National Medical Frontiers of China, May.2011, Vol.6 No.10中国医疗前沿 2011年5月 第6卷 第10期
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基础研究
十户联防N-甲基-D-天冬氨酸受体是一种神经系统内重要的谷氨酸门控离子通道，其参与多种中枢神经系统的信息传递功能活动。NMDA 受体由三种亚基构成，其中，NMDA 受体的必需亚基NR1，能够通过其自身的磷酸化作用易化突触传递，并参与痛觉过敏和异常性疼痛的发生[1]。
内源性的肿瘤坏死因子a(TNF-α)是一种重要的致炎因子，它不仅作为机体免疫系统的重要因子参与免疫反应，还可以在病理情况下由外周或中枢神经系统所产生[2,3]。越来越多的研究表
明，TNF-α不但可以提高神经元的兴奋性[4,5]，
还在慢性痛的发生中起着重要的作用。但是，TNF-α参与慢性疼痛的机制目前还不清楚。
近年来有研究发现，在大鼠炎性痛模型中，可观察到脊髓节
段中TNF-α释放增多[6]
。
当鞘内直接给予TNF-α时亦可增强大鼠脊髓背角广动力范围神经元对刺激的反应性[7]；而且，可溶性的TNF-α受体抗体可以有效地抑制大鼠机械性的异常性疼痛[8]，但是有关TNF-α易化疼痛的具体机制还不清楚。最近有研究发现，在延髓头端腹侧区(RVM)，TNF-α受体TNFR1与NR1亚基共表达于同一神经元，上调p-NR1的表达可易化延髓水平的痛信号传递。因此，我们设想TNF-α通过上调脊髓背角NR1的磷酸化，易化了痛信号的传入，增强了突触传递的可塑性，从而导致慢性疼痛的产生和发展。1 材料和方法
1.1 实验动物及主要试剂 健康成年雄性Sprague-Dawley 大鼠250-350g，购自山西医科大学实验动物中心。TNF-α抑制剂anti-r TNF-α购自R&D System 公司，p-NR1抗体购自
TNF-α在脊髓背角参与慢性疼痛机制的研究
高峰 赵欣 史瑞红 杨小荣
【摘要】 目的 外周伤害性信息传入时，神经胶质细胞会释放以TNF-α为代表的一些致炎因子，并在慢性疼痛的发生、发展过程中起到重要的作用。NR1是构成NMDA 受体的一个重要亚基，一般认为NR1磷酸化(p-NR1)表达上调是突触传递发生可塑性变化的基础。在脊髓TNF-α是否通过上调p-NR1的表达导致慢性疼痛的发生和维持目前还不十分清楚。本研究的目的是观察TNF-α释放与大鼠热痛反应
以及脊髓背角p-NR1表达间的关系。方法 应用PWL 检测对大鼠热痛反应变化进行检测，应用Western Blot 方法对大鼠腰膨大处脊髓背角的p-NR1表达情况进行检测。结果 脚掌注射CFA 诱导的炎性痛可以上调脊髓背角p-NR1的表达，缩短热痛反应潜伏期，而鞘内给予TNF-α抗体anti-r TNF-α可以缓解痛觉过敏并下调脊髓背角p-NR1的表达。结论 炎性痛时，脊髓中的TNF-α通过上调背角p-NR1的表达，介导了慢性疼痛的发生和发展。【关键词】 TNF-α；p-NR1；慢性疼痛；脊髓背角doi:10.3969/j.issn.1673-5552.2011.10.0007 【中图分类号】R338
【文献标识码】A
【文章编号】1673-5552(2011)10-0015-02
Millipore 公司。
1.2 实验设计 实验中将大鼠随机分为以下四组：Saline+ Vehicle，Saline+anti-r TNF-α，CFA+Vehicle 和CFA+anti-r TNF-α。以左侧脚掌皮下注射Saline/CFA 为时间原点(第0天)，每组大鼠分别在脚掌注射前24h，1h 和脚掌注射后的23h，将PBS(0.01M，pH7.4，5ml)/anti-r TNF-α[50fmol，5ml(L)或70fmol，5ml(H)]分别鞘内给药于腰膨大处。各组均在脚掌注射后的2h 和24h 进行PWL(缩足反射潜伏期)热痛行为观察，并在最后一次热痛行为检测之后立即处死动物并分别取左侧和右侧的脊髓背角进行p-NR1表达的Western Blot 检测。
1.3 CFA 诱导的大鼠外周炎性痛模型的建立 将CFA(sigma
公司)按11的比例与生理盐水混匀为悬浊液，洋葱炒黄瓜
将该悬浊液皮下注入大鼠左后肢足底(0.08ml，40mg Mycobacterium tuberculosis，sc)。
1.4 鞘内给药 依Yaksh 等述及的方法[9]进行手术。首先用1%的戊巴比妥钠(50mg/kg，i.p)腹腔注射麻醉动物。然后手术分离动物颈背侧皮肤、肌肉，破坏寰枕膜。再将充满生理盐水的PE-10管(约7cm)沿椎管内侧从枕骨大孔下方插入至脊髓腰膨大并缝合伤口。手术后5-8d 对大鼠神经功能情况进行监测，有神经损伤及严重体重丧失的大鼠被剔除。
1.5 痛行为观察 依Blundell 等述及的方法[10]，将实验大鼠置于恒温52℃的热盘(IITC Model 39 Hot Plate)上开始计时，至其舔或者抬左后肢的时间被记录作为PWL 值。若超过30s 没有出现痛行为反应，将其移出，并记录时间为30s。不同大鼠进行检测时，保证热盘的清洁，并确定温度恒定。每只大鼠进行三次检测，并间隔10min 进行，取三次的平均值作为PWL 时间。
