•486•毒理学杂志2020年12月第34卷第6期J Toxicol December2020Vol.34No.6中图分类号：R54文献标识码：A 文章编号：1002-3127(2020)06-0486-06•实验研究•
东罠君碱下调miR-15b的表达对缺氧/复氧损伤
H9C2心肌细胞功能的影响
王红灵'，刘舒萍S赵冀安，
(1.山东师范大学临床实验室，山东济南250013；2.济南市中心医院临床实验室，山东济南250013；
3.河北医科大学第一医院肝胆外科，河北石家庄050050)
【摘要】目的探讨东蔑蓉碱(scopolamine,Sco)是否通过调控微小RNA-15b(miR-15b)的表达从而影响缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞增殖、凋亡及氧化应激。方法体外培养大鼠心肌细胞H9C2，随机分为对照组、H/R组、H/R+
0.1jimol/L Sco组、H/R+1jimol/L Sco组、H/R+10»mol/L Sco组、H/R+Sco+miR-con组和H/R+Sco+miR-15b组。甲基
囉瞠基四l^(MTT)检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞凋亡率；检测丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)与肌酸激酶
(CK)的水平；实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-15b的表达量.结果H/R处理后可抑制细胞增殖及促进细胞凋亡(P<0.05)，增高MDA、LDH、CK水平及miR-15b的表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)，而Sco处理后可明显降低H/R对心肌细胞增殖、凋亡及氧化应激的作用；miR-15b过表达可明显降低Sc。对H/R诱导的心肌细胞增殖、凋亡及氧化应激的作用。结论Sc。可能通过下调miR-15b的表达而促进H/R诱导的心肌细胞增殖及抑制细胞凋亡、氧化应激。
【关键词】东黄若碱；MiR-15b；缺氧/复氧；心肌细胞；增殖；凋亡；氧化应激
Effects of scopolamine on the function of H9C2cardiomyocytes injured by hypoxia/reoxygenation by down-regulating the expression of miR-15b
WANG Hong-ling1,LIU Shu-ping2,ZHAO Ji-an3
(1.Clinical Laboratory of Shandong Normal University,Jinan Shandong250013,China；
2.Clinical厶aboratory of Jinan Central Hospital,Jinan Shandong250013,China；
3.Department of
Hepatobiliary Surgery,the First Hospital of Hebei Medical University,Shiji a zhuang Hebei050050,China) [Abstract]Objective To investigate whether scopolamine(Sco)can affect the proliferation,apoptosis and oxidative stress of H/R-induced cardiomyocytes by regulating the expression of miR-15b.Methods Rat cardiomyocyte cell line H9C2was cultured in vitro and randomly divided into control group,H/R group,H/R+0.1p,mol/L Sco group,H/R+1|xmol/L Sco group,H/R+10|xmol/L Sco group H/R+Sco+miR-con group,and H/R+Sco+miR-15b group.MTT was ud to detect cell proliferation.Flow cytometry was ud to detect the apoptotic rate.The levels of MDA,LDH and CK were detected.RT-PCR was ud to detect the expression of miR-15b.Results H/R treatment could inhibit cell proliferation and promote cell apoptosis(P<0.05),increa the levels of MDA,LDH,CK and the expression level of miR-15b(P<0.05),while Sco treatment could significantly reduce H/R Effect on cardiomyocyte proliferation,apoptosis and oxidative stress.Overexpression of miR-15b could significantly reduce the effects of Sco on the proliferation,apoptosis and oxidative stress of cardiomyocytes induced by H/R.Conclusion Sco may promote H/R-induced myocardial cell proliferation and inhibit apoptosis and oxidative stress by down-regulating the expression of miR-15b.
