生态毒理学报
相信未来作文Asian Journal of Ecotoxicology
第16卷第1期2021年2月
V ol.16,No.1Feb.2021
一篇日记100字
㊀㊀基金项目：国家自然科学基金资助项目(31860155)；云南省农业联合面上项目(2017FG001(-040))；西南地区林业生物质资源高效利用国家
林业和草原局重点实验室开放基金资助项目(2019-KF13)
㊀㊀第一作者：陈修才(1995 )，男，硕士研究生，研究方向为土壤生态毒理学,E -mail:*****************㊀㊀*通讯作者(Corresponding author ),E -mail:*********************
DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20200929002
陈修才，周世萍，李惠娟，等.一种基于蚯蚓学习行为的神经毒性实验方法研究[J].生态毒理学报,2021,16(1):119-125
Chen X C,Zhou S P,Li H J,et al.An experimental method of neurotoxicity bad on earthworm learning behavior [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2021,16(1):119-125(in Chine)
加菲猫怎么养一种基于蚯蚓学习行为的神经毒性实验方法研究
陈修才，周世萍*，李惠娟，解思达，熊张平，杨广斌，朱鑫泽
西南地区林业生物质资源高效利用国家林业与草原局重点实验室(西南林业大学)，昆明650224收稿日期:2020-09-29㊀㊀录用日期:2020-12-20
摘要：土壤生物的学习行为是一种综合性的神经高级活动，对土壤中的神经毒性污染物生态风险监测具有重要价值㊂本研究设计了一套试验装置，基于蚯蚓对白光刺激的厌恶本性，通过振动-白光配对刺激，对蚯蚓进行学习训练，使蚯蚓领会借助加速移动阻止白光刺激的策略，通过蚯蚓到达移动位移阈值的时间测定，对蚯蚓的学习行为进行测试，建立了蚯蚓的学习行为测试方法㊂采用建立的测试方法，对土壤中东莨菪碱和毒死蜱诱导下蚯蚓的学习行为进行了测试，结果表明,1~3mg ㊃kg -1东莨菪碱与4~12mg ㊃kg -1毒死蜱污染处理均对蚯蚓的学习能力造成了损伤，污染浓度越高，蚯蚓的学习能力损伤越严重㊂该测试方法可以快速有效地检测土壤污染导致的蚯蚓学习行为变化，有望用于低浓度神经毒性农药污染土壤的神经毒性快速诊断㊂
关键词：土壤污染；蚯蚓；神经毒性；学习行为；土壤环境质量；诊断方法
文章编号:1673-5897(2021)1-119-07㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:A
An Experimental Method of Neurotoxicity Bad on Earthworm Learning Behavior
Chen Xiucai,Zhou Shiping *,Li Huijuan,Xie Sida,Xiong Zhangping,Yang Guangbin,Zhu Xingze
Key Laboratory of State Forestry Administration on Highly -Efficient Utilization of Forestry Biomass Resources in Southwest China (Southwest Forestry University),Kunming 650224,China
Received 29September 2020㊀㊀accepted 20December 2020
Abstract :The learning behavior of soil organisms is a kind of comprehensive neural higher activity,which is of great value to the ecological risk monitoring of neurotoxic pollutants in soil.In order to establish learning behavior test method of earthworm,a t of test apparatus was designed in this paper bad on earthworm dislike of white light stimulation.Earthworms were trained to understand the strategy of preventing white light stimulation with fast moving through the vibration -white light pairing stimulus.Earthworm learning behavior was tested by determina -tion of the time of earthworm arriving movement displacement threshold.Using the established test method,earth -worms learning behavior was tested under the influence of scopolamine and chlorpyrifos in soil.The results showed that the learning ability of earthworms was damaged by 1~3mg ㊃kg -1scopolamine and 4~12mg ㊃kg -1
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㊀生态毒理学报第16卷
chlorpyrifos in soil.The higher the pollution concentration was,the more rious the learning ability of earthworms was damaged.This test method could quickly and effectively detect the change of earthworm learning behavior caud by soil pollution,and was expected to be ud for the rapid diagnosis of neurotoxicity of low-concentration neurotoxic pesticides in contaminated soil.
