㊀南京农业大学学报㊀２０２１ꎬ４４(２):２４１－２４８ｈｔｔｐ://ｎａｕｘｂ.ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ㊀ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＤＯＩ:１０.７６８５/ｊｎａｕ.２０２００５００６收稿日期:２０２０－０５－０６
基金项目：国家重点研发计划项目(２０１８ＹＦＤ１０００８００ꎬ２０１７ＹＦＤ０１０１８０３)ꎻ国家大宗蔬菜产业技术体系项目(ＣＡＲＳ－２３－Ａ－０６)
作者简介：张玮ꎬ硕士研究生ꎮ∗通信作者：李英ꎬ教授ꎬ主要从事蔬菜遗传育种和分子生物学研究ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｙｉｎｇｌｉ＠ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
张玮ꎬ郭明亮ꎬ龙言ꎬ等.不结球白菜分蘖调控基因ＢｃＭＡＸ１的同源克隆及功能分析[Ｊ].南京农业大学学报ꎬ２０２１ꎬ４４(２):２４１－２４８.
ＺＨＡＮＧＷｅｉꎬＧＵＯＭｉｎｇｌｉａｎｇꎬＬＯＮＧＹａｎꎬｅｔａｌ.Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｃｌ
ｏｎｉｎｇａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｔｉｌｌｅｒｉｎｇｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｇｅｎｅＢｃＭＡＸ１ｉｎｎｏｎ￣ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２０２１ꎬ４４(２):２４１－２４８.
不结球白菜分蘖调控基因ＢｃＭＡＸ１的同源克隆及功能分析
张玮ꎬ郭明亮ꎬ龙言ꎬ黄菲艺ꎬ侯喜林ꎬ李英∗
(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室/园艺学院ꎬ江苏南京２１００９５)
摘要:[目的]本文旨在克隆不结球白菜ＢｃＭＡＸ１基因及其启动子ꎬ对其进行表达模式分析ꎬ并对其在分蘖调控中的功能进行探索ꎮ[方法]对ＢｃＭＡＸ１基因及其启动子进行克隆ꎬ并利用生物信息学方法对该基因和启动子序列㊁基因编码的蛋白序列以及不同物种间ＭＡＸ１的进化关系进行分析ꎮ比较不结球白菜品种 马耳头 (分蘖品种)和 苏州青 (不分蘖品种)不同生长时期以及不同组织(根㊁茎㊁叶片和腋芽)中ＢｃＭＡＸ１的相对表达量ꎮ利用ＢｃＭＡＸ１过表达拟南芥转基因植株和不结球白菜沉默植株对ＢｃＭＡＸ１基因的功能进行初步研究ꎬ并利用实时荧光定量ＰＣＲ检测ＢｃＭＡＸ１及独角金内酯响应基因ＢｃＭＡＸ２和ＢｃＤ１４的表达水平ꎮ[结果]ＢｃＭＡＸ１基因包含１个长度为１５９
３ｂｐ的开放阅读框ꎬ编码５３１个氨基酸ꎮＭＡＸ１在不同物种间具有很高的保守性ꎮＢｃＭＡＸ１的启动子含有多个决定转录起始和效率的基序以及响应干旱和光照的基序ꎮＢｃＭＡＸ１在不结球白菜 马耳头 和 苏州青 腋芽伸长形成分蘖的过程中发挥作用ꎬ主要表达部位为根㊁叶片和腋芽ꎮＢｃＭＡＸ１过表达转基因拟南芥植株的侧枝减少ꎬＢｃＭＡＸ１基因及独角金内酯响应基因ＢｃＭＡＸ２和ＢｃＤ１４的表达量在过表达植株中均升高ꎬ在不结球白菜沉默植株中下降ꎮ[结论]不结球白菜ＢｃＭＡＸ１基因在 马耳头 和 苏州青 中的表达存在时空特异性和组织特异性ꎬ它参与植物分蘖的负调控ꎬ同时正向调控独角金内酯响应基因ＢｃＭＡＸ２和ＢｃＤ１４的表达ꎮ关键词：不结球白菜ꎻＢｃＭＡＸ１ꎻ分蘖ꎻ过表达ꎻ基因沉默
中图分类号:Ｓ６３４.３㊀㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号:１０００－２０３０(２０２１)０２－０２４１－０８
ＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｔｉｌｌｅｒｉｎｇｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｇｅｎｅＢｃＭＡＸ１ｉｎｎｏｎ￣ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ
ＺＨＡＮＧＷｅｉꎬＧＵＯＭｉｎｇｌｉａｎｇꎬＬＯＮＧＹａｎꎬＨＵＡＮＧＦｅｉｙｉꎬＨＯＵＸｉｌｉｎꎬＬＩＹｉｎｇ∗(ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃｓａ
ｎｄＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｒｍｐｌａｓｍ
ＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌＣｒｏｐｓｉｎＥａｓｔＣｈｉｎａꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓ/ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ
ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００９５ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:[Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ]ＴｈｅｐａｐｅｒａｉｍｅｄｔｏｃｌｏｎｅＢｃＭＡＸ１ｇｅｎｅａｎｄｉｔｓｐｒｏｍｏｔｅｒꎬａｎａｌｙｚｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆＢｃＭＡＸ１ａｎｄｅｘｐｌｏｒｅｉｔｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｔｉｌｌｅｒｉｎｇｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ.[Ｍｅｔｈｏｄｓ]ＢｃＭＡＸ１ｇｅｎｅａｎｄｉｔｓｐｒｏｍｏｔｅｒｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄꎬａｎｄｔｈｅｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｇｅｎｅａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅꎬｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｅｎｃｏｄｅｄｂｙｔｈｅｇｅｎｅꎬａｎｄｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｏｆＭＡＸ１ａｍｏｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｅｓ.ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＢｃＭＡＸ１ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓ(ｒｏｏｔꎬｓｔｅｍꎬｌｅａｆａｎｄａｘｉｌｌａｒｙ)ａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒ
ｏｗｔｈｓｔａｇｅｓｉｎ Ｍａｅｒｔｏｕ (ｔｈｅｔｉｌｌｅｒｉｎｇｖａｒｉｅｔｙ)ａｎｄ Ｓｕｚｈｏｕｑｉｎｇ (ｔｈｅｎｏｎ￣ｔｉｌｌｅｒｉｎｇｖａｒｉｅｔｙ)ｗｅｒｅａｌｓｏｃｏｍｐａｒｅｄ.ＴｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＢｃＭＡＸ１ｇｅｎｅｗａｓｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙｓｔｕｄｉｅｄｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓａｎｄｎｏｎ￣ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅｓｉｌｅｎｔｐｌａｎｔｓ.ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＢｃＭＡＸ１ａｎｄｓｔｒｉｇｏｌａｃｔｏｎｅｓｒｅｓｐｏｎｓｅｇｅｎｅｓＢｃＭＡＸ２ａｎｄＢｃＤ１４ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ￣ｑＲＣＲ.[Ｒｅｓｕｌｔｓ]ＴｈｅＢｃＭＡＸ１ｇｅｎｅｃｏｎｔａｉｎｅｄａｎｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｏｆ１５９３ｂｐꎬｅｎｃｏｄｉｎｇ５３１ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ.ＭＡＸ１ｗａｓｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｍｏｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｅｓ.ＴｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｏｆＢｃＭＡＸ１ｃｏｎｔａｉｎｅｄｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｍｏｔｉｆｓｔｈａｔｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙꎬａｎｄｔｈｅｍｏｔｉｆｓｔｈａｔｒｅｓｐｏｎｄｔｏｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｌｉｇｈｔ.ＢｃＭＡＸ１ｇｅｎｅｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｔｈｅａｘｉｌｌａｒｙｂｕｄｓｅｌｏｎｇａｔｉｏｎａｎｄｔｉｌｌｅｒｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎ Ｍａｅｒｔｏｕ ａｎｄ Ｓｕｚｈｏｕｑｉｎｇ ꎬａｎｄｔｈｅｍａｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｔｅｓｗｅｒｅｒｏｏｔꎬｌｅａｆａｎｄａｘｉｌｌａｒｙｂｕｄ.ＢｃＭＡＸ１ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｔ
ｒａｎｓｇｅｎｉｃＡ ｔｈａｌｉａｎａｐｌａｎｔｓｈａｄｆｅｗｅｒｌａｔｅｒａｌｂｒａｎｃｈｅｓꎬａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＢｃＭＡＸ１ｇｅｎｅａｎｄｓｔｒｉｇｏｌａｃｔｏｎｅｓｒｅｓｐｏｎｓｅｇｅｎｅｓＢｃＭＡＸ２ａｎｄＢｃＤ１４ｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄＡ ｔｈａｌｉａｎａｐｌａｎｔｓꎬｂｕｔｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｎｏｎ￣ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅｗｈｉｃｈｓｉｌｅｎｃｅｄｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＢｃＭＡＸ１.[Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ]ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｃＭＡＸ１ｇｅｎｅｉｎ Ｍａｅｒｔｏｕ ａｎｄ Ｓｕｚｈｏｕｑｉｎｇ ｗａｓｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌａｎｄｔｉｓｓｕｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ.ＩｔｗａｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｔｉｌｌｅｒｉｎｇａｎｄｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｔｒｉｇｏｌａｃｔｏｎｅｓｒｅｓｐｏｎｓｅｇｅｎｅｓＢｃＭＡＸ２ａｎｄＢｃＤ１４.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ｂｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｓｓｐ.ｃｈｉｎｅｎｓｉｓꎻＢｃＭＡＸ１ꎻｔｉｌｌｅｒｉｎｇꎻｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ
２４２
