Chinr Journal of Rehabilitalion M edicine..M ay 2021. \ 〇l. 36. No.5
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光遗传学靶向激活M l区谷氨酸能神经元促进
脊髓损伤大鼠运动功能恢复的初步研究*
邓维维1闵令霞'冯州1侯景明'刘宏亮
摘要
目的：观察光遗传学靶向激活M1区谷氨酸能神经元对脊髓损伤(SCI>大鼠运动功能恢复的影响:，
方法:24只雌性SD大鼠随机分为3组：单纯SCI组(8只），光刺激组(8只）和假刺激组(8只）应用钳夹法制备大鼠SCI模型：单纯SC丨组仅行SC丨造模，不作任何干预；光刺激组利用光遗传学技术精确激活SCI大鼠双侧M l区谷氨酸能神经元；假刺激组植入的病毒中不含光敏感蛋白，利用光遗传学技术无法激活谷氨酸能神经元光刺激组和假刺激组大鼠于造模成功后第3 —14天进行470mn蓝光刺激，每日2次，共刺激2周。采用BBB评分和斜坡实验在造模后1一8周时每周评价SCI大鼠的运动功能。在SC[造模后第4周时每组取2只大鼠的脊髓组织进行HE染色观察损伤区域脊髓的修复情况。
结果：实验期间通过光遗传学技术刺激SCI大鼠M l区谷氨酸能神经元总体是安全的BBB评分和斜坡实验显示，光刺激组SCI大鼠的运动功能从SCI后第2周开始明显要优于单纯SC丨组和假刺激组(P<0.01)，其中第4周时光刺激组的BBB评分与其余2组差异最明显(P<0.001)。单纯SCI组和假刺激组在各时间点的BBB评分和斜坡实验评分均无明显差异(/^〇.〇5) SCI造模后第4周时HE染色显示光刺激组脊髓组织的恢复情况明显优于单纯SCI组和假刺激组。
结论:M l区的谷氨酸能神经元在SCI大鼠功能恢复中起着重要作用，未来可以作为一个重要的干预靶点进行深人研究。
关键词脊髓损伤；光遗传学；初级运动皮层；谷氨酸能神经元；运动康复
中图分类号：R651.2.R49 文献标识码：A 文章编号：1001-1242(2021 )-05-0520-06
A preliminary study on effects of optogenetic stimulation of glutamate neurons in the Ml region on the
functional recovery of rats with spinal cord injury/DENG Weivvei,MIN Lingxia，FENG Zhou,et al.// Chine Journal of Rehabilitation Medicine, 2021, 36(5)：520—525经典笑话精选
Abstract凉拌猪皮冻
Objective：To investigate the effects of optogenetic stimulation of glutamate neurons in the Ml region on motor function recovery in spinal cord injury (SCI) rats.
Method：The 24 female SD rats were randomly divided into 3 groups：pure SCI group (n=8), stimulation group (n=8) and fal stimulation group (n=8). Rat model of T10 spinal cord injury was prepared by clamping method. The pure SCI group only underwent spinal cord injury modeling without any intervention. The stimulation group was given optogenetics to precily activate glutamate neurons in bilateral Ml region of rats with SCI. The virus implanted in the fal stimulation group did not contain light-nsitive proteins and could not activate glutamate neurons using optogenetics. The fiber embedded in the Ml zone of SCI rats was stimulated by 470nm blue light after the successful modeling, twice a day for 2 weeks continuously. BBB score and
DOI: 10.3969/j.issn. 1001-1242.2021.05.003
*基金项目••国家自然科学基金项目(81671211,81672251)；西南医院优秀人才基金项目（2017MPRC—08，SWH2016JSYB—08)
1陆军军医大学西南医院康复科，全军创伤疾病康复治疗中心，重庆市，400038; 2通讯作者
第一作者简介：邓维维，女，硕士研究生；收稿日期:2020-04-27
中#雇1 f i聲忘2021年，第36卷，第5期
ramp test were ud to evaluate the motor function of SCI rats at 1to 8 weeks of treatment. Repair of spinal cord injury was obrved by HE staining at 4 weeks.