1.6 Western Blot 法测定p-NR1表达 利用SDS-PAGE 电泳技术对提取组织匀浆中的蛋白进行电泳分离，再转移至硝酸纤
校园事故
作者单位：030001 太原，山西医科大学生理学系作者简介：高峰(1984-)，男，硕士学历。Email：ty满足英文
我爱罗和谁结婚了 【Abstract】Objective Following the input of peripheral nociceptive information, some proinflammatory cytokines from microglia, such as TNF-α, are relead, and further produce and maintain the chronic pain. Generally, NR1 is a necessary subunit of NMDA receptor, and the increasing p-NR1(phosphorylation of NR1) can upregulate the plasticity of synaptic transmission. However, it is not yet clear if the increasing TNF-α mediates the chronic pain by upregulating p-NR1 expression in spinal dorsal horn. Therefore, the prent study was undertaken to determine whether TNF-α could increa the phosphoralation of NR-1 in spinal cord, thereby chronic pain developed in rats. Methods PWL testing was implemented to obrve the thermal respon of rats, meanwhile the p-NR1 expression in spinal dorsal horn was measured by Western Blot testing. Results Tthe p-NR1 expression in spinal dorsal horn was upregulated and PWL(paw withdrawal laterncy) decread in the CFA-injected rats, which both were reverd by TNF-α antagonist anti-r TNF-α. Conclusion All the results revealed that TNF-α produced and maintained the chronic pain by upregulating spinal p-NR1 expression in rats.
【Keywords】TNF-α; p-NR1; Chronic pain; Spinal dorsal horn
(下转P6)
维素膜上，用免疫印迹技术检测脊髓背角组织中p-NR1的含量，并以相同样本中b-actin 的蛋白表达量作为内参。
1.7 统计方法 对所有实验数据采用多因素重复测量方差分析，痛行为结果以P <0.05，Western Blot 结果以P <0.01为有显著性差异。2 结果
2.1 脚掌注射CFA 后进行热痛行为观察 结果显示，PWL 由Baline 的10.85±0.94s 减少至第2h 的4.74±0.30s(P <0.05)和第24h 的4.59±0.33s(P <0.05)；而在鞘内给予抑制剂anti-r TNF-α后，脚掌注射CFA 减少的PWL 明显恢复至第2h 的8.37±0.36s(P <0.05)和第24h 的9.04±0.37s(P <0.05)，接近于正常(图1)。Western Blot 检测结果显示，脚掌皮下注射CFA 后引起脊髓背角p-NR1表达增高；在鞘内预先给予anti-r TNF-α后，p-NR1的表达显著减少(P <0.01)。此外，脚掌注射CFA 动物的左右两侧脊髓背角p-NR1的表达水平无明显差异(图2)。
3 讨论
在我们的实验中观察到，热痛反应的PWL 时程在脚掌皮下
注射CFA 后的第2h 和第24h 均有显著的下降。这表明，痛觉过敏和异常性疼痛可以在CFA 外周皮下注射后出现，并持续一段
时间。有研究报道，维持时间至少可达10d [11,12]
。我们的实验想要探究炎性痛过程中痛觉过敏和TNF-α，以及p-NR1和TNF-α之间的相互联系。CFA 诱导的痛觉过敏和异常性疼痛，可以通过鞘内给予TNF-α抑制剂anti-r TNF-α特异性地结合TNF-α，阻
断TNF-α受体TNFR 的激活。这些结果表明，CFA 注射引起的
TNF-α上调可以通过作用于TNFR 产生慢性疼痛。
