功能评分和联合行为评分法(combine behavioral score,CBS)评分测试评价各组SCI 大鼠治疗后的神经功能；采用相关试剂盒检测脊髓组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismuta,SOD)㊁过氧化氢酶(catala,CAT)㊁谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxida,GSH-Px)
活性及丙二醛(maleicdialdehyde,MDA)㊁肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)㊁白介素-1β(interleukiN-1β,IL-1β)㊁白介素-6(interleukin 6,IL-6)㊁白介素-10(interleukin 10,IL-10)的表达量变化；并采用蛋白质印迹法(Western blot)检测术后各组脊髓组织中对实验大鼠脊髓组织中BCL2-Associated X 的蛋白质(BCL2-Associated X Protein,Bax)㊁B 淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)㊁Caspa-3㊁细胞色素C(cytochrome C,Cyt-c)㊁脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)㊁酪氨酸激酶受体B(tyrosine kina receptor B,TrkB)㊁磷酸化酪氨酸激酶受体B(phospho-tyrosine kina receptor B,p-TrkB)㊁TOLL 样受体4重组蛋白(recombinant toll like receptor 4,TRL4)和核因子-κB p65(nuclear factor-kappa b p65,NF-κB p65)水平的影响㊂结果㊀瑞香素能够显著性改善实验大鼠BBB 评分和CBS 评分结果，且联合用药治疗组效果优于单一药物的疗效㊂此外，瑞香素能够改善实验大鼠脊髓组织中SOD㊁CAT㊁GSH-Px 活性和MDA 含量，能够降低脊髓组织中TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6和IL-10含量;Western blot 实验结果表明瑞香素对脊髓损伤诱发的凋亡相关蛋白异常表达具有显著的调节作用，并能够显著性调节BDNF /TrkB 信号通路和TRL4/NF-κB 信号通路㊂结论㊀瑞香素改善脊髓损伤的作用机制与是激活TRL4/NF-κB 信号密切相关㊂
ʌ关键词ɔ㊀脊髓损伤；瑞香素;TRL4/NF-κB 信号通路；炎症
ʌ中图分类号ɔR-33㊀㊀ʌ文献标识码ɔA㊀㊀ʌ文章编号ɔ1671-7856(2021)04-0084-07
Effects of daphnetin on motor function of spinal cord injury bad on the
TRL 4/NF-κB signaling pathway in rats
WU Jun,Guan Tao,TIAN Feng,LIU Xueqi,MA Jian,WANG Qingfeng,ZHAO Fenfen ∗
(Department of Orthopedics,Peopleᶄs Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region,Yinchuan 750021,China)
㊀㊀ʌAbstractɔ㊀Objective㊀To investigate the effect of daphnetin on the TRL4/NF-κB signaling pathway involved in nerve regeneration and functional recovery after spinal cord injury(SCI)in rats.This study aimed to provide a basis for study of the molecular mechanism of SCI.Methods㊀A laminectomy was performed at the T9level and the expod dorsal surface of the spinal cord was subjected to a contusion injury as established a spinal cord injury model.On the1st,8th, 14th,21st,and30th days after the operation,the Basso Beattie Bresnahan motor function score and combine behavioral score were ud to evaluate neurological function of rats with SCI in each group.The activity of SOD,CAT,and GSH PX enzymes,and MDA,TNF-α,IL-1β,IL-6,and IL-10expression were detected by kits.Western blotting was ud to determine protein levels of Bax,Bcl-2,caspa-3,Cyt-C,BDNF,TrkB,and p-TrkB in the spinal cord tissue of experimental rats.Results㊀The BBB and CBS scores were significantly improved by daphnetin(P<0.05),and the e
ffect of the high daphnetin group was better than that in the low daphnetin group.Additionally,daphnetin improved the activity of SOD,CAT,and GSH PX and MDA levels in the spinal cord of experimental rats(P<0.05),and reduced TNF-α,IL-1β, IL-6,and IL-10levels in the spinal cord(P<0.05).Western blot showed that daphnetin significantly regulated abnormal expression of apoptosis-related proteins and the BDNF/TrkB signaling pathway.Conclusions㊀Daphnetin may play a role in spinal cord injury by activating TRL4/NF-κB signaling.