Keywords:soil pollution;earthworm;neurotoxicity;learning behavior;soil environmental quality;diagnosis method
㊀㊀农业土壤环境质量状况的正确诊断和评价，是土壤污染管控修复，逐步改善土壤环境质量，保持土壤生态系统良性循环的重要管理依据㊂由于土壤性质和污染物种类的复杂多变，对土壤环境健康质量的诊断和评价，必须同时考虑土壤微生物㊁土壤动物和植物的异常变化㊂蚯蚓作为土壤动物区系的代表类群，利用蚯蚓生物标志物评价污染物对土壤环境的危害，从而对土壤健康质量进行诊断和评价已成为环境研究领域较受关注的研究热点之一[1-5]㊂由于有机磷和拟除虫菊酯类多数农药污染物均具有神经毒性，污染土壤的神经毒性可直接影响蚯蚓等土壤动物的神经行为状况，这种神经行为变化也可以反映土壤的健康质量状况㊂与乙酰胆碱酯酶这类神经毒性生理生化标志物相比，神经行为标志物的优点在于研究过程中可以对同一受试动物反复进行测试，同时研究可以涵盖神经损伤的开始㊁发展
及恢复整个过程[6]㊂学习行为是动物通过实践获得新信息从而改变之后的行为模式，是一种综合性的神经高级活动㊂动物的学习行为受神经系统支配，是一项比较敏感的行为指标，通过测试学习行为的功能变化，能够有效评价污染物对土壤动物的神经毒性及潜在危害，对土壤健康质量诊断评价具有重要的研究意义和应用价值㊂
在动物界所有的类群中，从单细胞动物到脊椎动物都存在学习过程㊂虽然蚯蚓的脑容量较小，但研究表明蚯蚓具备一定的学习能力㊂Yerkes[7]首次通过实验证实了蚯蚓(Allolobophora foetida)的学习行为，随后的研究也表明，陆正蚓(Lumbricus terres-tris)和赤子爱胜蚯蚓(Einia foetida)等不同种属的蚯蚓均具备一定的学习能力[8-12]㊂目前常用的蚯蚓学习行为测试方法是迷宫实验，但该方法需要对蚯蚓进行大量训练，耗时较长，且训练和测试过程容易受蚯蚓分泌物的信息诱导，影响测试结果的准确性[12]，难以满足对土壤健康质量进行快速有效诊断的要求㊂有研究表明，蚯蚓对红光不敏感，厌恶白光，可以通过振动与白光的配对刺激诱导蚯蚓的学习行为[13]，但如何利用蚯蚓的学习行为，对污染土壤的健康质量进行快速诊断，目前尚缺乏灵敏有效的测定方法㊂
针对此问题，本研究设计了一套试验装置，以红光作为照明光源，通过振动与白光配对刺激，对蚯蚓的学习行为进行诱导，在此基础上，通过对测定条件进行优化，建立了蚯蚓学习行为的测定方法，希望该方法能够应用于土壤神经毒性污染物的快速诊断，为农业土壤环境健康质量的诊断评价提供可行的测定方法㊂
1㊀材料与方法(Materials and methods)
1.1㊀实验装置
实验装置为自制的学习行为测试装置(图1)㊂测试盒容积为45cmˑ45cmˑ25cm㊂为便于观察和透气，测试盒为单面敞开的半封闭式结构，测试台位于测试盒底部，为模拟蚯蚓在土壤中的移动环境，测试台铺设有圆形凸起(凸起高度为0.5cm；相邻凸起点的距离为3cm)的塑胶垫，塑胶垫面积为40cm
ˑ
图1㊀蚯蚓学习行为的测试装置示意图Fig.1㊀Testing t for learning behavior of earthworm
第1期陈修才等：一种基于蚯蚓学习行为的神经毒性实验方法研究121
㊀
40cm；测试台底部设有振动马达，振动频率为180
Hz；测试台上方安装功率均为3W的红色灯和白炽
灯各1个，及可以定时控制的喷雾装置(喷雾量20
mL㊃h-1)㊂其中，白炽灯安装于箱体顶部的中心位
置，距白炽灯安装位置左右各1cm处，分别安装红网络智能
色灯和喷雾装置㊂安装后的红色灯和白色灯距测试
顺治和董鄂妃
台20cm，测试时将蚯蚓放置于测试台的中心位置,