Result：The BBB scores showed that the motor function of each group incread with the extension of time,
but the BBB score of the light stimulation group was higher than that of the pure SCI group and the fal stimulation group (P<0.01).Slope experiment showed that the slope angle of the light stimulation group was higher than that of the SCI group and the fal stimulation group every week (P<0_001).HE staining showed that the recovery of spinal cord tissue in the light stimulation group was significantly better than that in the pure SCI group and the fal stimulation group.
Conclusion：Optogenetic activation of glutamate-energy neurons in Ml region lectively can ameliorate the recovery of injured spinal cord tissue, thus promote the motor function recovery of SCI rats.
Author's address Department of Rehabilitation,Southwest Hospital,Army Medical University,Chongqing,400038 Key word spinal cord injury；optogenetics; primary motor cortex；glutamatergic neuron；motor recovery
脊髓损伤（spinal cord injury,SCI)是当今世界主要致残疾病之一，不仅影响患者个人的生活质 量，而且给家庭和社会造成沉重的经济负担。目前 对于脊髓损伤仍缺乏有效的干预手段，探索新型治 疗手段是当今SCI研究领域的热点。我们曾利用功 能磁共振技术证实SCI患者早期即存在着脑结构和 功能的重塑，尤其是SCI患者M l区兴奋性的增加是 后期功能恢复的关键n_21。由于在M l区不仅存在兴 奋性神经元(谷氨酸能神经元），同时也存在了抑制 性神经元[7-氨基丁酸(GABA)能神经元]，到底是何 种神经元在SCI的功能恢复中起着重要作用目前尚 不清楚。光遗传学技术是近年来发展起来的一种精 准神经调控技术，可以精确激活光刺激区域某一特 定类型的神经元[3]。目前国内外尚没有光遗传学技 术在SCI后运动功能恢复中的研究报道。在本研究 中，我们使用光遗传学技术靶向激活SCI大鼠M l区的谷氨酸能神经元，探索其对SCI大鼠脊髓损伤运 动功能恢复的影响。
1材料与方法
1.1实验材料
10周龄、体重（220±20)g成年雌性、SPF级SD 大鼠(陆军军医大学动物中心提供），按随机数字表
法分为3组：单纯SCI组(8只），假刺激组(8只），光 刺激组(8只）。按照每笼两只老鼠安置在标准实验 室笼子里，光/暗周期为12/12h，词养温度为（24± 2)°C，随意获取食物和水。术后1一8周，每周观察 各组大鼠运动功能变化，第4周取脊髓组织进行HE 染色。主要实验材料:5%水合氯醛(7ml/kg)、3%戊巴比妥钠、手术器械、注射器、生理盐水、4%多聚甲 醛、乙醇、石蜡、二甲苯、荧光显微镜、50g动脉瘤夹。
1.2分组及干预方法
按随机数字表法分为3组：单纯SCI组(8只），假刺激组(8只），光刺激组(8只），三组大鼠均作SCI 模型，单纯SCI组仅使其SCI不做其他干预，其余两 组在SCI模型的基础上植入对应病毒并进行光刺激 (其中假刺激组注射病毒为AAV-CaMKIIa-mCher-ry；光刺激组注射病毒为AAV-CaMK II a-ChR2- mCherry)〇
