中国农业大学学报2021，26(5):83-91 Journal of China Agricultural University
http：//zgnydxxb. ijournals. cn D()I：10. 11841/j. issn. 1007-4333.2021.05.09
非复制型弓形虫的构建及其对小鼠致病性分析
任超K2王超越1刘贤勇1索勋^
(1.中国农业大学动物医学院.北京100193;
2.天津农学院动物科学与动物医学学院/天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津300384)
摘要为研究非复制型弓形虫对小鼠的致病性.利用C R I S P R-C a s9技术构建非复制型屎嘧啶营养缺陷型弓形虫(N R T U A s)，通过药物和荧光筛选阳性虫株.P C R鉴定.并以噬斑试验鉴定N R T U A s株的表型；将N R T U A s株急 性感染小鼠，并以A K U S O株处理为感染对照，P B S处理为空白对照，每曰记录小鼠的死亡情况，并对各组小鼠器官进行病理组织学观察与分析。结果表明：l)N R T U A s株对乙胺嘧啶和氣霉素耐药，重组同源臂上下游P C R鲞定均 为阳性，内源性基因位点缺失P C R鉴定均为阴性；2)N R T U A s株在含有屎嘧啶的培养基中能够生长且产生噬斑，在缺乏尿嘧啶的培养基中不能生长且不产生噬斑；3)N R T U A s感染小鼠后，全部存活，且P B S组小鼠的器官组织学形态一致；A K U80组小鼠全部死亡，且两组小鼠器官出现严重病理变化。综上，衣研究成功构建非复
制型N R T U A.s株，该虫株对小鼠无致死性，且小鼠各器官无病理变化，为N R T U A s作为弓形虫疫苗候选株在家畜养殖中的应用奠定理论基础。
关键词非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫；C R I S P R-C a s9；小鼠；致病性
中图分类号S852. 72 文章编号1007-4333(2021)05-0083-09 文献标志码A
Construction of nonreplicating T o x o p la s m a and
its pathogenicity in mice
REN Chao1.2，WANG Chaoyue1，LIU Xianyong1，SU〇Xun1 •
(1. College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China；
2. Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine,
Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)
Abstract In order to explore the pathogenicity of nonreplicating T o x o p l a s m a in m ice, nonreplic
ating T o x o p l a s m a uracil auxotrophs (NR TU A s) were constructed by CRISPR-Cas9. The positive strains were lected by drugs and fluorescence, and identified by PCR. The phenotype of NRTUAs was identified by plaque assay. Mice were acutely infected with NRTUAs. Mice treated with A KU80 strains were ud as infection control，while mice treated with PBS were utilized as blank control. The death of mice was recorded daily and the organs were analyzed by histopathology.
The results indicated that: 1) NRTUAs were resistant to pyrimidine and chloramphenicol，and the PCR identification of upstream and downstream of the recombinant homologous arm was positive, while the PCR identification of endogenous gene deletion was negative；2) NRTUAs could grow and produce plaques in the medium containing uracil, but could not grow and produce plaques in the medium lacking uracil；3) After NRTUAs infection, all the mice survived, and the histological morphology was the same as the PBS group. All the mice in A K U80group died, and the organs showed rious pathological changes. In summary, NRTUAs strains were successfully constructed in this study，which was not fatal to mice and had no pathological changes in various organs of mice. This study laid a theoretical foundation for the application of NRTUAs as candidate strains of Toxoplasma gondii vaccine in livestock breeding.