红色灯作为测试的照明光源，白炽灯提供测试所需
的白光刺激㊂
1.2㊀实验材料
供试生物为云南红河地区采集的皮质远盲蚓
(Amynthas corticis)，培养条件为：温度20ħ；土壤含
水量为田间最大持水量60%㊂挑选2~3月龄，体
质量0.4~0.5g，具有成熟环带的健康蚯蚓作为实验
蚯蚓㊂
供试试剂：东莨菪碱(纯度>98%)与毒死蜱(纯
度>98%)购自美国Sigma公司㊂
供试土壤：土壤采自昆明市官渡区农田2~15
cm耕作层㊂在采样地设5个采样点，取样后充分混
合，得到实验用土样㊂土样风干后过1mm筛备用㊂
土壤类型为红壤，质地为粘壤土,pH为6.35，有机质
含量为14.75g㊃kg-1，阳离子交换量为9.8cmol㊃
kg-1，土壤经分析未检出毒死蜱和东莨菪碱㊂
1.3㊀蚯蚓学习行为测定方法建立
啫喱眼霜蚯蚓学习行为测定在暗室中进行㊂该方法是基
于蚯蚓对白光刺激的厌恶本性，采用自制的测试装
置，通过振动-白光配对刺激训练，使蚯蚓学习领会
借助加速运动阻止白光刺激的策略㊂为实现上述目
的，需要进行下列测试条件优化㊂
1.3.1㊀移动位移阈值确定
移动位移阈值是蚯蚓学习行为测定的关键㊂为
了获得蚯蚓移动位移阈值的最佳参数，在多次预实
验的基础上，筛选出可能的蚯蚓移动位移阈值6㊁8㊁
9㊁10和12cm，将其设定为测试条件，对其进行测
试㊂设置4个测试组，每组10条蚯蚓，每次测试时,
将1条蚯蚓放置于测试台，开启红色照明灯，适应
10min后对其分别进行振动㊁白光刺激各30s，测定
蚯蚓头部运动距离达到移动位移设定值的次数，根盛世领墅
据测定数据计算蚯蚓头部运动距离达到移动位移阈
值的到达率(A)，计算公式为:
A=B
Cˑ100%
式中:B为30s振动或光照刺激时蚯蚓头部运动距离达到各移动位移设定值的次数;C为30s振动或光照刺激时蚯蚓头部运动距离达到各移动位移设定值的次数总和㊂
1.3.2㊀蚯蚓学习行为测定条件优化
对蚯蚓的学习行为测定是通过30s振动与30s 白光配对刺激进行，在多次预实验的基础上，发现影响蚯蚓学习行为测定的条件主要有休息恢复时间和学习周期，需要对这2个条件进行优化㊂
(1)休息恢复时间
根据预实验筛选出可能的休息恢复时间为6㊁7㊁8㊁9和10min，将其分别设定为休息恢复条件，每个条件设4个重复组，每组10条蚯蚓，对其进行条件优化㊂测试时，将1条蚯蚓放置于测试台，开启红色照明灯，适应10min后对其进行包括30s振动/ 30s白光/30s振动/30s白光/30s振动/30s白光的1个周期学习测试㊂测试期间对蚯蚓的移动进行监控，如振动刺激期间，蚯蚓头部运动距离达到或超过移动位移阈值，则随后的白光刺激不出现，但振动刺激仍然持续；如白光刺激期间，蚯蚓头部运动移动达到或超过移动位移阈值，则立即关闭照明灯，停止白光刺激，待下一个振动刺激开始时继续进行循环刺
激学习㊂分别测定每次振动和白光刺激时，蚯蚓头部运动距离达到或超过移动位移阈值的所需时间；学习结束后按照设置的休息条件进行恢复，再对蚯蚓进行学习测试(测试条件同上)㊂
(2)学习周期
每个学习周期包括30s振动/30s白光/30s振动/30s白光/30s振动/30s白光，在预实验的基础上，筛选出1㊁2㊁3和4个学习周期作为学习条件，每个条件设4个重复组，每组10条蚯蚓㊂每个学习周期结束后，应按照(1)优化的休息恢复时间，让蚯蚓进行休息恢复后再进行下一周期的学习㊂休息期内关闭振动及白光，打开喷雾器进行喷雾待休息结束关闭㊂分别测定各训练周期内蚯蚓每次振动和光照刺激期间，头部运动距离达到或超过移动位移阈值的所需时间，根据测定数据，对学习周期进行优化㊂
1.3.3㊀蚯蚓的学习行为测定
东莨菪碱是动物学习障碍模型造模的代表药物[13]，因此，利用东莨菪碱和具有神经毒性的毒死蜱农药[14]对测定方法进行了验证㊂在蚯蚓未表现出回避反应的浓度范围内分别设置3个浓度梯度：东莨菪碱处理组(1㊁2和3mg㊃kg-1)㊁毒死蜱处理组(4㊁8