南㊀京㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第４４卷不结球白菜(Ｂｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｓｓｐ.ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ)是我国重要的叶菜类蔬菜ꎬ其中有一种特殊种质材料为分蘖菜[１]ꎬ它既有单子
叶植物的分蘖特性又具有双子叶植物的分枝特点[２]ꎬ即在腋芽形成后不经过休眠阶段就开始发生分蘖ꎬ植株总叶片数极多ꎬ可以分批采摘[３]ꎬ它的独特优势决定了其会成为不结球白菜未来育种的优质材料ꎮ因此ꎬ研究不结球白菜分蘖性状及内在分子机制可以为未来的育种工作打下良好的基础ꎮ女王的英文
独脚金内酯(ｓｔｒｉｇｏｌａｃｔｏｎｅꎬＳＬ)最早发现于根系分泌物中[４]ꎬ它可以通过木质部向上运输至地上部分参与调控植物株型[５]ꎮ近几年的研究发现ＳＬ主要以一种生长素依赖的方式来调节腋芽分枝[６－８]ꎮ之前在水稻上的研究已经鉴定出几种突变体在ＳＬ的生物合成中存在缺陷(Ｄ３/Ｄ１０/Ｄ１４/Ｄ２７/Ｄ５３)ꎬ它们表现为高分枝㊁矮化[９]ꎬ但同时ＳＬ也会参与不同的发育过程ꎬ如表皮细胞分化㊁木葡聚糖代谢过程㊁休眠过程㊁刺激反应㊁核酸酶转运等[１０]ꎮ
近年来ꎬ对于独脚金内酯的研究愈加深入ꎬ研究发现在单子叶和双子叶植物中ꎬ其抑制植物分枝的调控模式以及功能基因都存在高度保守性ꎬ特别是参与ＭＯＲＥＡＸＩＬＬＡＲＹ(ＭＡＸ)途径中的基因ꎬ目前已经在４种模式植物(拟南芥㊁豌豆㊁水稻和矮牵牛)中鉴定到独角金内酯依赖ＭＡＸ途径完成合成及信号转导从而参与分枝的调控机制[１１]ꎮＭＡＸ家族基因会改变腋芽的休眠状态[９]ꎬ即在腋芽发生后不经过休眠阶段直接进入下一步生长阶段ꎬ这与不结球白菜分蘖菜 马耳头 的表型是一致的ꎬ推测ＭＡＸ家族基因可能为 马耳头 特殊分蘖性状形成的重要基因ꎮ其中ＭＡＸ１在木质部作用于ＭＡＸ３/ＭＡＸ４下游１个可以移动的底物产生类胡萝卜素衍生物ꎬ参与ＳＬ的合成ꎬ直接或间接抑制植物分枝发育[１２－１４]ꎻＭＡＸ２编码１个含有富含亮氨酸重复序列的Ｆ￣ｂｏｘ蛋白[１５]ꎬＤ１４编码α/
β水解酶家族成员[９]ꎬ二者均参与ＳＬ的信号转导ꎮ研究发现ꎬ在拟南芥中ＭＡＸ１是通过催化连续的氧化作用将内酯(ｃａｌａｃｔｏｎｅꎬＣＬ)转化为内酯酸(ｃａｌａｃｔｏｎｅａｃｉｄꎬＣＬＡ)ꎬ之后再合成ＳＬꎬ并且其甲酯在体外可与ＡｔＤ１４直接发生相互作用[１６]ꎮ另外ꎬＤ１４和ＭＡＸ２均被认为作用于ＭＡＸ１的下游ꎬ并且二者编码的蛋白存在相互作用[１７]ꎮ
本研究以不结球白菜 马耳头 和 苏州青 为材料ꎬ同源克隆大白菜ＢｃＭＡＸ１(ＬＯＣ１０３８５８３７３)基因及其启动子ꎬ并对其进行生物信息学分析ꎻ同时检测ＢｃＭＡＸ１在 马耳头 和 苏州青 不同时期不同组织中的表达差异ꎬ并利用ＢｃＭＡＸ１过表达拟南芥转基因植株和不结球白菜沉默植株对ＢｃＭＡＸ１基因的功能进行初步研究ꎬ旨在进一步探究不结球白菜独角金内酯的调控机制ꎬ为不结球白菜高产育种提供基础ꎮ
１㊀材料与方法
１.１㊀试验材料
供试材料为不结球白菜品种 马耳头 (分蘖品种)和 苏州青 (不分蘖品种)以及Ｃｏｌ生态型拟南芥ꎬ由南京农业大学白菜系统生物学实验室提供ꎮ分别于不结球白菜苗龄３０㊁５０和７０ｄ时选取生长整齐一致的植株ꎬ取根㊁茎㊁叶片和腋芽ꎬ液氮速冻后－８０ħ保存ꎮ拟南芥和用于病毒诱导的基因沉默(ＶＩＧＳ)试验的 苏州青 种植在人工气候室中ꎮ
１.２㊀试验方法
１.２.１㊀ＲＮＡ和ＤＮＡ的提取以及ｃＤＮＡ和ｇＤＮＡ的合成㊀参照植物总ＲＮＡ和基因组ＤＮＡ提取试剂盒(天根生化科技有限公司)分别提取２个不结球白菜品种的ＲＮＡ和ＤＮＡ以及拟南芥的ＲＮＡꎬ４ħ冷却后－８０ħ保存ꎮ以２个品种叶片的总ＲＮＡ和ＤＮＡ为模板分别按ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭⅡ１ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ和ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ(ＴａＫａＲａ)说明书分别合成ｃＤＮＡ和ｇＤＮＡꎮ
突发奇想
１.２.２㊀不结球白菜ＢｃＭＡＸ１基因的同源克隆及生物信息学分析㊀从大白菜数据库检索出ＢｃＭＡＸ１基因序列ꎬ设计１对特异引物ＢｃＭＡＸ１￣Ｆ和ＢｃＭＡＸ１￣Ｒ(表１)ꎬ以上述ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ反应ꎮ用ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ查找ＢｃＭＡＸ１的开放阅读框(ＯＲＦ)ꎻ利用Ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ分析ＢｃＭＡＸ１编码蛋白的生化信息并预测其二级结构ꎮ