[Key words]Scopolamine；MiR-15b；Hypoxia/reoxygenation；Cardiomyocytes；Proliferation；Apoptosis；Oxidative stress
急性心肌梗死是临床常见的一种心血管疾病，其具有高病发率与死亡率，而心肌缺血再灌注损伤是诱发心血管疾病的重要原因之一，因而如何减轻心肌细
基金项目：河北省卫生和计划生育委员会课题项目(20150634)
作者简介：王红灵，副主任检验师，研究方向：临床实验。
通讯作者：刘舒萍，副主任医师.研究方向：医学实验诊断、胞缺血再灌损伤成为研究重点，研究表明心肌细胞凋亡与氧化应激反应在心肌缺血再灌注损伤的发生过程中发挥重要调控作用(切。因而如何抑制心肌细胞凋亡及氧化应激成为研究热点问题。近年来，研究发现微小RNA(microRNA,iniRNA)在缺氧/复氧(Hypoxia/ Reoxygenation,H/R)诱导的心肌细胞中表达异常并可能参与心肌缺血再灌注损伤的发生过程，进一步研究
毒理学杂志2020年12月第34卷第6期J Toxicol December2020Vol.34No.6•487•
发现多糖类化合物可能通过调控nuRNA的表达而保护心肌缺血再灌注损伤的细胞"⑷。相关报道指出，东萇若碱(scopolamine,Sco)可促进脑缺血再灌注损伤后脑功能的恢复，但关于其具体作用机制尚未完全阐明⑸。研究表明抑制微小RNA-15b(microRNA-15b, miR-15b)的表达后心肌细胞凋亡率明显降低，并可减轻心肌缺血再灌注损伤⑹。因此，本研究采用H/R诱导心肌细胞建立心肌细胞损伤模型，无法启动此程序
探讨Sco对H/R 诱导的心肌细胞增殖、凋亡及氧化应激的影响，探究Sco对miR-15b的调控作用，旨在探究Sco是否通过调控miR-15b的表达从而减轻心肌缺血再灌损伤。
1材料与方法
1.1材料与试剂Sco购自成都第一药业有限公司(国药准字号:H51022594)；大鼠心肌细胞H9C2购自美国ATCC细胞库；杜氏改良培养基(DMEM)、胎牛血清、Opti-MEM减血清培养基购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自美国Thermo Fisher公司；Lipofectamine2000与Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；反转录与实时荧光定量PCR试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；miR-15b寡核昔酸模拟物(miR-15b mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-con)购自广州锐博生物科技有限公司；甲基嗟醴基四哇(methylthiazolyl tetrazolium,MTT)与二甲基亚砚，(dimethylsulfoxide, DMSO)购自美国Sigma公司；膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氤酸荧光素(FITC)/碘化丙(®(PI)细胞凋亡试剂盒、二座咻甲酸(bicinchoninicacid,BCA)蛋白定量检测试剂盒、RIPA裂解液购自北京全式金生物技术有限公司；丙二醛(malondialedhyde,MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogena,LDH)与肌酸激酶(Creatine Kina,CK)检测试剂盒购自北京中生生物工程高技术公司；兔抗鼠B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide3-kina, PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(phospho-PI3K, p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kina B,Akt)、磷酸化蛋白激酶B(phospho-Akt,p-Akt)
抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自美国Abeam公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养：心肌细胞H9C2培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37X.、体积分数5%CO2培养箱进行培养，每隔24h更换1次培养液，待细胞生长至80%融合度时，使用0.25%胰蛋白酶消化，细胞传代培养。