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㊀生态毒理学报第16卷
和12mg㊃kg-1)，按照实验土壤设计浓度计算东莨菪碱需要量，准确称量后将所需试剂用丙酮溶解后，搅拌混匀于20g土壤中，待丙酮完全挥发后(无丙酮气味)再与480g土壤混匀，放入500mL培养瓶内，加入蒸馏水将土壤含水量调节为土壤田间最大持水量的60%㊂将清肠处理后的蚯蚓随机放入东莨菪碱处理和毒死蜱各浓度处理组中，每组放入10条蚯蚓，以保鲜膜封口(预留换气孔)㊂在温度为24ħ㊁湿度为60%条件下培养，以丙酮空白为对照组，每个浓度及对照设4个重复㊂染毒处理1d后取出蚯蚓，采用本研究的测试装置及建立的蚯蚓学习行为测定方法，对蚯蚓的学习行为进行测定㊂
1.4㊀数据统计与分析
采用SSPS13.0软件(SPSS Inc.)进行单因素方差分析和多重比较，对组间数据进行差异显著性分析，数据结果用meanʃSD的形式表示㊂
2㊀结果(Results)
2.1㊀蚯蚓移动位移阈值确定
蚯蚓到达不同移动位移设定阈值的到达率(A)如图2所示，振动和白光刺激条件下,A均随着阈值设定值的增加而下降；相同设定阈值条件下，白光刺激条件下的A值均高于振动刺激的到达率，当设定阈值为9cm时，白光刺激条件下蚯蚓的A值显著高于振动刺激条件下的A值(P<0.05)，而其他设定阈值条件
下，白光刺激时蚯蚓A值与振动刺激的A值均不存在显著差异(P>0.05)，但设定阈值达到或超过10cm时，蚯蚓在振动和白光刺激条件下的A值均呈现显著下降，原因可能与此阈值设定过高，振动或白光刺激时蚯蚓移动均难以达到有关㊂本研究选择移动位移设定值9cm作为移动位移阈值㊂
2.2㊀休息恢复时间对蚯蚓学习行为的影响
不同休息恢复时间对蚯蚓的学习影响如图3所示，恢复时间为5~6min，休息恢复后蚯蚓学习测试的到达移动位移阈值时间，显著高于恢复前学习测试的到达位移阈值时间(P<0.05)；恢复时间为7~9 min，休息恢复后蚯蚓学习测试的到达位移阈值时间，与恢复前蚯蚓学习测试的到达位移阈值时间并无显著差异(P﹥0.05)，表明蚯蚓经过7~9min的休息后，体力已基本恢复，本研究选择7min作为蚯蚓的休息恢复时间㊂
2.3㊀学习周期对蚯蚓学习行为的影响
不同学习训练周期对蚯蚓学习行为的影响如图4所示㊂随着学习训练周期增加，蚯蚓的移动速度加快，到达移动位移阈值的时间不断缩短，当学习训练达到3个周期时，蚯蚓到达移动位移阈值的时间已显著低于训练1~2个周期的到达移动位移阈值时间(P<0.05)，但学习训练3个周期后，蚯蚓到达移动位移阈值的时间已基本稳定，与学习训练4个周期的蚯蚓到达移动位移阈值时间无显著差异(P﹥0.05)，本研究选择3个训练周期作为蚯蚓的学习训练条件
㊂
图2㊀不同移动设定阈值对蚯蚓到达率(A)的影响注：直柱上方a表示同一设定阈值条件下，蚯蚓振动与白光刺激到达设定阈值的到达率(A)差异显著(P<0.05)㊂
Fig.2㊀Influence of the pret threshold value on the
reaching rate(A)of earthworm
Note:The letter a above the column indicated that under the
same threshold condition,the arrival rate of earthworm vibration
and white light stimulation reaching the t threshold(A)was
significantly different(P
<0.05).