１.２.３㊀ＭＡＸ１蛋白的系统进化树构建及保守结构域分析㊀采用ＭＥＧＡ７软件构建系统进化树ꎬ通过ＭＥＭＥ分析不同物种中ＭＡＸ１蛋白的保守结构域ꎬ并用ＴＢｔｏｏｌｓ软件对其进行整合分析ꎮ
１.２.４㊀不结球白菜ＢｃＭＡＸ１启动子的同源克隆与序列分析㊀在大白菜数据库中检索出ＢｃＭ
ＡＸ１启动子序列ꎬ设计１对引物ＢｃＭＡＸ１￣Ｐ￣Ｆ和ＢｃＭＡＸ１￣Ｐ￣Ｒ(表１)ꎬ以上述基因组ＤＮＡ作为模板进行ＰＣＲ反应ꎮＰＣＲ反应体系为:ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘＰｒｅｍｉｘ１０μＬꎬ正㊁反引物各１μＬꎬ模板ＤＮＡ１００ｎｇꎬ补水至２０μＬꎮＰＣＲ
３４２㊀第２期张玮ꎬ等：不结球白菜分蘖调控基因ＢｃＭＡＸ１的同源克隆及功能分析
梧桐树丰子恺
反应程序为:９８ħ５ｍｉｎꎻ９８ħ３０ｓꎬ５５~６５ħ３０ｓꎬ７２ħ２ｍｉｎꎬ共３５个循环ꎻ７２ħ１０ｍｉｎꎮ采用Ｐｌａｎｔ￣ＣＡＲＥ软件[１８]进行序列分析ꎮ
表１㊀ＰＣＲ所用引物序列
Ｔａｂｌｅ１㊀ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ(５ᶄң３ᶄ)用途Ｕｓａｇｅ
ＢｃＭＡＸ１￣ＦＡＴＧＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＢｃＭＡＸ１基因ＯＲＦ扩增
ＢｃＭＡＸ１￣ＲＴＣＡＧＴＣＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＴＯＲＦａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢｃＭＡＸ１ｇｅｎｅ
ＢｃＭＡＸ１￣Ｐ￣ＦＴＧＴＡＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＡＴＧＢｃＭＡＸ１启动子扩增
ＢｃＭＡＸ１￣Ｐ￣ＲＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＡＴＣＴＴＡＴＴＡＣＡＧＰｒｏｍｏｔｅｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢｃＭＡＸ１
ｐＴＣＫ３０３￣ＢｃＭＡＸ１￣ＦＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣ载体ｐＴＣＫ３０３￣ＢｃＭＡＸ１构建
ｐＴＣＫ３０３￣ＢｃＭＡＸ１￣ＲＧＡＧＣＴＣＧＴＣＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＴＣｏｎｓｔｒｕｃｔｏｆｖｅｃｔｏｒｐＴＣＫ３０３￣ＢｃＭＡＸ１
生命之歌ｑＲＴ￣ＢｃＭＡＸ１￣ＦＧＡＣＡＴＧＧＧＴＴＴＧＧＴＴＧＧＣＡＣＢｃＭＡＸ１定量
ｑＲＴ￣ＢｃＭＡＸ１￣ＲＧＡＣＣＡＡＴＧＣＣＡＡＡＣＧＧＧＡＴＧＢｃＭＡＸ１ｇｅｎｅｆｏｒＲＴ￣ＰＣＲ
ｑＲＴ￣ＢｃＭＡＸ２￣ＦＡＧＧＡＧＣＴＴＧＴＧＣＴＴＧＡＣＧＴＴＢｃＭＡＸ２定量
ｑＲＴ￣ＢｃＭＡＸ２￣ＲＡＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＡＡＣＡＡＣＣＣＴＢｃＭＡＸ２ｇｅｎｅｆｏｒＲＴ￣ＰＣＲ
ｑＲＴ￣ＢｃＤ１４￣ＦＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＴＡＣＣＡＣＧＧＡＧＢｃＤ１４定量
部编版小学语文ｑＲＴ￣ＢｃＤ１４￣ＲＡＧＣＣＴＣＧＴＡＧＴＴＡＧＣＣＴＣＣＡＢｃＤ１４ｇｅｎｅｆｏｒＲＴ￣ＰＣＲ
Ａｃｔｉｎ１￣ＦＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＴＴＣＣＧＴＴＧ不结球白菜中用于定量的内参基因
Ａｃｔｉｎ１￣ＲＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＴＩｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｅｆｏｒＲＴ￣ＰＣＲｉｎｎｏｎ￣ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅＡｃｔｉｎ２￣ＦＴＴＧＡＣＡＡＴＴＧＡＴＧＣＡＡＡＣＡＡＴＧＡＣＧ拟南芥中用于定量的内参基因