ʌKeywordsɔ㊀spinal cord injury;daphnetin;TRL4/NF-κB signaling pathway;inflammation
㊀㊀脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是由外力导致的中枢神经系统疾病，会导致运动功能障碍与慢性疼痛综合征等[1-2]㊂近年来WHO数据表明脊髓损伤呈现高发趋势，全世界每年大约有25000~ 50000名脊髓损伤患者[3]㊂依据脊髓损伤的发病原因㊁病理变化过程和特征等特点，可将其分为原发性脊髓损伤和继发性脊髓损伤㊂研究认为，脊髓损伤诱发的神经功能缺损不仅是由于初始的实质性损伤，而是损伤后的一系列级联分子反应，导致神经元受损㊂继发性脊髓损伤是一种机体在细胞和分子水平的主动调控过程，包括一系列的病理性生理变化，如脊髓组织发生的自噬㊁炎症㊁氧化损伤㊁凋亡㊁坏死和水肿等，都会严重影响神经功能㊁胶质细胞活化与白质恢复等㊂多种因素的联合作用进而诱发永久的病理生理性改变，最终导致肢体运动功能和感觉能力丧失等[4-7]㊂
TRL4/NF-κB信号通路广泛参与调控机体多种生理和病理变化过程，与机体免疫调节和炎症反应具有密切关系㊂当机体脊髓组织受到损伤后诱发机体炎症反应，诱导TRL4激活NF-κB信号通路，介导下游炎症因子的释放和表达㊂瑞香素(daphnetin, DAP)是从瑞香科类中草药中提取的香豆素类活性成分㊂既往研究表明，瑞香素具有抗氧化㊁抗癌㊁抗炎和神经保护等多种药理活性，能够通过抑制机体炎症和氧化应激损伤进而改善机体损伤[8-9]㊂因此，本研究采用脊髓损伤大鼠模型，以探究瑞香素对脊髓损伤模型大鼠的氧化应激损伤㊁炎症水平及TRL4/NF-κB信号通路的调节作用，并探究其作用机制㊂1㊀材料和方法
免费彩铃怎么弄1.1㊀实验动物
本研究选择75只SPF级雄性Wistar大鼠,8周龄，均购买自宁夏医科大学实验动物中心[SCXK
(宁)2016-0003]，动物饲养于宁夏回族自治区人民医院动物实验室[SYXK(宁)2016-0012]，体重为(180ʃ20)g，均饲养恒温(25ħ)㊁恒湿(50ʃ5)%条件下，并保持饲养间长期保持通风㊁干燥和安静的环境，以12h的昼夜循环㊂本研究经宁夏回族自治区人民医院动物伦理委员会批准(IACUC-NY2018AC04)㊂本实验的所有动物实验操作均遵循3R原则，以最大程度保证实验福利㊂
1.2㊀主要试剂与仪器
瑞香素购买自上海吉至生化科技有限公司(纯度ȡ97%，批号:SIG-D5564，上海，中国);SOD (批号:A001-3-2)㊁CAT(批号:A007-1-1)㊁GSH-Px (批号:A005-1-2)㊁MDA(批号:A003-1-2)均购买自南京建成生物工程研究所(南京，中国);TNF-α(批号:TNA-H82E3)㊁IL-1β(批号:IL2-H4256)㊁IL-6(批号:CD6-H82E8)㊁IL-10(批号:TRL-H5259)均购买自ACRO Biosystems公司(美国); Bax(批号:5023S)㊁Bcl-2(批号:3498S)㊁Caspa-3 (批号:14220S)㊁Cyt-c(批号:11940S)㊁BDNF(批号:47808S)㊁TrkB(批号:4603S)和p-TrkB(批号: 4619S)一抗㊁荧光二抗(批号:5366)均购买自Cell Signaling Technology(US);BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号:A045-4-2)购买自南京建成生物工程研究所(南京，中国)㊂
1.3㊀实验方法
1.3.1㊀给药及分组和实验大鼠模型的制备