Keywords nonreplicating T o x o p l a s m a uracil auxotrophs；CRISPR-Cas9 technology；m ice；p
athogenicity
收稿日期：2020-08-23
基金项目：国家自然科学基金项目（31902277)
第一作者：任超，博士研究生•E-mail:c ha o re n04**************
通讯作者：索勋，教授，主要从事寄生虫遗传学、免疫学和分子生物学研究，E-m ail:SU〇x i m@c a U. edn
84中国农业大学学报2021年第26卷
敲除弓形虫的氨甲酰基憐酸合成酶II (C a r b a m o y l p h o s p h a t e s y n t h e t a s e II，C P S J/)基因，阻断嘧啶从头合成途径.构建c p s l-1虫株，能够激发宿主产生良好的免疫保护力.成为潜在的弓形虫
减毒活疫苗1.但是由于cpsl-1虫株存在嘧啶补救途径，能够在机体内缓慢增殖，虫体的毒力会有返强的机会，临床应用会存在极大的风险。为此.2010年 B z i k研究团队将弓形虫的乳清酸核苷-5 ’-单隣酸脱 竣酶（（)rotidine-5 ’-m o n o p h o s p h a t e decarboxyla,
D C)和尿嘧啶核苷磷酸化酶（U r i d i n e p h o s p h o r y l a s e.(J P)基因进行双敲除，不仅附断了
嘧啶从头合成途径，而且通过体外调节尿嘧啶的浓度，能够控制嘧啶补救途径，获得非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫（N o n r e p l i c a t i n g t o x o p l a s m a uracil a u x o t r o p h s，N R T U A s)1'2‘f」。
N R T U A s具有独特的表型，在哺乳动物体内不能增殖，只能人侵机体细胞.而N R T U A s只有在体外添加尿嘧啶的培养基中才能正常裂殖生殖，否则 只能人侵细胞，不能增殖，进而降低弓形虫的毒力和致病性.为临床应用提供安全保障[3]。
研究发现，N R T U A s能够调节宿主的免疫系统，激发宿主产生针对弓形虫的细胞免疫应答，并且 免疫虫体经过5 d左右就能被机体的免疫系统清除u。与细菌和病毒疫苗载体相比，N R T U A s首 次免疫1万个虫体就可以激发宿主产生保护性免疫应答，对抗野生型弓形虫的再感染〜，说明
申请报告N R T U A s可作为潜在的弓形虫候选疫苗株，未来有希望应用于家畜养殖业。虽然N R T U A.s在小鼠体内 可被清除，但如果大剂M免疫N R T U A s，宿主细胞是否会将所有的虫体清除？局部组织器官是否会发生病理变化？因此，确定N R T U A s的致病性至关重要。
本研究以A K U80株为背景虫株，利用
C R I S P R-C a s9技术，对O M P
D C和U/3基因进行双敲除，构建N R T U A s虫株，鉴定N R T U A s的表型并将N R T U A s株感染小鼠，通过分析N R T U A s株 对小鼠的致死性以及各器官的病理变化来研究
N R T U A s对小鼠的致病性，为N R T U A s在家畜养殖中作为抗弓形虫疫苗株的应用奠定理论基础。
1材料与方法
1. 1材料
1.1.1 试验动物
5周龄S P F级昆明小鼠60只，体重为20 士2 g，雌雄各半，购北京维通利华实验动物技术有限公司，饲料充足，饮水不限，健康状况良好。
1.1.2 细胞与虫株
非洲绿猴肾细胞（V e r o)、人包皮成纤维细胞(H F F)和A K U80株.由中国农业大学国家动物寄生原虫实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 敲除栽体的构建
参考 T o x o I)B 数据库（h t t p:// w w w.t o x o d b. o r g)中R H虫株的基因组信息，应用h t t p://g r n a.
c t e g d.u g a.e
d u/网站设计U i W P D C基因和U P基因 的特异singl
e g u i d e R N A(s g R N A)序列。然后以p S A G l::C a s9 G F P-U6::s g U P R T 为模板，分别通过引物g O M P D C-F/R和g U P-F/R以P C R扩增的 方式替换模板质粒中的s g U P R T，获得识别
O i W P D C：和[J P靶点的敲除质粒；分别利用引物
K() O M P D C-F1/R1/F2/R2 和 K()U P-F1/R1/F2/ R2来扩增获得U M P D C和U P基因的5’U T R和
3 ’U T R同源臂，并将O M P D C基因 5 ’U T R、
D H F R-Y F P和G M P D C基因3 ’U T R3个片段连接，构建用于替代阻断编码区的同源重组
女生背景图模板，同时将U P基因5’U T R、C A T-m C h e r r y和 U P基因3’U T R3个片段连接，构建用于替代阻断L/P编码区的同源重组模板。
1.2.2 敲除虫株A U P的获得与筛选鉴定
