作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(5): 777−782www.chinacrops/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@chinajournal
丁丁在刚果DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00777
糜子SAMS基因的克隆及其在干旱复水中的表达模式分析
林凡云1王士强1胡银岗1,2,*何蓓如1
(1西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌712100; 2陕西省农业分子生物学重点实验室, 陕西杨凌712100)
摘要：以糜子抗旱节水研究中获得的一个与S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因同源性较高的EST序列为基础, 采
用RT-PCR技术从糜子中分离到一个SAMS基因的全长cDNA序列(命名为PmSAMS), 全长1 293 bp, 编码396个氨
基酸, 具有SAMS典型的N端结构域、中间结构域及C端结构域。糜子、马铃薯、拟南芥、甜菜、大麦、荔枝、番
茄和水稻8种植物SAMS的氨基酸序列多重比较分析表明, 不同植物的SAMS的氨基酸相似程度非常高(92%~97%),
其中糜子与水稻的相似性最高(97%), 说明SAMS基因在植物进化中非常保守。PmSAMS基因在糜子幼苗干旱及复水
过程中的半定量RT-PCR表达模式分析表明, 在干旱早期(土壤含水量36%)诱导该基因大量表达, 而干旱程度更严重
时(土壤含水量为24%)其表达受到严重抑制, 表达量比对照还低; 严重干旱后复水2 h, 其表达量增强至干旱早期的
表达量, 而复水6 h后表达量降低至对照(干旱处理前)水平。可见, PmSAMS基因的表达涉及糜子响应干旱胁迫及干
旱后复水过程, 可能是糜子抗旱节水的关键基因。该基因的克隆为进一步探讨其应用于农作物抗旱节水性的遗传改
良奠定了基础。
关键词：糜子; S-腺苷甲硫氨酸合成酶; 干旱复水; 表达模式; 进化分析
Cloning of A S-Adenosylmethionine Syntheta Gene from Broomcorn Millet (Panicum miliaceum L.) and Its Expression during Drought and Re-Watering
LIN Fan-Yun1, WANG Shi-Qiang1, HU Yin-Gang1,2,*, and HE Bei-Ru1
裸考
(1 College of Agriculture, Northwest A & F University, Yangling 712100, Shaanxi; 2 Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture, Yangling 712100, Shaanxi, China)
Abstract: To explore more genes for the improvement of drought-tolerance and water u efficiency in plants, broomcorn millet (Panicum miliaceum L.) was ud to investigate the differential gene expression during drought stress and re-watering after ri-
ous drought stress by constructing SSH-cDNA library in previous study. A full-length cDNA of S-adenosylmethionine syntheta (SAMS) gene was amplified from broomcorn millet using PCR. The PCR primers were designed bad on an EST quence highly similar to SAMS gene in the SSH-cDNA library and the quences of SAMS genes from rice and barley. The full-length cDNA quence of SAMS gene amplified from broomcorn millet was 1 293 bp in length and designated as PmSAMS, encoding 396 amino acids with the 3 typical domains of SAMS (N terminal domain, inter domain and C terminal domain). Multiple align-ment analysis bad on the amino acids encoded by
some SAMS genes from broomcorn millet (P. miliaceum L.), potato (S. tube-rosum), Arabidopsis (A. thaliana), sugar beet (B. vulgaris), barley (H. vulgare), litchi (L. chinensis), tomato (L. esculentum), and rice (O. sativa) indicated that SAMS was very conrved among different species of plants with 92–97% of quence similarity of amino acids, and PmSAMS had the highest similarity with that of rice (97%). The expression patterns of PmSAMS during drought and re-watering after rious drought were investigated by means of mi-quantitative RT-PCR. The results showed that the ex-pressions of PmSAMS were great at the beginning of drought treatment (soil relative moisture of 36%), then declined under ri-
ous drought (soil relative moisture of 24%) to less than the normal level, and incread at 2 h after re-watering, declined to the
基金项目：西北农林科技大学科研基金面上项目(2006ZR013)；国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2006CB708208)
作者简介：林凡云(1975–), 女, 吉林白山人, 博士, 主要从事作物分子遗传育种研究, 现在江苏省农科院进行博士后研究。E-mail: fy_hw@
*通讯作者(Corresponding author)：胡银岗。E-mail: ; huyingang@nwsuaf.
edu
Received(收稿日期): 2007-09-17; Accepted(接受日期): 2007-12-16.