各组实验用大鼠均需在适应一周后开始进行以下试验㊂脊髓损伤模型的建立：采用电磁力驱动冲击器(10g,12.5mm)进行T10挫伤性脊髓损伤；而空白组则只接受椎板切除术㊂术后各实验鼠在加热垫灯下维持体温在36ħ~37ħ，直至其完全苏醒[1-2,5]㊂术后给予大鼠相应剂量的镇痛(50mg/kg Temgesic，皮下)和生理盐水(0.5mL，皮下)以防止疼痛和脱水，然后在饮用水中加入抗生素使其接受抗生素1周㊂创伤后6h进行BBB运动功能评分和CBS评分测试，并将75只大鼠随机均分为5组(n= 15)：空白组(Sham)，
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模型组(Model)，瑞香素低剂量组(30mg/kg)㊁中剂量组(60mg/kg)和高剂量组(90mg/kg)；术后第4天开始连续给予瑞香素，连续给药4周㊂
1.3.2㊀运动功能评价
采用BBB评分法和CBS评分法以评价各组试验大鼠的脊髓功能的恢复情况㊂在造模前1d㊁造模后第1㊁8㊁15㊁22和30天对各组实验大鼠分别进行BBB评分和CBS评分，以评价各组实验大鼠后肢的运动功能状况㊂在BBB评分中分为0~21分：其中, 0分表示后肢完全无运动能力,21分为后肢能力完全正常；若BBB评分在5分以下则表示脊髓损伤大鼠造模成功㊂在CBS评分中分为0~100分：其中，正常为0分，全瘫为100分㊂
1.3.3㊀各组实验大鼠脊髓组织中氧化应激相关酶与细胞因子的测定
大鼠分组和处理同上㊂各组大鼠连续给药4周后，经腹腔注射戊巴比妥钠(40~60mg/kg)麻醉后，处死，快速抽取脊髓组织样本，然后采用冷生理盐水进行冲洗，以后续实验㊂在脊髓组织中加入适量的PNS缓冲液，采用液氮进行研磨㊁匀浆，在4ħ㊁3500r/min条件下离心15min后取上清㊂所有实验操作均严格按照相应试剂盒说明书进行，检测SOD㊁CAT㊁GSH-Px酶活性及MDA含量，以及细胞因子TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6㊁IL-10的表达量㊂
1.3.4㊀Western blot检测炎症相关蛋白的表达量
大鼠分组和处理同上㊂将实验大鼠麻醉㊁处死后迅速抽取各组实验大鼠的脊髓组织样本，采用液氮猝灭并在液氮条件下进行研磨成粉末状，再加入适量的RIPA裂解液使得蛋白组织充分裂解后，在冰浴条件下放置1h，并且在此期间对样本溶液进行适当的震荡㊁摇匀；然后在4ħ条件下，以12000r/min离心15 min后取上清㊂然后使用BCA试剂盒法测定其上清液中的总蛋白浓度㊂在10%SDS-PAGE上分离提取的蛋白，并转移到PVDF膜上,37ħ条件下封闭1h㊂然后加入相应的一抗在4ħ条件下孵育过夜，后将其在TBST中洗涤3次㊂然后加入二抗，在37ħ条件下孵育1h后进行洗膜㊂以β-actin为内参㊂凝胶成像系统成像,Image J软件计算灰度值㊂
1.4㊀统计学方法
本实验中实验数据的统计分析采用SPSS26.0软件，图表的制作采用GraphPad5.0软件，计量数据以平均数ʃ标准差( xʃs)表示；实验数据中多组间实验数据的比较采用单因素方差分析，以P<0.05认为具有显著性统计学差异;BBB评分和CBS评分等实验数据的分析则采用方差分析进行比较㊂
2㊀结果
2.1㊀SCI大鼠BBB
评分
注:A：假手术组;B：模型组:C：脊髓损伤+瑞香素30mg/kg;D:
脊髓损伤+瑞香素60mg/kg;E：脊髓损伤+瑞香素90mg/kg；与假手术(Sham)组相比,∗P<0.05,∗∗P<0.01；与模型(SCI)组相比,#P<0.05,##P<0.01㊂
图1㊀给予治疗后SCI大鼠在造模前㊁造模后的BBB评分图Note.A,Normal group.B,Model group.C,Spinal cord injury+ daphnetin30mg/kg.D,Spinal cord injury+daphnetin60mg/ kg.E,Spinal cord injury+daphnetin90mg/kg.Compared with sham group,∗P<0.05,∗∗P<0.01.Compared with SCI group, #P<0.05,##P<0.05.