将弓形虫A K U80虫株进行富集和纯化，溶于 适量电转液，使虫体的终浓度为2X107个/m L。调 节电转仪，参数为2 050 V电压，电阻无穷大，电容 25 p F，使用4 m m电转杯。取700 "L虫体加入电转杯中，将1〇 f i g敲除质粒和50 /J t g同源重组模板加人电转杯中混匀，将电转杯放人安全操作池，启动 程序，电转完毕后，电转杯静止20 m i n。将电转完毕的弓形虫加人新鲜培养的H F F细胞中，培养24 h后，更换细胞培养液，加人终质量浓度为50 p g/m L的氯霉素进行初步筛选，接种后每天观察各孔虫株生长状态，传至第六代时，可以观察到红色荧光和噬斑出现；当红色荧光和噬斑出现比例占细胞80 %面积时，用细胞刷刮起细胞，注射器反复推注破碎细胞释放弓形虫，收集弓形虫继续进行氯霉素筛选传代，当敲除虫体的发光率稳定时，说明替 换模板已成功插入弓形虫的基因组中，然后通过有限稀释法进行单克隆虫株的筛选，接种到96孔板内 培养，直至虫株长成噬斑，挑出U P基W缺失的单克
第5期任超等：非复制型弓形虫的构建及其对小鼠致病性分析85
隆抗性虫株进行扩大培养，提取敲除虫株的基因组，利用引物U P 5-F/R和U P 3-F/R进行重组同源臂上下游P C R鉴定，利用引物U P I1-F/R和U P 12- F/R进行内源性L7P位点缺失P C R鉴定，鉴定正确
的敲除虫株A U P用于O M P D C基因敲除。
1.2.3 敲除虫株A O M P D C的获得与筛选鉴定
敲除虫株的获得与筛选鉴定过程同1.2. 2，电转完毕时，将弓形虫加人新鲜培养的H F F细胞中，细胞培养液中含250 p m o l/L尿嘧啶。培养24 h 后，更换细胞培养液，加人浓度为1y m o l/L的乙胺嘧啶进行初步筛选.接种后每天观察各孔虫株生长状态.传至第五代时，可以观察到黄色荧光和噬斑；单克隆鉴定时，提取敲除虫株的基因组，利用引物O M P D C 5-F/R和（)M P D C 3-F/R进行重组同源臂上下游P C'R鉴定，利用引物O M P D L'II-F/R和 O M P D C I2-F/R进行内源性O M P D C位点缺失
P C R鉴定，鉴定正确的敲除虫株A O M P D C用于后续实验。中国剪纸教程
1.2.4 敲除虫株A()M P D C A U P(N R T U A s)的获
得与筛选鉴定
敲除虫株的获得与筛选鉴定过程同1.2. 2，将 弓形虫A U P株进行富集和纯化用于敲除，当电转完毕的弓形虫加人新鲜培养的H F F细胞中，细胞 培养液中含250 ^111〇1/1.尿嘧啶。培养24 h后，更 换细胞培养液.加人终质量浓度为50 p g/m L的氯 霉素和1y m o l/L的乙胺嘧啶进行初步筛选，接种 后每天观察各孔虫株生长状态，传至第五代时，可以 观察到黄色荧光、红色荧光和噬斑；单克隆鉴定同1.2.
3.鉴定正确的敲除虫株N R T U A s用于后续实验。
1.2. 5 噬斑试验
将H F F细胞铺满12孔细胞培养板，收集N R T U A s株和A K U80株，分别接种70个速殖子至H F F细胞，其中，N R T U A s株和A K U80株分别接种在含有或不含250 M m o l/L尿嘧啶的细胞培养液中，培养7 d，观察，吸弃培养基，用P B S轻轻洗去释放到胞外的虫体。每孔加人4%多聚甲醛l m L，室温固定20 m i n。每孔再加人1%结晶紫染色1〜2 m L，室温染色1h，用P B S充分洗涤。肉眼可见未着色的噬斑，扫描记录。
1.2.6非复制型弓形虫对小鼠的致病性研究
将雌鼠随机分成3组，每组10只，在试验第〇天，各组以腹腔注射的方式分别感染N R T U A s株和A K U80株，速殖子悬液浓度为1(^个/m L，感染 剂量为0. 1m L/只，同时腹腔注射等剂量的无菌
P B S为空白对照。雄鼠处理方式同雌鼠。
每日观察各组小鼠的精神状态，记录死亡情况，对死亡小鼠即刻剖检，在试验第40天剖检剩余小鼠，采集所有小鼠的心脏、肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、胸腺、脑、卵巢或睾丸，用10%中性福尔马林固定液进行组织固定，按照常规方法制备病理组织切片并进行H E 染色，对小鼠各器官进行病理组织学观
察和分析。
2结果与分析
2.1敲除载体的构建
以P C R扩增方式替换模板质粒中的s g U P R T，分别获得识别O M P D C’和U P粑点的s g R N A基因 片段（图1(a))，用于构建O M P D C和L/P基因的敲除质粒。
通过P C R扩增，分别获得O M P D C和U P基因 的5’U T R和3’U T R同源臂（图1(b))，并进一步构建替代阻断O M P D C〕和L/P编码区的同源重组模板（图1(c))。
2.2敲除虫株A U P的获得与筛选鉴定
分别提取N R T U A s株和A K U80株的基因组D N A为模板，N R T U A s株以引物O M P D C 5-F/R 和O M P D C 3-F/R鉴定均为阳性，A K U80株均为阴性；N R T U A s株以引物O M P D C H-F/R和 O M P D C 12-F/R鉴定均为阴性，A K U80株均为阳性，说明N R T U A s株针对O J W P D C基因的同源臂与基因组发生同源重组，O M P D C基因敲除成功(图 l(d));N R T U A s 株以引物U P 5-F/R 和 U P 3- F/R鉴定均为阳性，A K U80株均为阴性；N R T U A s株以弓丨物U P Il-F"<；和U P I2-F/R鉴定 均为阴性，A K U80株均为阳性，说明N R T U A s株 针对U P基因的同源臂与基因组发生同源重组，L/P