Ａｃｔｉｎ２￣ＲＣＣＡＴＴＧＣＴＴＡＡＴＴＣＣＡＣＧＧＡＣＡＡＡＣＩｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｅｆｏｒＲＴ￣ＰＣＲｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
㊀㊀注：下划线为添加的酶切位点ꎬＧＧＡＴＣＣ㊁ＧＡＧＣＴＣ分别为ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠꎮ
Ｎｏｔｅ:ＴｈｅｕｎｄｅｒｌｉｎｅｓａｒｅｔｈｅａｄｄｅｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅｓꎬＧＧＡＴＣＣ和ＧＡＧＣＴＣｒｅｐｒｅｓｅｎｔｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓｉｔｅｓｏｆＢａｍＨⅠａｎｄＳａｃⅠꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.１.２.５㊀ＢｃＭＡＸ１过表达载体的构建及转基因拟南芥的获得㊀首先将测序正确的ＢｃＭＡＸ１基因克隆产物连接到经ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ双酶切的植物过表达载体ｐＴＣＫ３０３(本实验室保存)中ꎬ得到重组载体ｐＴＣＫ３０３￣ＢｃＭ
ＡＸ１ꎮ将重组载体转入农杆菌并通过蘸花法得到转基因拟南芥Ｔ０代ꎬ再经过２次抗性筛选得到Ｔ２代ꎮ１.２.６㊀ＢｃＭＡＸ１沉默载体的构建及沉默植株的获得㊀从ＢｃＭＡＸ１的编码区挑选一段４０ｂｐ的特异序列ꎬ将其与它的反向互补序列合成１个８０ｂｐ的发夹结构序列ꎬ随后将其插入ｐＴＹ载体(本实验室保存)得到ＢｃＭＡＸ１沉默载体并测序验证ꎮ同时设置对照即ｐＴＹ空载ꎮ该４０ｂｐ的特异序列为:５ᶄ￣ＡＴＧＡＡＧＡＣＧ￣ＣＡＡＣＡＴＴＴＡＴＧＧＴＧＧＧＡＴＧＴＴＣＴＴＡＡＴＣＴＡＴＡＴＡＧＡＴＴＡＡＧＡＡＣＡＴＣＣＣＡＣＣＡＴＡＡＡＴＧＴＴＧＣＧＴＣＴＴＣＡＴ￣３ᶄꎮ采用１月龄的 苏州青 用于病毒诱导的基因沉默(ＶＩＧＳ)试验ꎬ通过基因枪法导入病毒ꎮ试验重复３次ꎬ每个重复８株苗ꎮ将植株移至２５ħ㊁相对湿度为７５％的气候室中ꎬ大约２０ｄ后ꎬ选取有感病症状的叶片观察并分析其沉默效率ꎮ
１.２.７㊀定量ＰＣＲ分析㊀使用ＮＣＢＩ设计荧光定量特异性引物ｑＲＴ￣ＢｃＭＡＸ１￣Ｆ和ｑＲＴ￣ＢｃＭＡＸ１￣Ｒꎬ采用２－ΔΔＣＴ法计算不同分蘖时期不同组织(根㊁茎㊁叶片和腋芽)中ＢｃＭＡＸ１的表达量ꎬ以３０ｄ苗龄 苏州青 根中的表达量为对照ꎮ同时测定ＢｃＭＡＸ１过表达拟南芥转基因植株和不结球白菜沉默植株中ＢｃＭＡＸ１及独角金内酯响应基因ＢｃＭＡＸ２和ＢｃＤ１４的表达水平ꎬ以野生型植株作为对照ꎮ以Ａｃｔｉｎ１和Ａｃｔｉｎ２基因作为不结球白菜和拟南芥的内参ꎬ引物见表１ꎮ３次生物学重复ꎮ
２㊀结果与分析
２.１㊀不结球白菜ＢｃＭＡＸ１基因的同源克隆和不同物种ＭＡＸ１的系统进化分析以及保守基序分析以不结球白菜 马耳头 和 苏州青 的ｃＤＮＡ为模板进行克隆ꎬ２个序列完全一致ꎮ序列分析表明ꎬ不结球白菜ＢｃＭＡＸ１包含１个１５９３ｂｐ的开放阅读框(ＯＲＦ)ꎬ编码５３１个氨基酸ꎮＢｃＭＡＸ１蛋白质的分子式为Ｃ２７８１Ｈ４３６２Ｎ７２０Ｏ７５６Ｓ１３ꎬ理论等电点(ｐＩ)为９.２６ꎬ不稳定指数为３４.６５ꎬ属于稳定蛋白ꎬ脂肪酸系数为１００.４ꎮ预测该蛋白无信号肽ꎬ但存在跨膜区域ꎮ
对２２个物种(包括１６个双子叶植物和６个单子叶植物)中的ＭＡＸ１进行进化树分析ꎬ结果(图１－Ａ)显示ꎬ不结球白菜(Ｂｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｓｓｐ.ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ)的ＢｃＭＡＸ１与同为芸薹属的欧洲油菜(Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ)㊁甘蓝(Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａ)的ＭＡＸ１相似性高达１００％ꎻ与同为十字花科的萝卜(Ｒａｐｈａｎｕｓｓａｔｉｖｕｓ)中的ＭＡＸ１相似度高于９４％ꎻ与拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)㊁亚麻芥(Ｃａｍｅｌｉｎａｓａｔｉｖａ)㊁高山南芥(Ａｒａｂｉｓａｌｐｉｎａ)中的ＭＡＸ１相似性均为８０％左右ꎮ在２２个ＭＡＸ１蛋白中共发现１５个ｍｏｔｉｆ(图１－Ｂ)ꎮ其中ꎬ