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normal level at 6 h after re-watering. The expression patterns of PmSAMS during drought and re-watering after rious drought indicated that it was involved in the respon of broomcorn millet to drought and re-watering and might be one of the key genes for drought tolerance and water u efficiency of broomcorn millet. The cloning of this gene provides the potential for its utiliza-tion in the improvement of drought-tolerance and water u efficiency in other plants.
Keywords: Broomcorn millet; S-adenosylmethionine syntheta; Drought and re-watering; Express profile; Phylogenetic analysis
糜子是一种抗逆性很强的作物, 具有耐旱、耐贫瘠等特点。它属C4植物, 光合速率较高, 干物质积累快, 水分利用效率高, 在C3植物完全停止干物质生产的水分条件下, 仍能进行干物质生产。随着全球缺水形势的日益严峻, 提高作物水分利用率, 对作物的抗旱节水性进行遗传改良, 已成为目前研究的一个热点。通过研究现有水分利用效率高的植物资源如糜子的抗旱节水机制, 并从中挖掘新的基因资源来改
良小麦、水稻、玉米等作物的水分利用效率是一条捷径。为了揭示糜子抗旱节水的分子基础, 我们利用抑制减法杂交技术(SSH)构建了糜子在干旱胁迫后复水过程与干旱胁迫下的SSH-cDNA文库[1-2]。通过分析发现, 其中一个编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的EST序列在干旱及复水两种处理间差异表达。
S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine syntheta, SAMS, EC 2.5.1.6)催化甲硫氨酸和ATP 反应生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM), 参与甲硫氨酸的生物合成, 甲硫氨酸是乙烯及多胺的前体[3], 还是DNA、RNA、蛋白、脂及植物次生代谢物的甲基供体, 是一种重要的中间代谢物质[4-5]。目前, 已有番茄、矮牵牛、烟草及盐地碱蓬等多种植物的SAMS基因被克隆[6-9]。序列比对分析表明, 这些基因的组成相对保守, 主要由一个基因家族编码[10]。研究表明SAMS基因受多种非生物胁迫诱导表达, 余涛等[8]在烟草中对两个SAMS基因的表达模式分析表明, SAMS1基因的表达受高温诱导增强, 而SAMS2基因的表达同时受氧化胁迫、盐胁迫及高温胁迫的诱导。Gupta等[11]的研究表明, 白杨树SAMS基因受高浓度CO2和O3诱导表达。Ma等[9]发现盐地碱蓬的SAMS2基因受NaCl、ABA及干旱胁迫的诱导。
本研究以从复水的SSH-cDNA文库中获得的糜子SAMS基因的EST序列为基础, 以该EST序列、水稻及大麦SAMS基因序列的保守区设计引物, 从糜子中克隆了SAMS基因的全长cDNA, 并对其结构特点及其在干旱和复水过程中的表达模式等进行了初步分析, 为进一步探讨糜子SAMS基因作为新的抗旱节水基因利用的可行性研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1植物材料及处理
盆栽西北农林科技大学保存的糜子抗旱种质印度790051, 幼苗生长期间保持土壤相对含水量在(75±5)%。幼苗4叶期停止浇水, 进行自然干旱处理, 并分别在土壤相对含水量为75%、36%和24%时取样。当土壤相对含水量达到24%时, 部分叶片已经卷曲, 出现严重萎蔫现象, 对幼苗进行复水处理, 复水时采取上浇、下渗的方式, 使其尽快恢复水分供应, 分别于复水后2、6、12 h取样。对照正常浇水(土壤相对含水量保持在75%左右)。样品于液氮中速冻, −70℃保存备用。
采用称重法测定土壤相对含水量, 土壤相对含水量(%)＝(土壤实际含水量/土壤最大毛细管持水量)× 100%。
1.2方法
1.2.1 总RNA的提取及cDNA的合成采用Trizol试剂盒(北京天根生化科技公司)提取总RNA, 用AMV反转录酶(大连TaKaRa公司)合成cDNA第一链(参照说明书)。
1.2.2 半定量RT-PCR分析根据获得的糜子与SAMS同源性较高的EST序列(GenBank收录号DW177307), 利用DNAMAN 5.2.2设计半定量RT-PCR分析引物, 正向引物为5′-GCTGCCAAGA GCAT
TGTT-3′, 反向引物为5′-TGATAAGCGTGA CAGACCA-3′。以糜子组成型表达的actin基因作为调整模板的内参(正向引物为5′-ACCGAAGCCCC TCTTAACCC-3′, 反向引物为5′-GTATGGCTGACA CCATCACC-3′, 参照文献[12])。PCR反应程序为95℃预变性3 min; 95 40 s, 55 45 s, 72 40 s, 35
℃℃℃
个循环; 72℃延伸8 min, 4℃保温。