有数字的古诗基因敲除成功（图1(e))。
荧光倒置显微镜下观察，A O M P D C株自发黄色荧光，对乙胺嘧啶产生抗药性（图2(a)); A U P株 自发红色荧光，对氯霉素产生抗药性（图2(b)); N R T U A s株自发黄色和红色双荧光，能够对乙胺嘧啶和氯霉素产生抗药性（图2(c))，说明O M P D C'和 U P基因敲除成功。
2.3敲除虫株的表型鉴定
噬斑试验主要用于评价弓形虫在细胞内的整体生长情况。N R T U A s在不含尿嘧啶的培养基中不
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中国农业大学学报2021年第26卷
能形成噬斑，当培养基中添加尿嘧啶后，N R T U A s 能够形成噬斑，而无论培养基中是否含有尿嘧啶， A K U 80株均能形成噬斑（图3)。上述结果说明
O M P D C 和L /P 基因双敲除抑制弓形虫虫体的生 长，通过体外尿嘧啶供给，能够恢复敲除虫体的生长能力。
(<i) 1 2 3 4 M 5 6 7 8 (a ) *e) 1 2 3 M 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12
入党申请书下载
(a ) OsgRNA ：识别O M P D C 靶点的s g R N A 基因片段；U.sgRNA：识别L /P 粑点的s g R N A 基因片段；M : D N A 标准 A L 5000;(b )()5 :O M P /X ：基因 5’U T R 的同源臂；03:GiVfPDC 基因 3’U
T R 的同源臂；U5:L/P 基因 5’U T R 的同源臂；U3:[7P 基因3’U T R 的同源臂；M ，D N A 标准AL5000;(c )()P C R ：替代阻断O M P D C 编码区的同源重组模板；U P C R ：替代阻断（7P 编 码区的同源重组模板；M ，D N A 标准1 kb DNA Ladder; (d )O M P D C 基因敲除鉴定，1〜2: N R 丁U A s 株O M P D C 基因重组同源 臂1：下游P C K 鉴定为阳性；3〜4:N R T U A s 株内源性O M P D C '位点缺失P C R 鉴定为阴性；M :D N A 标准A L 5000;5〜6, △ K U 80株O M P D C 基因重组同源臂上下游P C R 鉴定为阴性；7〜8: A K U 80株内源性O M P D C 位点缺失P C R 鉴定为阳性； (e )t ；P 基因敲除鉴定，1和3:N R T U A s 株L /P 基因重组同源臂h 游P C R 鉴定为阳性；2:A K U 80株C /P 基因重组同源臂上游 P ('R 鉴定为阴性；M :D N A 标准A L 5000;4和6:N R T U A s 株基因重组同源臂下游P C R 鉴定为阳性；5:A K U 80株L /P 基因重组同源臂下游P C R 鉴定为阴性；7、9、10和12:A K U 80株内源性L /P 位点缺失P C R 鉴定为阳性；8和l l :N R T U A s 株内 源性L /P 位点缺失P C R 鉴定为阴性。
(a) OsgRN A : the sgRNA gene fragment of O M PD C target recognized; U sg R N A : the sgRNA gene fragment of U P target recognized ； M ： AL5000 DNA M a rk er ； (b) 05： homologous arm of O M PD C 5,U T R ； 03： homologous arm of O M PD C 3J U T R ； U 5： homologous arm of C7P S ^T R ； U 3： homologous arm of L7P S ^T R ； M ： AL5000 DNA M arker ； (c) O P C R ： homologous recombination template for replacing and blocking coding region of O M P D C ；
UPCR ： homologous recombination template for replacing and blocking coding region of U P ； M ： lkb DNA Ladder DNA M a rk e r ； (d ) Identification of O M PD C knockout, 1~ 2： PCR identification of upstream and downstream of the recombinant homologous arm was positive for O M PD C of N R T U A s strain s ； 3 — 4： PCR identification of endogenous OM PDC deletion was negative for N R T U A s strains ； M ： AL5000 