南㊀京㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第４４卷ｍｏｔｉｆ１ ｍｏｔｉｆ９为共有ｍｏｔｉｆꎬｍｏｔｉｆ１０㊁ｍｏｔｉｆ１１仅存在于双子叶植物中ꎬ并且ｍｏｔｉｆ１１只存在于十字花科植物中ꎬ而ｍｏｔｉｆ１３和ｍｏｔｉｆ１４为单子叶植物所特有ꎮｍｏｔｉｆ１２在某些植物中缺失ꎬｍｏｔｉｆ
１５仅存在于单子叶植物和苜蓿中
莲子的做法
工程地质条件
ꎮ
图１㊀不同物种中ＭＡＸ１蛋白的系统进化树和保守基序分析
Ｆｉｇ １㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｃｏｎｓｅｒｖｅｄｍｏｔｉｆｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆＭＡＸ１ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｅｓ
㊀㊀Ａ.系统进化树ꎻＢ.保守基序示意图ꎻＣ.基序信息ꎮＢ图中每个图案由右边编号的彩色框表示ꎬ不同蛋白质中的相同数字指的是相同的基序ꎮ
Ａ.ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅꎻＢ.Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｏｆｃｏｎｓｅｒｖｅｄｍｏｔｉｆ
ｓꎻＣ.Ｄｅｔａｉｌｅｄｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｂｏｕｔｍｏｔｉｆｓ.ＥａｃｈｍｏｔｉｆｗａｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄｂｙａｃｏｌｏｕｒｅｄｂｏｘｎｕｍｂｅｒｅｄａｔｔｈｅｒｉｇｈｔꎬｔｈｅｓａｍｅｎｕｍｂｅｒｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｒｅｆｅｒｒｅｄｔｏｔｈｅｓａｍｅｍｏｔｉｆｉｎｆｉｇｕｒｅＢ.
２.２㊀不结球白菜ＢｃＭＡＸ１启动子的同源克隆与序列分析本试验克隆得到的ＢｃＭＡＸ１启动子全长为２００５ｂｐꎬ包含多个决定基因转录起始的ＴＡＴＡ￣ｂｏｘꎻ决定转录效率的ＣＡＡＴ￣ｂｏｘꎻ涉及干旱诱导的ＭＹＢꎻ５个光响应因子:３￣ＡＦ１ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ㊁ＣＡＧ￣ｍｏｔｉｆ㊁ＧＡ￣ｍｏｔｉｆ㊁ＴＣＣＣ￣ｍｏｔｉｆ和ＴＣＴ￣ｍｏｔｉｆꎻ以及４个顺式作用元件:ＡＲＥ㊁ＣＡＴ￣ｂｏｘ㊁ＧＣＮ４＿ｍｏｔｉｆ和ＴＣ￣ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｓꎻ除此之外ꎬ还有多个未知功能的ＭＹＢ和ＭＹＣ结合位点(表２)ꎮ
４４２
５４２㊀第２期张玮ꎬ等：不结球白菜分蘖调控基因ＢｃＭＡＸ１的同源克隆及功能分析
表２㊀ＢｃＭＡＸ１启动子基序分析
Ｔａｂｌｅ２㊀ＰｒｏｍｏｔｅｒｍｏｔｉｆａｎａｌｙｓｉｓｏｆＢｃＭＡＸ１
启动子基序Ｐｒｏｍｏｔｅｒｍｏｔｉｆ序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅ功能Ｆｕｎｃｔｉｏｎ
３￣ＡＦ１ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅＴＡＡＧＡＧＡＧＧＡＡ光响应元件Ｌｉｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ
ＡＲＥＡＡＡＣＣＡ厌氧反应必需的顺式调节元件ｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｔｈｅａｎａｅｒｏｂｉｃｉｎｄｕｃｔｉｏｎＡＴ~ＴＡＴＡ￣ｂｏｘＴＡＴＡＴＡ决定转录起始Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ
ＣＡＡＴ￣ｂｏｘＣＡＡＡＴ决定转录效率Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