1.2.3 糜子SAMS基因的全长cDNA克隆根据水稻(AJ495786)及大麦的SAMS基因序列(CAJ01705)设计一条兼并引物5′-AGATGGCYGMASTTGAWA CC-3′, 根据已分离的糜子SAMS基因的EST序列
第5期林凡云等: 糜子SAMS基因的克隆及其在干旱复水中的表达模式分析779
(DW177307)设计反向引物5′-TGAGGTCCACCGA TGACAAA-3′), 以糜子cDNA为模板分离糜子的全长SAMS基因。PCR反应程序为95℃预变性3 min;
写出一副春联
95 40 s, 55 40 s, 72 90 s, 35
℃℃℃个循环; 72℃延伸8 min, 4℃保温。
用Agaro Gel DNA Purification Kit(大连TaKaRa公司)试剂盒回收目标片段, 并与pGEM-T Easy载体(Promega, USA)连接, 转化感受态大肠杆菌JM109, 用蓝白斑筛选结合Sp6和T7引物菌落PCR筛选阳性克隆。用Sp6和T7引物进行双向测序(上海英骏生物技术有限公司)。将所测序列与已知糜子与SAMS基因同源性较高的EST序列拼接后获得糜子SAMS基因的全长cDNA序列。
1.2.4 序列的生物信息学分析利用NCBI (v)的BLAST在线分析工具分别对GenBank的非冗余核酸数据库和非冗余蛋白数据库序列进行比对分析。采用bi. v/)的ORF finder预测开放阅读框, 采用WoLF PSORT软件(wolfpsort.q.cbrc.jp/)在线进行亚细胞定位分析, NCBI的Blastp进行蛋白序列保守结构域分析, 采用ExPASy网站的Compute p I/MW tool (pasy/tools/pi_tool.html)计算蛋白质的等电点及分子量。采用DNAMAN5.2.2 (Lynnon Biosoft Corp.)进行序列多重比较及系统进化树构建。
2结果与分析
2.1糜子SAMS基因的克隆及分析
前期实验分离到与SAMS基因具有较高同源性的EST序列(DW177307)长576 bp, 位于该基因的3′端。根据水稻及大麦SAMS基因序列设计一条简并的上游引物, 根据DW177307设计下游引物, 以糜子叶片cDNA为模板, RT-PCR扩增到一个741 bp的片段, 经克隆测序后, 获得了糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基
因的5′序列, 将该序列与DW177307拼接获得1 293 bp的糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长cDNA, 命名为PmSAMS。该序列的最大读码框为1 188个核苷酸, 编码396个氨基酸(图1)。软件预测结果表明, 该蛋白的等电点为 5.50, 分子量为43 243.02 Da, 定位在细胞骨架里。结构域分析表明该编码蛋白具有S-腺苷甲硫氨酸合成酶典型的N端结构域、中间结构域和C端结构域(图2)。
2.2不同植物SAMS基因的多重比较
马铃薯(S. tuberosum, DQ235185)、拟南芥(A. thaliana, AC007138)、甜菜(B. vulgaris, AB221010)、大麦(H. vulgare, AM039896)、荔枝(L. chinensis,
图1糜子SAMS基因的编码区及推导的氨基酸序列
Fig. 1 The coding region and deduced amino acid quences of PmSAMS
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图2糜子SAMS基因的保守区分析
Fig. 2 Conrved domains of PmSAMS
AY259227)、番茄(L. esculentum, Z24742)、水稻(O. sativa, AJ296743)及糜子(P. miliaceum) 8种植物的SAMS基因的氨基酸序列的多重比较(图3)表明, 不同植物SAMS基因的相似程度非常高。
系统进化树分析(图4)显示, 这8种植物的SAMS基因氨基酸序列相似性非常高, 在92%~97%之间, 其中, 糜子与水稻的相似性最高, 达97%, 说明该基因在植物的进化中非常保守。
2.3糜子SAMS基因的表达模式分析
突然累了利用半定量RT-PCR对PmSAMS基因在不同水分处理条件下的糜子叶片中的表达进行了分析, 并利用GeneSnap软件分析了其相对表达量(图5)。半定量RT-PCR结果表明PmSAMS基因的大量表达受干旱和复水的诱导。PmSAMS在糜子正常生长(土壤
图38种植物的SAMS氨基酸序列的多重比对Fig. 3 Multiple alignment of SAMS from eight plants
第5期林凡云等: 糜子SAMS基因的克隆及其在干旱复水中的表达模式分析781
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图48种植物SAMS氨基酸序列的进化树Fig. 4 Phylogenetic tree bad on amino acid quence of
SAMS from eight plants
图5糜子SAMS基因在干旱胁迫和复水条件下的表达模式Fig. 5 The expression profiling of PmSAMS under drought
stress and re-watering
75%、36%和24%分别为土壤相对含水量, 2、6和12 h为复水后
的时间。
75%, 36%, and 24% were soil relative moisture content; 2, 6, and
12 h were the time after re-watering.