DNA Marker; 5 — 6: PCR identification of upstream and downstream of the recombinant homologous arm was negative for O M PD C of A K U 80 stra in s ； 7 — 8： PCR identification of endogenous O M PD C deletion was positive for A K U 80 strains, (e) Identification 〇( UP knockout, land 3： PCR identification of upstream of the recombinant homologous arm was positive for UP of N R T U A s strain s ； 2： PCR identification of upstream of the recombinant homologous arm was negative for UP of A K U 80 strains ； M ： AL5000 DNA M a rk er ； 4and 6： PCR identification of downstream of the recombinant homologous arm was positive for UP of N R T U A s stra in s ； 5： PCR identification of downstream of the recombinant homologous arm was negative for UP of A K U 80 strains; 7 %9 x 10 and 12 ： PCR identification of endogenous UP deletion was positive for A K U 80 strains; 8 and 11 ： PCR identification of endogenous UP deletion was negative for N RT U A s strains.
图1
O M P D C 和t /P 基因敲除质粒的构建与N R T U A s 鉴定
Fig. 1
C o n s t r u c t i o n of k n o c k o u t p la s m id f o r O M P
D C an d U P an d id en tific a tio n of N R T U A
s
第5期
任超等：非复制咽弓形虫的构违及其对小鼠致病性分析
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写的英语(a )A 〇M P D C 株自发黄色荧光，在含有乙胺嘧啶的培养基中能够生长；（b )A U P 株自发红色荧光，在含有S 霉素的培养基 中能够生长“O N R T U A s 株自发黄色和红色双荧光，在含有乙胺嘧啶和氣霉素的培养基中能够生长。比例尺=20
(a) AOMPDC strains spontaneously fluorescing yellow can replicate in the medium with pyrimidine ； ( b) AUP strains spontaneously fluorescing red can replicate in the medium with chloramphenicol ； (c) N R T U A s strains spontaneously fluorescing yellow and red can replicate in the medium with pyrimidine and chloramphenicol. Bar = 20
图2敲除虫株的筛选
Fig . 2 Screening of knockout strains
染后第4、5和6天分别出现6、3和1只小鼠死亡， 生存率均为0(图4(a ))。雄鼠在感染后0〜40 d 内，N R T U A s 组和P B S 组均无小鼠死亡，生存率为 100%;A K U 80组在感染后第3、4、6天分别出现2、6、2只小鼠死亡，生存率均为0(图4(b ))。上述结 果说明N R T U A s 虫株对小鼠无致死性。2.5非复制型弓形虫对小鼠各器官的病理分析
小鼠心脏病理组织学分析，各组的心肌纤维排
列规整，胞浆丰富，胞质和胞核染色均匀，细胞间无 充血和炎性细胞浸润（图5)。
小鼠肺脏病理组织学分析，N R T U A s 组和P B S
子不教父之过组肺组织结构清晰.肺泡壁和各级支气管结构完整， 肺泡腔和各级支气管腔内无渗出物.各级支气管的 粘膜上皮无变性坏死脱落.肺泡间隔未增厚，无炎性 细胞浸润，肺泡壁毛细血管内少量红细胞；A K U 80 组肺泡间隔、支气管和血管周围充血、水肿，淋巴细
-尿嘧啶
+尿嘧啶
—Uracil
+Uracil
A K U 80
图3 敲除虫株的表型鉴定
Fig . 3 Phenotypic identification of knockout strain 2.4非复制型弓形虫对小鼠的致病性分析
雌鼠在感染后0〜40 d 内，N R T U A s 组和PBS 组均无小鼠死亡，生存率为1〇〇%;A K U 80组在
感
医德考评自我评价
