环扎法致大鼠脊髓损伤减压后TGF-p i表达与凋亡细胞的相关性
聂虎1*，周乾坤3牛国旗3杨民2，徐祝军25蚌埠医学院第二附属医院骨科，蚌埠733900；7皖南医学院弋矶山医院骨科；通讯作者,)
摘要：目的研究大鼠脊髓损伤不同时间点减压后脊髓损伤段标本TGF-P1的表达和凋亡细胞的变化，以及不同时间点减压后大鼠神经功能恢复情况。方法70只SD雄性大鼠随机分成5组，麻醉后手术切除胸椎14-11椎板，暴露脊髓。假手术组5只，行胸椎10-11椎板切除，仅暴露脊髓，不环扎。其余4组作为手术组，每组3只，暴露脊髓后，用环扎法使硬膜囊截面压缩至原截面积的70%，建立截瘫模型、完成此次建模手术，减压组术后分别在环扎8,24,72h后进行二次手术，去除环扎线减压，命名为8h减压组、20h减压组和72h减压组；不减压组，环扎后不进行二次手术减压。假手术组和不减压组只进行一次手术，在术后1,3,7,5,21O统计神经功能评分并处死大鼠取出脊髓。8h减压组、24h减压组和77h减压组二次手术后1,3,7,5,21O统计神经功能评分并处死大鼠，取出脊髓。各组脊髓标本切片行HE染色观察脊髓组织病理变化，免疫组化测定各时间点TGF-P1的表达,TUNEL法计数凋亡细胞，功能评分数据分析神经功能恢复情况。结果假手术组大鼠标本各取材时间点的实验切片均未见明显异常。与假手术组相比，手术组TGF-P1阳性细胞数及神经细胞凋亡细胞数于术后1O 均有增加，术后3O达高峰，在术后7O表达逐渐减弱，至术后71O仍有表达(P<0.25)o72h减压组及不减压组两组大鼠TGF-P1阳性细胞数及凋亡细胞数普遍高于早期减压的8h减压组及24h减压组，差异有统计学意义(P<0.25)o结论
脊髓损伤后TGF-P1的表达增加，可能对凋亡有阻断作用，可减轻脊髓损伤的范围。环扎法制作脊髓损伤动物模型是一种理想的造模方法，早期减压对减轻脊髓的损害及促进神经功能的恢复有一定的意义。
关键词：脊髓损伤；环扎法；TGF-P1；凋亡
中图分类号：R373文献标志码：A文章编号：597-6611(2901)94-9469-97DOI：19.13753/(.imu.597-6611.2901.94.915
Correlation betwees TGF-pi expression and apoptotic celis aftec decrmpression in soinai(01x1injury rott induces by cerclaae NIE Ho1*,ZHOU Qianduo1,NIO Goopi1,YANG Min7,XU Zhujun7(Department of Orthopaedics,Secont^filiated Hospital of Bengbu Medico,Cofepe,Bengbu233000,China；2D epartment op Orthopaedios,YijisPat Hospital of Wanton Medical Colle p c；*Corrc-spootinn o£hor,E-mOt：_Z5_Z8_)
Abstroct:Objective To investigate the expression of TGF-pl and the apopmtic cells in spinal cord injuy speciwecs at diRerect hmo points after decompression in rats and the recovey of neqroloaicoi function at diRerect time points after decompression.Methofs Sevecty male SD rats were randomly divided into5yeups,and all rats were peSormed surpicai rection of thoracic UmWa10-11af-tor anes
thesio to expo the spinal cord.Tec rats in sham operahon yeup underuect thorocio Uminectomy10-11,and only the spinal cord was expod without ceempe.In the othos four yeups(n=15in each yeup-,the ction of the durol sac was compresd to77% of the oTyWal cess-ctWnol area with the cercmpo methoP after the spinal cord was expod,and thec the paraoleaio moPol was estad-/shed.The cond opera/on was peSormed to remove the ring binding/no according to the cercmpo Uwe after surgey,named os8h decompression yeup,24h decompression yroup,72h decompression yeup,and non-Pecompession yeup.In non-Peompession yeup,only unp bindiny was peSormed but no cond opera/on decompression.In sham operahon yeup and non-Peompession yeup, the neqroloaicai function scores were eorded at days1,3,7,14,71after the first operahon,and then the rats were sacdfiod to oi-leot the spinal cord.In8h decompression yeup,24h decompression yroup and72h decompression yeup,the neqroloaicai function scores were eorded at days1,3,7,14,71after the cond opera/on,and then the rats were sacdfiod to coTeet the spinal cord. The patholoaicol changes of spinal cord tissue were oUeed by HE staining,the expression of TGF-pl was measured by immunohisto-chemisty at each Uwe point-apoptosis cells were counteU by TUNEL methoP,and neqroloaicoi function recevey was analyzed by func-honoi score data.Resulis In sham opera/on yeup,no ohvious aPnorma/ty was found in the expedmectoi ctions at each hmo point.Compared with sham operation pyup,the numbers of TGF-pl positive cells and neqronoi apopWtic cells in four opera/on yeups
基金项目：安徽省重点研究和开发计划项目(1804h08020247)
作者简介：聂虎，男,586-08生，硕士，主治医师,E-mail：S5*******@qq.om
收稿日期：2020-08-09
were both incread at day1Pter opera/on,and reached the pead at day3Pter opera/on,but they were still high at day71Pter opera/on(P<2.25、.The numbers of TGF-pl positive cells and agop/tic cells is77h decompression group and non-Secompress/n group were sig/fica//higher thaw tho is8h decompression gmup and24h decompression amxp(P<2.25、.Conclusion The expression of TGF-pl increas Pter spinal cord injup,which may block apop/sis and reduce the ex/xt of spinal cord injup.The a/mai model of spinal cord injup made by cemhge is an ideal method,and the early decompression is of cer/io sig/ficance to reduce the damage of spinal cord and promote the recovep of nerve function.