Figure1㊀BBB score map of SCI rats before and after treatment BBB评分结果如图1所示；造模前各组实验大鼠的BBB评分无统计学差异，表明各组实验大鼠的运动功能均无障碍㊂然而，当实验大鼠开始接受脊髓损伤后，各模型大鼠的运动功能均明显降低，表明造模成功㊂假手术组中各实验大鼠的BBB评分在术前㊁术后均无显著性差异(P>0.05)，表明手术对实验大鼠的活动并无明显影响㊂当给予瑞香素
30d 后，实验大鼠的下肢运动功能得到了明显得到提升，其BBB 评分也得到显著性升高(P <0.05)，呈现剂量-时间依赖性关系㊂
2.2㊀Combine behavioral score (CBS )评分CBS 评分结果如图2所示；造模前各组实验大
鼠的CBS 评分无统计学差异，表明各组实验大鼠的运动功能均无障碍㊂然而，当实验大鼠开始接受脊髓损伤后，各模型大鼠的运动功能均明显降低㊂当大鼠接受脊髓损伤后1d，模型组与空白组出现显著
性差异(P <0.05)，表明模型建立成功，当模型大鼠各给药组给予相应药物治疗后，各给药组实验大鼠的CBS 评分较模型组实验大鼠的CBS 评分均明显降低(P <0.05)，表明瑞香素对于实验大鼠的脊髓损伤均具有一定的改善作用，且高剂量治疗组效果优于低剂量组的治疗效果㊂
注:A：假手术组;B：模型组:C：脊髓损伤+瑞香素30mg /kg;D：脊髓损伤+瑞香素60mg /kg;E：脊髓损伤+瑞香素90
mg /kg；与假手术(Sham)组相比,∗P <0.05,∗∗
P <0.01㊂与模型(SCI)组相比,#P <0.05,##P <0.01㊂图3㊀瑞香素对SCI 大鼠脊髓中SOD(A)㊁GSH-Px(B)㊁CAT(C)活性和MDA(D)含量的影响
Note.A,Normal group.B,Model group.C,Spinal cord injury +daphnetin 30mg /kg.D,Spinal cord injury +daphnetin
60mg /kg.E,Spinal cord injury +daphnetin 90mg /kg.Compared with sham group,∗P <0.05,∗∗
P <0.01.Compared
with SCI group,#P <0.05,##
P <0.05.
Figure 3㊀Effect of daphnetin on the activity of SOD (A),GSH-Px (B),CAT (C)and
MDA (D)in spinal cord of rats were affected by
treatment
注:A：假手术组;B：模型组:C：脊髓损伤+瑞香素30mg /kg;D：脊髓损伤+瑞香素60mg /kg;E：脊髓损伤+瑞香素90mg /kg；与假手
术(Sham)组相比,∗P <0.05,∗∗
P <0.01；与模型(SCI)组相比,#P <0.05,##
P <0.01㊂
图2㊀给予治疗后SCI 大鼠在造模前㊁造模后的CBS 评分图
Note.A,Normal group.B,Model group.C,Spinal cord injury +daphnetin 30mg /kg.D,Spinal cord injury +daphnetin 60mg /kg.E,Spinal cord injury +daphnetin 90mg /kg.Compared with sham group,∗P <0.05,∗∗P <0.01.Compared with SCI group,#P <0.05,##
P <0.05.
Figure 2㊀CBS score map of SCI rats before and after treatment
2.3㊀瑞香素对SCI 大鼠脊髓组织氧化应激状态的影响
机体氧化应激水平严重影响脊髓损伤后恢复㊂本研究结果显示，与假手术组实验大鼠相比，模型组实验大鼠脊髓组织中SOD(图3A)㊁GSH-Px(图3B)与CAT(图3C)活性较空白实验大鼠显著性降低(P <0.05),MDA(图3D)含量显著性升高；然而,
当给予实验大鼠相应剂量的瑞香素治疗之后，其脊髓组织中SOD㊁CAT㊁GSH-Px 活性和MDA 含量均有显著性回调，表明给予药物治疗后脊髓损伤大鼠的氧化应激状态具有显著的改善作用㊂其中，高剂量组的治疗效果优于低剂量组的疗效㊂
2.4㊀瑞香素对GM1对SCI 大鼠脊髓组织中TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6和IL-10含量的影响
炎症在脊髓损伤的发生㊁发展过程中也具有重要作用㊂因此，本研究测定了各组实验大鼠脊髓组织中TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6和IL-10炎症因子水平的变化，具体如下图所示㊂与假手术组实验大鼠相比，模型组实验大鼠脊髓组织中TNF-α(图4A)㊁IL-1β(图4B)㊁IL-10(图4C)和IL-6(图4D)含量均显著性升高(P <0.05)，表明机体处于过炎症状态㊂当给予药物治疗后，机体内细胞因子水平均有所回调(P <0.05)，表明瑞香素对脊髓损伤诱发的机体炎症具有显著性的调节作用㊂2.5㊀瑞香素对SCI 大鼠脊髓组织中凋亡信号通路
的影响
如图5所示，与假手术组相比较，模型组的Bax /Bcl-2(图5A㊁5B)㊁Caspa-3(图5C㊁5D)和Cyt-c(图5E㊁5F)含量均显著性升高，表明脊髓损伤导致了大鼠脊髓组织促凋亡相关蛋白显著性增加；当给予瑞香素后，其Bax /Bcl-2(图5A㊁5B)㊁Caspa-3(图5C㊁5D)和Cyt-c(图5E㊁5F)含量的变化均发生
木槿树显著性回调，表明瑞香素对脊髓损伤诱发的凋亡相关蛋白异常表达具有显著的调节作用，且高剂量组治疗效果优于低剂量组
㊂
注:A：假手术组;B：模型组:C：脊髓损伤+瑞香素30mg /kg;D：脊髓损伤+瑞香素60mg /kg;E：脊髓损伤+瑞香素90mg /kg；与假手术(Sham)
组相比,∗P <0.05,∗∗
P <0.01㊂与模型(SCI)组相比,#P <0.05,##P <0.01㊂
图4㊀瑞香素对SCI 大鼠脊髓中TNF-α(A)㊁IL-1β(B)㊁IL-10(C)和IL-6(D)含量的影响
Note.A,Normal group.B,Model group.C,Spinal cord injury +daphnetin 30mg /kg.D,Spinal cord injury +daphnetin 60mg /kg.E,Spinal cord injury +daphnetin 90mg /kg.Compared with sham group,
∗飞花落叶
P <0.05,∗∗P <0.01.Compared with SCI group,#P <0.05,##P <0.05.