应用免疫组织化学方法发现，NMDA受体的NR1亚基和TNFR可以共表达于相同的神经元，这一结果提示NR1和TNFR 可能存在一定的功能性联系。因此，在对痛行为进行观察之后，我们又对CFA诱导的大鼠痛觉过敏模型中，CFA注入第24h后的脊髓p-NR1表达情况进行了Western Blot检测，结果显示，脊髓背角p-NR1的表达明显增多，而抑制剂anti-r TNF-α可反转TNF-α增加所致的p-NR1表达上调。已有的研究认为，NMDA 受体NR1亚基磷酸化水平的改变是突触传递发生可塑性变化的基础，那么，脚掌注射CFA诱导的脊髓TNF-α和P-NR1表达上调，则是是炎性疼痛导致慢性疼痛发生、发展的基础。
在实验中我们还发现，虽然我们对左/右两侧的脊髓腰膨大节段分别进行了p-NR1表达情况的检测，但是我们发现，相较CFA 注射的左侧脊髓，右侧的p-NR1表达情况和左侧没有明显的差异，这提示我们，来自受损侧脊髓中的TNF-α可能可以扩散至临近脊髓的未损伤部位，进而参与了未损伤侧痛觉过敏和异常性疼痛的发生。
TNFR 主要包括TNFR1和TNFR2两个亚型。有资料认为是TNFR1而非TNFR2参与调节痛觉过敏和异常性疼痛[13,14]。但是，也有报道认为，TNFR2通过不同于TNFR1的作用机制参与了慢性疼痛的发生
和发展[15]。这些观点还有待进一步的研究证实。
总之，基于以上的研究，我们认为：外周的伤害性信息传入可以增加脊髓背角TNF-α的释放，并通过激活TNFR 上调NR1亚基的磷酸化，从而引起了机体慢性疼痛的发生和发展。参考文献
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图1 CFA 诱导的痛觉过敏大鼠PWL 值(n =6)。CFA+Vehicle vs
Saline+Vehicle，*
P <0.05；
CFA+anti-r TNF-α vs CFA+Vehicle，#
P <0.05 Saline+vehicle CFA+vehicle saline+anti- CFA+anti-
r TNF-α
苏小小简介
r TNF-α
图2 Western Blot 检测脊髓背角p-NR1的表达
3 讨论
系统性红斑狼疮是一种慢性自身免疫性疾病，该病反复发作，并累及多个器官，如皮肤、肾脏、心脏和中枢神经系统等。其发病机理与遗传、环境等多种因素相互作用引起的T、B细胞的过度反应和异常细胞因子、多种自身抗体的产生有关。SLE发病机理尚未阐明，但有研究发现SLE患者体内淋巴细胞功能异常是介导免疫调节紊乱的主要因素。
Pyk2是粘着斑激酶(focal adhesion kina,FAK)家族的成员之一，与FAK具有高度同源性，参与细胞和基质成分介导的信号转导。Pyk2在造血细胞包括T、B细胞等都有表达。本文研究发现Pyk2在SLE患者PBMC中有表达且水平升高，说明Pyk2对维持免疫细胞的形态和功能有重要作用。Pyk2可以被细胞外基质在内的多种信号激活，而活化后的Pyk2作为细胞内信号转导途径的上游调节分子，通过调节细胞内多条信号转导途径参与免疫细胞迁移和形态维持、调节淋巴细胞的活化和增殖。Pyk2可以与多
种细胞骨架结合蛋白结合并调节其功能，主要是微丝的调节，从而维持细胞形态和迁移[1]。些外，CD4+T细胞表面存在Ephrin-Al的受体EphA4，二者的结合通过活化胞质中的Pyk2，诱导T细胞产生趋化性，发生跨内皮迁移[5]。可见Pyk2的过度表达导致免疫细胞过度反应，在触发因素的作用下，致使机体异常免疫，从而引起疾病的发生。
Pyk2在T、B细胞的活化过程中起着重要作用，而T、B细胞的过度反应可引起SLE的发生，且与SLE活动度有一定的关系，本研究发现Pyk2的表达水平在SLE活动期明显增加，证实了这点。Pyk2受体介导的肌动蛋白骨架重排为T细胞活化及其功能所必需[2]，而TCR活化也可引起Pyk2的磷酸化及诱导其催化活性[3]。另外，当T细胞特异性地识别APC后，Pyk2可快速地易位到T细胞和APC的接触区，从而引起T细胞的活化[4]。而T细胞的异常活化可引起细胞因子分泌的异常，这主要体现在IL-6、IL-10分泌增加，继而引起自身反应性T细胞的大量产生，B细胞的异常活化，导致免疫调节紊乱。Pyk2的活化为CD8+的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)与纤维蛋白的粘着所必需[7]，而且在CTL 介导的定向杀伤作用中起到重要作用[8]，另外Pyk2的表达增高还可导致CD8+T细胞异常活化，引起CD4+T/CD8+T细胞比例倒置[6]。此外，Pyk2可引起Th2细胞功能亢进，导致Th1、Th2细胞功能偏移，从而诱导B细胞的异常增生，产生大量自身抗体，促进细胞毒性T细胞活化等一系列免疫效应性病理损伤[9]。
综上所述，SLE患者PBMC中Pyk2的表达上调，并且随着SLE活动度的增加而增加，提示Pyk2可能在SLE的发生发展过程中起到重要作用，这对于研究以降低自身抗体为靶目标的新的治疗措施、增加当期末总结100字
前治疗措施的敏感性是非常重要的。
参考文献
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(收稿日期：2011-04-23)
(本文编辑：夏凯艳)
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(收稿日期：2011-04-20)
(本文编辑：夏凯艳)
(上接P16)