1.3病毒植人
注射方法和剂量参照我们之前的发表的文章\具体步骤如下：先用3%戊巴比妥钠(40mg/ kg,i.p.)麻醉大鼠，诱导后将其固定于数字立体定 向框架内。随后，在头皮顶部开一个切口，根据 bregma的位置，在M l区用钻子钻出两个小洞[一侧 坐标：正侧（AP)=+ 0.74mm，中外侦(ML)=-1.5 mm，背腹侧（DV)=- 0.5mm；另一侧坐标：AP=+ 0.74mm，ML=+1.5mm，DV=-〇.5mm]。我们使用 立体定位控
制微量调节注射器泵以〇.〇5nl/min的速 度慢慢注入3|j l1含有病毒的液体，该病毒由Taitool 生物科学(上海，中国）提供。其中假刺激组注射病 毒为 AAV-CaMKIIa-mCherry，该病毒含有 CaMKlIa 基因启动子序列，可以精确感染谷氨酸能神经元，但 不含光通道蛋白基因，所以光照后不能激活M l区 的谷氨酸能神经元。光刺激组注射病毒为AAV-CaMKIIa-ChR2-mCherry，含有 CaMKlIa基因启动 子序列和光通道蛋白基因，可以精确地感染谷氨酸能 的神经元并被相应的蓝光激活。注射后，针头留在原
采购的工作内容 521
Chine Journal oj /{ehabilitation M edicine, Way2021. \«»l. 36. N〇.5
处5min后退出，让病毒扩散到周围组织。拔针后缝 合伤口，待老鼠恢复清醒后，放回鼠笼词养。
1.4光纤植入
在注射病毒3周（病毒基本表达）后植入光纤，用3%戊巴比妥钠(40mg/kg，i.p.i)麻醉大鼠，并将 其置于数字立体定位架(Narishige，东京，日本）。在 剃掉头发并在头皮顶部开一个切口后，在M l区用 牙钻钻出8个小洞。光纤（直径0.25mm，多利安式 眼镜，QC，加拿大）被植入大脑运动皮层两侧（± 1.70mm前，前囟土 1.70mm的侧中线，1.70mm以下硬 脑膜)和剩下的6个孔与田螺修复安装。最后用502 胶水和牙水泥粘接颅骨上的伤口。激光刺激不早于 病毒注射后四周，以便有足够的时间进行病毒
转染 和视蛋白表达。光刺激系统由500mW 470nm激光 发生器、62.5/125—SMA/FC“中间导通光纤”、FC_ FC耦合陶瓷套管和50/125—FC“脑内植入光纤”组 成。光纤与470nm激光发生器相连接，通过分片2 适配器与波形发生器示波器相连接。通过设置波形 发生器上的刺激参数(如光脉冲刺激时间、频率、占空比、总刺激时间），控制激光发生器发射相应的脉 冲。根据ChR2通道蛋白^的光电特性，根据相关报 道161采用光刺激的脉宽选择为15—20ms，频率选择 1一 50Hz，对大鼠大脑区域进行光遗传学研究。于 造模成功后第3 —14天利用470nm蓝光进行刺激，根据Alilain方案m，波长为470nm，每分钟30次，共 4min，休息3min，每次重复3个周期，每天2次，每周 5次。对于2周的光刺激和所有的手术都应该注意 无菌操作。
1.5 SCI动物模型制备
小数除法练习题植入光纤3天后，用5%水合氯醒(7ml/kg体重）麻醉大鼠，并将其置于立体定位架上，暴露T8 —10 椎板处的脊髓。各组大鼠脊髓均暴露，用50g动脉 瘤夹压迫T9脊髓60s，在此期间伴有尾摇和后肢反 射，提示SCI模型成功。术后，大鼠注射青霉素(200000U/只/天），然后放回笼子，术后连续7天皮 下注射以防止感染。在伤后生存期间，每天两次监 测大鼠的一般健康、感染和活动能力。术后护理包 括每天两次人工膀胱排尿，直至大鼠自发排尿。蚂蚁吃西瓜
1.6行为学观察
采用BBB评分181和斜坡试验观察SCI大鼠的运动功能恢复情况=于SCI术后1一8周每周对各组 大鼠进行BBB行为学评分(0分为全瘫，21分为正 常）和斜坡实验(坡度从20°—90°，每两个坡度之间 间隔5°)检测双后肢的运动功能和部分支撑抓握能 力，行为学评分均由实验室两名不知情的人员进行。
1.7 HE染色