ＣＡＧ￣ｍｏｔｉｆＧＡＡＡＧＧＣＡＧＡＣ光响应元件的一部分Ｐａｒｔｏｆｌｉｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔ
ＣＡＴ￣ｂｏｘＧＣＣＡＣＴ与分生组织表达相关的顺式调节元件ｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｒｅｌａｔｅｄｔｏｍｅｒｉｓｔｅｍｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ＥＲＥＣＡＡＣＡＧ
ＧＡ￣ｍｏｔｉｆＡＴＡＧＡＴＡＡ光响应元件的一部分Ｐａｒｔｏｆｌｉｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ
ＧＣＮ４＿ｍｏｔｉｆＴＧＡＧＴＣＡ参与胚乳表达的顺式调节元件ｃｉｓ￣ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｅｎｄｏｓｐｅｒｍｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ＭＢＳＣＡＡＣＴＧ参与干旱诱导的ＭＹＢ结合位点ＭＹＢｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｄｒｏｕｇｈｔ￣ｉｎｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ
ＴＣＣＣ￣ｍｏｔｉｆＴＣＴＣＣＣＴ光响应元件的一部分Ｐａｒｔｏｆｌｉｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ
ＴＣＴ￣ｍｏｔｉｆＴＣＴＴＡＣ光响应元件的一部分Ｐａｒｔｏｆｌｉｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ
ＴＣ￣ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｓＡＴＴＣＴＣＴＡＡＣ参与防御和应激反应的顺式作用元件ｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｄｅｆｅｎｓｅａｎｄｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓＭＹＢＣＡＡＣＡＧ
ＭＹＣＣＡＴＧＴＧ
ＭｙｂＣＡＡＣＡＧ
翻译英文怎么说２.３㊀不同生长时期不结球白菜组织中ＢｃＭＡＸ１的表达量
如图２所示:ＢｃＭＡＸ１在不同生长发育时期的不结球白菜 马耳头 和 苏州青 的根㊁茎㊁叶片和腋芽中均有表达ꎮ在３０ｄ( 马耳头 未发生分蘖)时ꎬＢｃＭＡＸ１在 马耳头 和 苏州青 各个组织中的表达量都很低ꎻ在５０ｄ( 马耳头 分蘖开始发生)时ꎬＢｃＭＡＸ１的表达量开始升高ꎬ且 马耳头 各个组织中的表达量均高于 苏州青 ꎻ在７０ｄ( 马耳头 分蘖期)时ꎬＢｃＭＡＸ１在 马耳头 和 苏州青 的各个组织中的表达量
ꎮ
均降到极低
图２㊀不同生长时期ＢｃＭＡＸ１在 马耳头 和 苏州青 不同组织中的相对表达量
Ｆｉｇ ２㊀ＲｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｃＭＡＸ１ｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｉｎ Ｍａｅｒｔｏｕ ａｎｄ Ｓｕｚｈｏｕｑｉｎｇ
ａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｗｔｈｓｔａｇｅｓ
∗∗Ｐ<０.０１.Ｔｈｅｓａｍｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ.
２.４㊀拟南芥过表达ＢｃＭＡＸ１表型观察及相关基因的表达分析
拟南芥进入生殖生长即抽薹开花之后ꎬ腋芽打破休眠发育为侧枝ꎮ由图３和图４－ａ可见：过表达ＢｃＭＡＸ１(ｐＴＣＫ３０３￣ＢｃＭＡＸ１)植株中莲座叶数目少于野生型植株ꎬ且只有主枝抽出ꎻ而野生型拟南芥中已经开始形成侧枝ꎬ说明ＢｃＭＡＸ１会抑制侧枝的发育ꎮ
对野生型植株和ＢｃＭＡＸ１过表达植株中的ＢｃＭＡＸ１及独角金内酯响应基因ＢｃＭＡＸ２和ＢｃＤ１４进行实时荧光定量分析发现ꎬ过表达植株中ＢｃＭＡＸ１表达量显著升高ꎬＢｃＭＡＸ２和ＢｃＤ１４的表达量比野生型显著提高(图４－ｂ ｄ)ꎮ