猪肚莲子汤>炖鸭子相对含水量为75%时)时有一定量的表达; 在干旱胁迫下(土壤相对含水量为36%时)表达量升高, 干旱胁迫非常严重时(土壤相对含水量24%)表达受到抑制, 表达量降低到比正常生长的表达量还低的水平; 在严重干旱复水后2 h, 该基因的表达量再一次升高, 随后降低至正常水平。糜子PmSAMS基因的表达高峰出现在干旱胁迫与严重干旱后复水的初期, 说明该基因主要参与糜子对干旱胁迫及复水处理的响应过程。
3讨论
S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是乙烯及多胺生物合成的甲基供体, 在体内主要起转甲基、转硫和转氨丙基的作用, 在医疗上主要用来治疗肝病、抑郁症、关节炎等多种疾病[13]。近年来的研究表明, 乙烯和多胺都参与了植物多种胁迫的抗逆反应, 因而认为SAM可能在植物的抗逆反应中发挥了一定的作用[3,5]。杨建昌等[14]研究发现, 在水分胁迫下叶片中多
胺含量的变化与品种的抗旱性有密切联系, 植物体内的多胺含量越高, 对水分胁迫的抗性就越强。陈坤明等[15]在对小麦在研究小麦多胺与抗旱性的关系中发现, 在植株复水后, 两个春小麦品种中的3种多胺(腐胺, 亚精胺, 精胺)含量均迅速升高, 说明多胺对水分状况变化的敏感性, 并暗示多胺可能在植株的伤害恢复中具有重要作用。
目前许多植物的SAMS基因已经被克隆, 分析表明SAMS是一个小的多基因家族, 其中一些基因组成性表达, 另一些基因的表达则受发育阶段或环境因素的严格控制[6,16-20]。长春花、拟南芥、番茄、水稻等植物SAMS基因研究表明该基因一般没有内含子, 5′不翻译区域有差别的8~13 bp对基因的转录和翻译有重要作用。拟南芥中有4个SAMS基因(www.arabidopsis), 其中2个(SAM1和SAM2)的蛋白编码序列相似性达97%, 在根和茎中表达量很高[17]。SAMS基因受多种胁迫诱导表达, 番茄至少有3个SAM基因, 其中SAM1和SAM3特异地受盐、甘露醇和ABA的诱导表达[6]; 长春花有4个SAM基因, 且所有SAMS基因在盐胁迫的幼苗中都诱导表达[18]; 水稻中SAMS基因在受水分胁迫时诱导表达[16]。余涛等[8]在烟草中克隆的一个SAMS的新基因, 在正常烟草植株中表达量极低, 但受乙烯利强烈诱导, 同时也受氧化胁迫、盐胁迫及高温胁迫的诱导。Gupta等[11]的研究表明白杨树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因受高浓度CO2和O3诱导表达。Ma等[9]发现盐地碱蓬的SAMS基因受NaCl胁迫的正调控, 酶活性检测表明NaCl胁迫条件下该酶的活性增强, 同时该基因的表达也受ABA及干旱胁迫的诱导。Oono 等[21]利用微阵列技术分析发现, 在拟南芥中SAMS 基因的表达受复水的诱导。
在我们构建的复水文库中, 共出现了3个与SAMS基因同源性较高的EST序列(GenBank收录号分别为DW177274、DW177307和DW177331), 出现频率较高。依据其中的一个EST序列, 克隆到一个糜子SAMS基因的cDNA全长(PmSAMS), 半定量RT-PCR分析表明该基因受干旱胁迫和复水的诱导。这些结果与上述相关研究的结果一致, 因而推测该基因可能是糜子抗旱与水分高效利用的关键功能基因, 可以利用它转化小麦、玉米等植物, 提高其抗旱性和水分利用效率。目前正在构建该基因的过量和