Key words：spinal cord injup；cerchge；TGF-pl；apop/sis
海南高考总分在美国，每年有超过17000人遭受脊髓损伤(spWai cord Wjup,SCI)，该疾病会导致损伤平面以下的突然运动、感觉及自主神经损伤，如何有效地促进SCI患者神经功能的恢复是当前基础及临床研究的热
点［］。既往观点认为，神经细胞不可再生，但是现有动物实验研究表明：在脊髓损伤早期对脊柱创伤行手术固定、脊髓减压等消除脊柱不稳定和椎管狭窄等因素，再在此基础上行适当的药物治疗、细胞移植、基因治疗、调节信号转导通路等有希望进一步促进自主神经功能的修复和神经细胞的再生一9o 国外学者回顾性研究发现［3°］，转化生长因子-pl(transfokning growth factor-pl,TGF-pl)在正常脊髓组织中几乎无明显表达，但在SCI后表达显著增高，因其具有免疫抑制和炎症抑制的作用，可抑制细胞凋亡进展，以减轻神经损伤的范围，可见脊髓损伤后该因子增加是神经元的一种自我保护反应。
本研究拟建立一种可形成持续静态压迫的大鼠脊髓损伤模型，通过不同时间点的脊髓减压治疗，来观察脊髓损伤的变化以及神经功能恢复进展情况，进一步研究TGF-pl的表达与凋亡细胞阳性细胞数的相关性，为SCI的修复研究提供实验依据。
l材料与方法
1.1实验动物与分组
77只雄性SD(Suraaue-Daxlev)大鼠，平均13周龄，体质量169-261g，平均体质量221.2a。采用随机数字表法分组，分为假手术组16只，仅行胸椎(thoracic vakedra,T)10-11椎板切除，暴露脊髓，不进行环扎。手术组每组各6只，大鼠胸16-11椎板切除后，环扎脊髓，用环扎法使硬膜囊截面压缩至原截面积的70%，建立脊髓损伤模型，完成此次建模手术，术后按照时间设定进行去除环扎线的二次手术分
为8h减压组、24h减压组、72h减压组和不减压组。减压组分别环扎8,24,72h后二次手术，去除环扎线减压；不减压组环扎后不进行二次手术减压。假手术组和不减压组只进行一次手术，在术后1,3,7,14,21d统计神经功能评分并处死大鼠取出脊髓。8h减压组、24h减压组和77h减压组进行二次手术后后1,3,7,14,21d统计神经功能评分并处死大鼠，取出脊髓。假手术组各时间段取材2只大鼠，余各手术组各时间段取材5只大鼠，取损伤段脊髓标本切片进行HE染色，免疫组化(IHC)及TUNE-法检测，观察脊髓损伤后组织病理学变化，测定脊髓标本损伤段凋亡细胞的计数及TGF-pl的表达变化。
1.5脊髓损伤模型制备
本实验采用环扎法建立脊髓损伤模型，在以往模型建立基础之上进行改进，该模型特点为对脊髓组织持续静态压迫4］o大鼠称重，麻醉剂按照37-40mg/kg标准，经大鼠腹腔内给药麻醉，取大鼠末端第13对肋骨，移动式C臂机定位大鼠T16-T11水平，剥离椎旁肌肉，以显微蚊式血管钳咬除T10-1椎板及关节突，暴露硬脊膜囊，以微型小圆针带双股5/0白色可吸收线，反转后，以针鼻端从硬膜囊腹侧与椎体后缘间隙穿出后去针。一股线作为测量线，另一股为环扎线。在2.5倍显微镜下，以测量线环绕脊髓，以不影响大鼠脊髓背侧血管充盈为度。结扎可靠后剪断取出，用精确度0.51mm数显游标卡尺测出硬膜囊周长(C1)，经代数运算(C2=C1*槡〒)获得压缩至原截面积77%的周长(C2)。另一股环扎线以黑色油性标记笔标记出C2长度后在原测量平面环扎至标记点重合，使得脊髓截面压缩至原截面积77%。充分清洗创面、消毒、缝合。减压过程则在原手术切口的基础上再次暴露脊髓，取出环扎线，然后逐层
缝合。SCI模型制作成功的标志为大鼠双下肢突然抖动、抽搐后瘫痪。
1.3大鼠急性脊髓损伤后的护理
大鼠脊髓急性损伤后常导致截瘫，除假手术组心灵的鸡汤
外均表现为双下肢瘫痪，小便潴留，大便不能控制, 大鼠护理期间注意室温调节，保持13-24 C ，注意通 风，勤换水、换垫料，保持鼠笼干燥。术后注意预防感
染，术后每日定时人工按摩膀胱排尿，每日温肥皂水
清洗双侧下肢及尾巴并保持干燥，防止肢体溃疡。大
鼠取脊髓标本前行双盲法对每组大鼠进行神经功能