Figure 4㊀Effect of daphnetin on the contents of TNF-α(A),IL-1β(B),IL-10(C)and IL-6(D)in spinal cord of SCI
rats
胆气虚注:A：假手术组;B：模型组:C：脊髓损伤+瑞香素30mg /kg;D：脊髓损伤+瑞香素60mg /kg;E：脊髓损伤+瑞香素90mg /kg；与假手术(Sham)
组相比,∗P <0.05,∗∗P <0.01㊂与模型(SCI)组相比,#P <0.05,##P <0.01㊂
图5㊀瑞香素对实验大鼠脊髓组织中Bax /Bcl-2(A /B)㊁Caspa-3(C /D)和Cyt-c(E /F)水平的影响
Note.A,Normal group.B,Model group.C,Spinal cord injury +daphnetin 30mg /kg.D,Spinal cord injury +daphnetin 60mg /kg.E,Spinal cord injury +daphnetin 90mg /kg.Compared with sham group,
∗
P <0.05,∗∗P <0.01.Compared with SCI group,#P <0.05,##P <0.05.
Figure 5㊀Effect of daphnetin on Bax /Bcl-2(A /B),Caspa-3(C /D)and Cyt-C (E /F)
levels in spinal cord tissue of experimental rats
2.6㊀瑞香素对SCI 大鼠脊髓组织中BDNF /TrkB 和TRL4/NF-κB 信号通路的影响
如图6所示，与假手术组相比较，模型组的BDNF(图6A㊁6B)㊁TrkB (图6C㊁6D)㊁p-TrkB (图6E㊁6F)㊁TRL4(G /H)和NF-κB p65(I /K)含量均显
著性升高，表明脊髓损伤导致了大鼠脊髓组织BDNF /TrkB 信号通路和TRL4/NF-κB 信号通路相关蛋白异常表达；当给予瑞香素后，其BDNF(图6A㊁6B)㊁TrkB(图6C㊁6D)㊁p-TrkB(图6E㊁6F)㊁TRL4(G /H)和NF-κB p65(I /K)含量的变化均发生显著性回调，且呈现剂量依赖性，表明瑞香素能够显著性调节BDNF /TrkB 信号通路和TRL4/NF-κB 信号通路㊂
3㊀讨论
脊髓损伤是由脊柱损伤后诱发的严重并发症之一，包括原发性脊髓损伤与继发性脊髓损伤㊂其中继发性脊髓损伤是损伤后机体细胞和分子水平的一种主动调节过程，具有可逆性和可控性；这也是目前脊髓损伤治疗的主要阶段[10-11]㊂目前，药物治疗是降低脊髓损害程度最为快捷和有效的方法之一㊂然而，目前临床治疗中，尚无一种安全有效的药物㊂因此，寻找一种安全㊁有效㊁多靶点的抗脊髓损伤药物，已成为脊髓损伤相关疾病及其药物研发的新热点和难点㊂
大量研究表明，脊髓损伤过程中伴随着氧化应激
损伤[12-13]㊂抗氧化剂能够有效降低损伤脊髓组织中乳酸脱氢酶活性，减少超氧阴离子对机体的损害
和继发性水肿，继而达到治疗SCI 的目的㊂瑞香素是一种天然抗氧化剂，能够激活并促进机体内抗氧化酶活八平方