1.2.2实验分组：取对数生长期心肌细胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基制备细胞悬液，调整细胞密度为5X104个/ml，接种于96孔板(100口/孔)，置于37咒、体积分数5%CO2培养箱培养24h，待细胞生长至90%融合度时进行H/R 处理：将培养液更换为不含血清的DMEM培养基，置于37t、95%弘、体积分数5%CO2培养箱缺氧处理21h，更换培养液为含有10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37弋、体积分数5%CO2培养箱复氧处理6h t7]0取细胞状态良好且细胞生长至90%融合度的心肌细胞，随机分为对照组(加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基，正常培养的心肌细胞)、H/R组(缺氧/复氧处理的心肌细胞)、H/R+0.1|xmol/L Sco组(浓度为0.1jimol/L的Sco处理心肌细胞后进行缺氧/复氧处理)、H/R+1|xmol/L Sco组(浓度为1“mol/L的Sco处理心肌细胞后进行缺氧/复氧处理)、H/R+10jimol/L Sco组或H/R+Sco组(浓度为10p-mol/L的Sco处理心肌细胞后进行缺氧/复氧处理)2、H/R+Sco+miR-con组(miR-con转染至心肌细胞48h，浓度为l/L的Sco处理心肌细胞后进
行缺氧/复氧处理)、H/R+Sco+miR-15b组(miR-15b mimics转染至心肌细胞48h，浓度为l/L的Sco 处理心肌细胞后进行缺氧/复氧处理)。
1.2.3MTT检测细胞增殖：取对数生长期心肌细胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基制备细胞悬液，调整细胞密度为5x10"个/ml，按照每孔100|xl的密度接种于96孔板，按照章节1.2.2实验分组处理，每组设置3个复孔，每孔加入质量浓度为5mg/ml的MTT试剂20)xl，继续培养4h，弃旧培养基，每孔加入150»1DMSO，应用酶标仪检测各孔在波长为490nm处的吸光度(人)值。实验重复3次。
1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡率：收集各组心肌细胞，预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，4T条件下经3000r/min转速离心6min，弃上清，预冷PBS再次洗涤，相同条件下离心后弃上清，加入500M结合缓冲液，收集细胞沉淀，加入5“1Annexin V-FITC与5山碘化丙®(PI)，充分混匀，室温振荡孵育10min，应用FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)检测各组心肌细胞凋亡率。
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1.2.5检测MDA.LDH和CK水平：收集各组心肌细胞培养上清液，4°C条件下经2500r/min转速离心10min，收集上清，采用酶动力学法检测LDH和CK的水平，采用硫代巴比妥酸法检测MDA的水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.2.6实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）检测细胞中miR-15b的表达水平：收集各组心肌细胞，采用Trizol法提取细胞中的总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度与纯度。反转录体系：5x g DNA缓冲液2|xl,lOxKing RT缓冲液2p.1,FastKing RT Enzyme Mix 1|xl,FQ-RT Primer Mix2|il,RNA（2|xg）,RNa-Free ddH2O补足体系至20jil；反应条件：42T15min, 95咒3min o总RNA可反转录为cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR反应。miR-15b正向引物5'-CGATCTGACTGACTACGTAGCT-3，，反向弓I物5，-TACGCTAGCTGGGAGGAGAT-3，；U6正向弓I物5，-GCTTCGGCAGCACATA TACT-3，，反向弓I物：5，-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC3，弓I物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。qRT-PCR扩增反应体系:10x PCR缓冲液 2.5|xl,MgSO4 2.5|xl,dNTPs 2.5pl，正反向引物各0.5»l,cDNA2|xl,RNa-Free dd比0补足体系至25M；反应条件：95t预变性5min,95%：变性30s,60弋退火30s,72P延伸30s，共40次循环。miR-15b以U6为内参，采用2_Aic，法计算miR-15b相对表达量。
1.2.7蛋白免疫印迹（Western blot）检测Bax、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、PI3K和Akt蛋白表达：收集各组心肌细胞，加入400p.1RIPA裂解液，冰上孵育30min,4£条件下经3000r/min转速离心10min，吸取上清液（总蛋白）。采用BCA法检测蛋白浓度，向蛋白样品中加A5XSDS上样缓冲液，沸水煮10min，蛋白变性。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，转膜，封闭，加入一抗稀释液（Bax、Bcl-2与内参P-actin稀释比：1:1OOO；p-PI3K、p-Akt、PI3K和Akt稀释