评价，评价指标采用BBB 评分（Basso , Beattie , Bresna- hax locomotor rating scale ）和斜板评分联合使用⑻。
1.4标本制作及图像分析
对大鼠评估神经功能评分后，予乙醚吸入麻醉,
经胸骨远端左缘快速开胸进入，小型静脉留置针准 确插入左心室内，生理盐水灌注后迅速用4%甲醛
充分灌注,34 mix 后暴露损伤脊髓上下段，取环扎处
上下段共1.5 cm 脊髓组织，置入4%甲醛中72 h , 流水冲洗后进行梯度酒精脱水，浸蜡包埋，标签标 记，冠状位切片，采用HE 染色观察脊髓组织病理变 化，免疫组化测定各时间点TGF-21的表达,TUNEL 法检测凋亡细胞水平。每张切片取光镜下3个视野
400倍进行观察，采用JEDA 801D 形态学图像分析
系统进行图像统计采集分析。
1.4
统计方法
对每组切片及实验数据采用SPSS23. 4软件进
行统计分析。各组数据采用％ 士）表示，BBB 评分、
斜板评分、TGFF1及凋亡细胞数各组间比较采用方 差分析,TGF-41与凋亡细胞数的关系采用直线相关
分析，以PV0.05为差异有统计学意义。2结果
2. 5 脊髓标本大体组织学变化
标本组织总体可见脊髓组织结构紊乱，部分可
见脊髓空洞坏死及陈旧性出血表现。
2.4 HE 染色观察
通过HE 染色脊髓标本可发现假手术组脊髓组
织、细胞形态保持完好（见图1A ）；减压组可见损伤
范围基本恒定，脊髓组织回缩变细、结构紊乱，出血、
髓鞘水肿、断裂，部分可见脊髓空洞坏死（见图1B - D ）o 不减压组主要表现为空洞性坏死改变以及陈
旧性出血表现（见图1E ）。
•A.假手术组
B.8 h 减压组
C.24 h 减压组 E.不减压组
D.72 h 减压组图1各组3 C 脊髓取材标本HE 染色镜下表现(HE , X 400、
Figure 1 HE staining of spi/cl corU samples ci Ccy 3 in each gEup ( HE , X400)
2.5 TGF-21的表达每张切片取400倍光镜下3个视野进行观察, 以细胞浆和/或核棕黄色着色为阳性细胞。假手术
组未见TGF-41的阳性表达（见图2）；8 h 减压组、
24 h 减压组、72 h 减压组及不减压组1 d 取材标本
TGF-41开始表达,3 d 时达到高峰,7 d 时逐渐下
冰心春水降，至21 d 仍有表达（见图2，表1），且8 h 减压组、
24 h 减压组和72 h 减压组TGF-41在21 d 的表达
普遍低于不减压组（见表（）o
A.假手术组
B.8h 减压组
C.24h 减压组
D.72h 减压组
E.不减压组
图2各组3 C 取材标本免疫组化镜下表现(IHC,x 400)
Figure 2 Immuxodistochemiccl staining of tie samples ci Ccy 3 h in each group ( (HC , X
440)
表l各组不同时间点脊髓标本TGF-p l阳性细胞数比较
Table l Changes of TGF-p l e xpression in spinal cord ai diOerevy time points
分组1）3.7.14V21V 8h减压组11.57±011*#23.33±1.53*#16.57±053*#15.83±011*#10.57±053*# 24X减压组15.83±011*#24.00±040*#20.33±2.31*#11.57±2.52*#10.00±2.00*# 72X减压组28.57±3.41*3057±3.51*25.83±2.08* 1.57±2.08*16.33±053*不减压组20.67±05389.33±4.0434.57±2.313057±3.792033±3.41与不减压组比较，护<0.05；与72h减压组比较,#P<0.05
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2.5细胞凋亡的变化