SCI造模术后第4周（蓝光刺激后第2周）每组 处死2只大鼠进行脊髓组织取材，染色观察各组SCI 处的组织变化。苏木精-伊红染色(hematoxylin-e o-sin，HE)在4%多聚甲醛(PFA,0.1M磷酸缓冲液，pH7.4)中固定含有损伤区域的脊髓T9节段,4°C, 24h。然后，将组织切片分别转移到75%、85%、95% 和100%不同浓度的乙醇中15min，并分别脱水。之 后，脊髓节段T9采用不同浓度的乙醇、二甲苯和石 蜡进行透明包埋。接下来用冷冻切片机将脊髓组织 切片，片厚3|jL m，把切片用蒸馏水在室温清洗3—7 天，然后使用明矾苏木精染核10 —15min，用流水冲 洗后再用伊红染色2min。最后脱水、清透、装瓶。仔细检查损伤区组织切片的范围，使用Olympus BX53F荧光显微镜（日本），使用4x物镜获取损伤区 组织切片的图像。
1.8统计学分析
研究数据使用SPSS18.0软件进行统计分析。所有数据均以均数±标准差表示。三组间差异采用 重复测量的多因素方差分析，设定P< 0.05表示差 异有显著性意义。
2结果
2.1病毒表达及安全性结果
本实验病毒植人部位主要为大鼠双侧M l区，待病毒注射3周后病毒稳定表达时，应用免疫组化 检测病毒表达的细胞选择性，可见本实验注射的 ChR2-mCherry能特异性表达在谷氨酸能神经兀（图1)。整个实验期间各组大鼠生命体征平稳、未发生 死亡现象。假刺激组和光刺激组的大鼠在接受光刺 激时，并未诱发癫痫、惊厥等症状。以上初步说明光 刺激大鼠M l区谷氨酸能神经元是安全的。
2.2大鼠BBB评分
造模后第1周3组大鼠BBB评分之间差异无显 著性意义(办0.05)。从第2周开始，光刺激组BBB
中®觅冬2〇2丨年，第％卷，第5期
图2 SCI 后1一8周每周各组BBB 评分
损伤时间(周）
注：## 尸 <0.01
损伤时间(周）
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神经纤维结构清晰，坏死、萎缩神经元较少，见图 4。以上结果说明光遗传学刺激SCI 大鼠M l 区谷氨 酸能神经元可以明显减轻SCI 大鼠SCI 区域的继发 性损伤。3
讨论
运动功能障碍是SCI 患者常见的症状，严重影 响其生活质量。研究者们在过去的几十年里对SCI 后的神经修复展开了大量研究，包括药物治疗，手术 治疗，干细胞移植治疗等，但这些方法的治疗效果并 不令人满意，而且当前针对SCI 局部缺血缺氧、兴奋 性氨基酸毒性、炎症反应的临床药物试验均被证明 无效[9]，因此为SCI 的治疗寻找新的有效的策略是一 个长期的医学探索问题。在本研究中，我们首次证 明利用光遗传学技术靶向激活M l 区谷氨酸能神经 元能显著促进SCI 大鼠损伤脊髓组织的恢复，进而
改善其运动功能。
重复经 M 磁刺激（repetitive transcranial mag
netic stimulation ， rTMS ) 和电 刺激是 一种公 认的促进运动功能恢复的康复方式。有研究已经证实rT -
MS 可以用于神经损伤患者的偏瘫、痉挛、吞咽困难 等症状的治疗['电刺激如经颅直流电刺激也被报 道可以改善训练效果，提高运动功能，能够安全地调 节大脑的兴奋性和功能可塑性111]。此外，有报道称
rTMS 也能促进SCI 后运动功能的恢复112]。更多的 证据表明大脑运动皮层的刺激在SCI 后神经再生和 运动功能恢复中起到重要作用，如Bonizzato 等™证
明了与连续的脊髓刺激相比，大脑刺激加速和增强
了 SCI 后运动的长期恢复；231^11等_证明了慢性
<
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图3 SCI 后1 一8周每周各组斜坡实验结果
评分明显高于其他2组，差异具有显著性意义(P <
0.01)。其中，在第4周时，光刺激组的B B B 评分较
其他2组差异最大(P <〇.〇〇 1)。SCI 组和假刺激组在 各时间点B B B 评分均无明显差异(P >0.05)。以上 结果说明光遗传学刺激SCI 大鼠M l 区谷氨酸能神 经元从2周时可以明显促进大鼠B B B 评分的恢复 (图2)。2.3斜坡实验
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造模后第1周时3组大鼠斜坡度数之间差异无 显著性意义(/^>0.05)。术后从第2周开始，光刺激 组斜坡度数明显高于其他2组，差异具有显著性意 义(P <0.01)。SC I 组和假刺激组在各时间点斜坡度 数均无明显差异(办0.05)。以上结果说明光遗传学 刺激SC I 大鼠M l 区谷氨酸能神经元从2周时可以 明显促进大鼠后肢稳定及抓握功能的恢复(图3)。 2.4 HE 染色