比：1：800）,4乜孵育过夜，TBST洗涤，加入二抗稀释液（1：5000）后室温孵育1h，加入ECL，暗室内曝光显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。
1.3统计学方法采用SPSS21.0统计学软件分析数据，计量资料以伍土s）表示且均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。2结果
2.1不同浓度Sco对缺氧/复氧损伤心肌细胞增殖的影响MTT检测不同浓度Sco对缺氧/复氧损伤心肌细胞增殖的影响，结果显示，H/R组与对照组比较心肌细胞活力差异有统计学意义（P<0.05）；H/R+ l/L Sco组、H/R+l/L Sco组、H/R+ 10p-mol/L Sco组与H/R组比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中Sco浓度为10|xmol/L时作用效果较为明显，因而选用浓度为10pcmol/L的Sco进行后续研究，见表lo
表1不同浓度Sco对缺氧/复氧损伤心肌
细胞增殖的影响（x±s）
分组4值
~对照组 1.07±0,14~ H/R0.46±0,05•
H/R+0.1|imol/L Sco0.56±0.07*
煤液化
H/R+l p,mol/L Sco0.72±0.09#
H/R+10|xmoI/L Sco0.91±0.12*
注：H/R：缺氧/复氧；与对照组比较，*P<0.05；与H/R组比较，*P<0.05；n=9o
2.2Sco对缺氧/复氧损伤心肌细胞凋亡的影响流式细胞术检测Sco对缺氧/复氧损伤心肌细胞凋亡的影响，结果显示，H/R组与对照组比较，心肌细胞凋亡率差异有统计学意义（P<0.05）；H/R+Sco组与H/R 组比较心肌细胞凋亡率差异有统计学意义（P<0.05），见图1和表2。Western blot法检测细胞凋亡蛋白表达，结果显示，H/R组与对照组比较心肌细胞中Bax、Bcl-2蛋白水平差异有统计学意义（P<0.05）；H/R+ Sco组与H/R组比较心肌细胞中Bax,Bcl-2蛋白水平差异有统计学意义（P<0.05），见图2和表2。说明H/R可促进细胞凋亡，而Sco可抑制H/R诱导的细胞凋亡。
表2Sco对缺氧/复氧损伤心肌细胞凋亡的影响（丘土s）
分组凋亡率
凋亡相关蛋白表达量
Bax/3-actin Bcl-2/p-actin 对照组 3.58±0.310.23±0.040.86±0.09 H/R33.41±3.65*0.91±0.08*0.17±0.03* H/R+Sco7.64±0.79*0.37±0.05*0.71±0.08*注：与对照组比较，°P<0.05；与H/R组比较,"P<0.05；n=9。
2.3Sco对缺氧/复氧损伤心肌细胞MDA、LDH和CK水平的影响H/R组与对照组比较,MDA丄DH和CK水平差异有统计学意义（P<0.05）；H/R+Sco组与H/R组比较MDA,LDH和CK水平差异有统计学意义（P<0.05），见表3。
毒理学杂志 2020 年 12 月第 34 卷第 6 期 J Toxicol December 2020 Vol. 34 No. 6• 489 •
Annexin V-FITC
>
图1 Sco 对缺氧/复氧损伤心肌细胞凋亡的影响
H/R
中国人用英语怎么说
H/R+Sco
Bax
Bcl-2
对照组
常用歇后语图2 Western hlot 检测Sco 对缺氧/复氧损伤心肌细胞
凋亡相关蛋白表达的影响
表3 Sco 对缺氧/复氧损伤心肌细胞MDA 、
LDH 和CK 水平的影响（x±s ）
注：与对照组比较，* P<0. 05；与H/R 组比较,*P<0. 05；n = 9o
分组MDA ( p,mol/g)LDH(U/ml)
CK(U/ml)
对照组
5.41±0. 52
509. 85±49. 91 1. 31±0. 15H/R 12. 37±1.46*
912. 34±92. 64* 2. 96±0. 28*H/R+Sco 6. 71±0. 63*
602. 35±59. 27*
1.49±0. 13*
2.4 Sco 对缺氧/复氧损伤心肌细胞PI3K/Akt 信号 通路的影响 H/R 组与对照组比较p-PI3K 和p-Akt
蛋白水平差异有统计学意义（P<0. 05）； H/R + Sco 组 与H/R 组比较p-PI3K 和p-Akt 蛋白水平差异有统计
书包的折法
学意义（PvO. 05），见图3和表4。
表4 Western blot 检测Sco 对缺氧/复氧损伤心肌细胞
PI3K/Akt 信号通路的影响（久土s ）
分组PI3K/3-actin p-PI3K/p-actin Akt/p-actin p-Akt/p~actin 对照组
0. 95±0. 120. 26±0. 04 1.09±0. 140. 35±O. 05H/R 0. 98±0. 090. 87±0. 07 * 1. 05±0. 11
0. 81±0. 09*H/R+Sco
0. 96 ±0. 14
0. 40±0. 05*
1. 07 ±0. 16
0. 42±0. 06*
注：与对照组比较「P<0. 05；与H/R 组比较,#P<0. 05；n = 9o