图3㊀不同休息恢复时间对蚯蚓学习行为的影响
注：直柱上方a表示休息恢复后的蚯蚓到达移动位移阈值
时间与休息前存在显著差异(P<0.05)㊂
Fig.3㊀Influence of recovery time on earthworm s
learning behavior
Note:The letter a above the column indicated that there was a significant difference in the time of earthworm reaching the threshold of
displacement after rest compared with that before rest(P<0.05).
第1期陈修才等：一种基于蚯蚓学习行为的神经毒性实验方法研究123
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图4㊀不同学习周期对蚯蚓学习行为的影响
注：直柱上方具有相同字母表示不同训练
周期组间蚯蚓到达移动位移阈值的时间差异不显著,
不同字母表示差异显著(P<0.05)㊂
Fig.4㊀Influence of training period on earthworm s
learning behavior
Note:The same letters above the column indicated that there was no significant difference in the time of earthworm reaching the displacement threshold between different training periods,but the different letters indicated that there was significant difference(P<0.05).
2.4㊀蚯蚓的学习行为测定
国庆促销
采用本研究建立的蚯蚓学习行为测定方法，对东莨菪碱和毒死蜱暴露1d后的蚯蚓学习行为进行了测定，结果如图5所示㊂东莨菪碱和毒死蜱不同暴露浓度组中蚯蚓到达移动阈值的时间均显著高于对照
组，随着东莨菪碱和毒死蜱暴露浓度的增加，蚯蚓到达移动阈值的时间显著增加，表明东莨菪碱和毒死蜱处理均导致了蚯蚓的学习能力下降，暴露浓度越高，对蚯蚓的学习行为损伤越严重㊂
3㊀讨论(Discussion)
污染物的毒性可直接影响土壤动物的行为，这种行为变化对污染物的毒性具有指示作用，因此可以通过土壤动物的行为变化来监测㊁评价污染物的生态风险㊂学习行为是动物借助于个体生活经历和经验使自身的行为发生适应性变化的过程，是一种综合性的神经高级活动，对土壤污染物神经毒性的生态风险监测具有重要价值，但由于缺乏蚯蚓学习行为测定的有效方法，在土壤生态毒性的监测评价中应用较少㊂
目前动物学习行为的测定主要采用迷宫实验方法[15-19]，这种测定方法主要测试的是动物的空间识别学习能力㊂采用这种方法对蚯蚓进行学习行为测试时，由于测试过程中蚯蚓会产生分泌物，蚯蚓在空间识别学习时会受到分泌物的信息干扰,
需要对测
图5㊀不同污染处理对蚯蚓学习行为的影响
注：直柱上方不同小写字母表示不同处理组间蚯蚓到达移动阈值时间差异(P<0.05)㊂
Fig.5㊀Influence of recover procedures on earthworm s learning behavior
Note:Different lowerca letters above the column indicated that there was significant difference in the time of earthworm
reaching the displacement threshold between different treatment groups(P<0.05).