研究发现光刺激组的脊髓修复形态明显好于其 他两组：脊髓空洞面积较小，灰质与白质边界清晰，
图1
免疫组化检测病毒表达情况
SCI 大鼠双侧M l 区注射示意图（图A)
免疫组化检测病毒表达的细胞选择性鉴定，可见ChR2-mCheny 能 特异性表达在谷氨酸能神经元上(图B h
5
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Chine Journal of Rehabilitation Mediciru \ May 2021. Vol . 36. N 〇.5
图4 S C I 后4周脊髓损伤节段组织切片(HE 染色，><4)
单纯SCI 组假刺激组光刺激组
运动皮层电刺激可以重新激活轴突生长和突触形成 过程中不同的信号通路，从而使因SCI 或脑卒中而 导致的皮质脊髓束受损后的轴突发芽，最终促进功 能恢复。以上研究说明，现有的磁刺激或者电刺激 调控大脑皮层兴奋性可以促进脊髓损伤的功能恢 复。但由于大脑皮层存在各种类型的神经元，尤其 是M l 区作为常用刺激靶点，包含着谷氨酸能神经 元和GABA 能神经元，到底是何种神经元的兴奋性 增强在s c r 陕复中起着重要作用，一直以来缺少相 关的研究。
近几年，本课题组通过功能磁共振技术对SCI 后的大脑结构和功能重塑进行了系列研究。我们发 现SCI 患者早期即存在着脑结构和功能重塑'并且 通过随访研究，发现SCI 后大脑M 1区自发神经活动 越高，患者6个月后的运动功能恢复就越好'结合 前期有动物研究表明SCI 后大脑M l 区神经兴奋性 增高是促进后期功能恢复的主要原因[151，我们认为 激活SC 丨大鼠的大脑M l 区运动神经元可能是促进
SCI 后功能恢复的新策略，已知在M l 区既存在兴 奋性神经元(谷氨酸能神经元），同时存在抑制性神 经元(GABA 能神经元）。以往有研究表明GABA 受体激动剂（绳蕈醇)激活M 1区抑制性神经元，可 降低M l 区神经活性，进而导致脊髓损伤猕猴运动 功能恢复受阻[16]。这和我们研究的结果基本吻合： 本研究中观察到精确激活M l 区谷氨酸能神经元可 以明显促进SCI 后运动功能的恢复。以往的磁刺激 和电刺激虽然都能一定程度上改善患者的功能障 碍，但是效果都不理想，其原因可能是它们的
刺激范 围不明确，不仅激活了 M 1区的兴奋性神经元，同时 也可能激活了 M l 区的抑制性神经元，导致M l 区兴
奋程度受到两种神经元激活程度的叠加影响而减 弱。
近年来，光遗传学技术因其能精确调控某一类 型的神经元而成为研究特定神经元类型的有力工 具。如1〇!等[17]通过光遗传学技术确定了几个对脑 卒中后运动功能康复有效的脑区和神经回路。Shah 等1181研究表明，使用光遗传学方法选择性地刺激小 脑外侧核的神经元，即使在缺血性脑卒中小鼠停止 刺激2周后，也能带来强劲而持久的恢复。这些结 果也证实了光遗传学技术在精准控制人脑与功能恢 复之间起到巨大作用3有学者利用光遗传学技术精 确激活正常大鼠M i 区的谷氨酸能神经元，观察到 光刺激时能够诱发大鼠的不自主运动"91。这与我们 的实验一致：我们使用光遗传学技术可以精准地刺
激M l 区谷氨酸能神经元。我们的研究发现M l 区 谷氨酸能神经元的精确激活在SCI 后功能恢复中起 到巨大作用，未来精确激活M l 的谷氨酸能神经元 可能是SCI 新的治疗方向。了解脑区、细胞类型和 驱动功能恢复的机制可能有助于开发用于SCI 治疗 的精确的脑刺激技术，并为s c r 冶疗确定潜在的药 物靶点。
本研究存在的主要不足为：本研究用HE 染色 显示脊髓组织的恢复情况的确过于简单、单薄；虽然 我
们已经观察到光遗传学技术精准刺激M 1区谷氨 酸能神经元可以促进SCI 后功能恢复，但其机制尚 不清楚。以往有研究表明脑刺激能促使一些神经营 养因子的表达，如Cheng 等—研究表明光遗传学促 进脑卒中后运动功能恢复是由于重复神经元刺激的 脑卒中小鼠脑源性神经营养因子、神经生长因子、神 经营养因子3等活性依赖性神经营养因子在大脑皮
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