每张切片取402倍光镜下3个视野进行观察，凋亡细胞呈棕褐色和棕黄色，胞核固缩颗粒深染不规则，于损伤区域及周围弥散性分布，假手术组基本无表达，各手术组3d取材标本凋亡细胞数明显增多（见图3）o8。减压组、24h减压组、72h减压组及不减压组1d取材标本均有不同程度的表达,3d 达到高峰，后逐渐下降,21d仍有表达（见表2）o72h 减压组各时间点凋亡细胞计数均显著高于8h减压组、24h减压组，而8h减压组、24h减压组、72h减压组凋亡细胞计数又远低于不减压组（见表2）o
A.假手术组
B.8h减压组
C.24h减压组
D.72h减压组
E.不减压组
图3各组3V取材标本TUNEL染色(TUNEL,x400、
Figure3TUNEL staining of spinet cork kssnes ct Vcy3is each gmup(TUNEL,x440)
表2各组时间点切片凋亡细胞的计数统计
Table2Counts of apoptotic cells in spinal cord at diderent time points
分组1V3V7V14V21V 8h减压组16.33±2.08*#2033±2.52*#16.57±053*#1033±053*# 6.57±1.53 24X减压组16.00±040*#2057±2.08*#16.40±1.00*#1033±053*# 6.33±053 72X减压组27.67±3.51*29.33±2.52*2057±2.81*15.33±2.52*9.57±011不减压组2067±2.0835.67±4.0430.33±2.5224.33±2.5210.57±2.52与不减压组比较，护<0.05；与72h减压组比较,#P<0.05
2.5TGF-pl的表达与凋亡细胞计数的相关性分析
收集TGF-pl及凋亡细胞计数的统计数据，采用线性相关分析。各减压组TGF-pl及凋亡细胞计数相关分析显示：相关系数c二2.915-2.953，双侧 Pearson检验P二2.210-2.229，在2.25水平（双侧）显著相关，有统计学意义（见图4）。可见,TGF-pl计数与凋亡细胞计数呈线性相关。电信诈骗心得
2.6各组大鼠术后神经功能BBB评分及斜板评分
孕妇咽喉痛怎么办假手术组BBB及斜板评分大致接近正常，近似呈水平线。8h减压组和24h减压组BBB及斜板评分自术后1d呈逐渐上升趋势，两者评分基本相似，无明显差异;72h减压组各时间点BBB及斜板评分均较8h减压组、24h减压组组低。不减压组评分最低，且恢复趋势不明显，神经功能恢复差（见图5,6）。各组BBB及斜板评分组间行统计学分析，8h减压组与24h减压组组间比较无统计学差异，其余各组两两比较均差异有统计学意义（P< 2.25）O BBB及斜板评分8h减压组、24h减压组>72h减压组>不减压组，可见减压后大鼠功能评分随着时间的推移,BBB及斜板评分呈逐渐上升的趋势，且评分优于不减压组大鼠功能评分。
A.8 h 减压组
B.24 h 减压组
C.72 h 减压组
D.不减压组
图4各组TGF-pl 阳性细胞数及凋亡细胞计数的线性相关图
Figure 4 Linear corelation (P TGF-pl positive celts with apoptotic celt counts in eac/ pynp 25 i
■假手术组■ 8 h 减压组I 24 h 减压组■ 72 h 减压组■不减压组
a a
20
15
10
I l
k tt Hi Ik 1 lilt It
3d 7d 14 d 21 d
5
1 d 与假手术组比较,O P<0.05；与5 h 减压组比较,b P<0.05；与24 h 减压组相比,e P<0.05；与7
冰激凌机器>粮食局2 h 减压组相比,O P<0.05
图5各组不同时间点BBB 评分
Figure 5 BBB score at diRerect time points in each yeup
与假手术组比较,o P<0.65；与5 h 减压组比较,o P<0.65；与24 h 减压组相比,c P<4.05；与72 h 减压组相比,O P<0.05
图6各组不同时间点斜板评分
Figure 6 IxcOneC boarh score at diRerect Uwe points in each
yeup