2.5 Sco 对缺氧/复氧损伤心肌细胞miR-15b 表达的 影响 qRT ・PCR 检测结果显示，H/R 组与对照组比
较，心肌细胞中miR-15b 的表达水平差异有统计学意
H/R H/R+Sco
P13K
儿科护士P-PI3K
Akt
p-Akt
P-actin
对照组图3 Western blot 检测Sco 对缺氧/复氧损伤心肌细胞
PI3K/Akt 信号通路的影响义（P<0. 05） ；H/R+Sco 组与H/R 组比较，心肌细胞中
miR-15b 的表达水平差异有统计学意义（P<0. 05），见 表5。
表5 qRT-PCR 检测Sco 对缺氧/复氧损伤心肌细胞
miR-15b 表达的影响（x±s ）
分组miR-15b
对照组
1. 00±0. 13H/R
4. 09±0. 42 *Sco
0. 43±0. 05*
H/R+Sco 1. 52±0. 17#
注：与对照组比较,• P<0. 05；与H/R 组比较,"P<0. 05；n = 9。
2.6 过表达miR-15b 逆转Sco 对缺氧/复氧损伤心肌
细胞增殖和凋亡的影响 H/R + Sco + miR-15b 组与H/ R+ Sco + miR-con 组比较，心肌细胞活力、凋亡率与
Bax, Bcl-2蛋白水平差异有统计学意义（P<0. 05 ） , H/ R+Sco 组、H/R+Sco + miR-con 组各指标比较差异无统 计学意义（P>0.05），见图4、图5和表6
O
・490・毒理学杂志 2020 年 12 月第 34 卷第 6 期 J Toxicol December 2020 Vol. 34 No. 6
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----------------------->
Annex i n V-FITC
图4过表达miR-15b 逆转Sco 对缺氧/复氧损伤心肌细胞凋亡的影响
Bax
H/R+Sco
H/R+Sco+miR-con
H/R+Sco+miR-15b
Bcl-2
卩-actin
图5过表达miR- 15b 逆转Sco 对缺氧/复氧损伤
心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响
2.7 过表达miR-15b 逆转Sco 对缺氧/复氧损伤心肌
细胞MDA 、LDH 和CK 水平的影响 H/R+Sco + miR-
15b 组与 H/R+Sco+miR-con 组比较,MDA,LDH 和 CK
水平差异有统计学意义（P<0. 05） , H/R + Sco 组、H/R
+Sco+miR-con 组各指标比较，差异无统计学意义（P> 0. 05），见表 7。
2.8 过表达miR-15b 逆转Sco 对缺氧/复氧损伤心肌细
胞PI3K/Akt 信号通路的影响 H/R+Sco+miR-15b 组与 H/R+Sco + miR-con 组比较，p-PI3K 、p-Akt 蛋白水平差
异有统计学意义（P<0. 05），见图6和表8。
表6 过表达miR-15b 逆转Sco 对缺氧/复氧损伤心肌细胞增殖和凋亡的影响（牡s ）
注：与 H/R+Sco+miR-con 组比较，* P<0. 05;n = 9o
分组
A 值凋亡率
凋亡相关蛋白表达量
Bax/^-actin
Bcl-2/p-actin H/R+Sco
0. 93±0. 137.51±0. 820. 35±0. 040. 75±0. 09
H/R+Sco+miR-con 0. 89±0. 11
7.69±0. 75
0. 37±0. 050. 72±0. 10H/R+Sco+miR-15b 0. 53±O. 07*27. 83±3.06*
0. 91±0. 12*
0. 32±0. 04*
表7过表达miR-15b 逆转Sc 。对缺氧/复氧损伤心肌细胞MDA 、LDH 和CK 水平的影响（丘土s ）
注：与 H/R+Sco+miR-con 组比较，° P<0. 05；n = 9…
表8过表达miR-15b 逆转Sco 对缺氧/复氧损伤心
分组
MDA( pcmol/g)LDH(U/ml)CK(U/ml)
H/R+Sco
6. 52±0. 6759
7. 84±56. 39 1.46±0. 15H/R+Sco+miR-con
6. 81±0. 69
607. 23±62. 15 1.51±0. 17H/R+Sco+miR- 15b 11. 03±l. 24*
851.36±91.08*
2. 60±0. 24*
肌细胞PI3K/Akt 信号通路的影响（壬±$）
注：与 H/R+Sco+miR-con 组比较,*P<0.05;” = 9。
分组
PI3K/p-actin p-P 13 K /p-actin Akt/p-actin
p-Akt/p-actin H/R+Sco 0. 99±0. 090. 39±0. 05 1.04±0. 12
0. 36±0. 05H/R+Sco+miR-con 0. 95±0. 150. 36±0. 04
1.01±0. 170. 33±0. 03
H/R+Sco+miR-15b
0. 96±0. 12
0. 78±0. 08 * 1.05±0. 15
0. 76±0. 09 *
3讨论
Sco 属于颠茄中药理作用较强的一种生物碱，并 可抑制中枢神经系统，研究表明Sco 可有效改善新生 儿缺血缺氧性脑病患儿的临床症状®回。相关报道指
出Sco 可能通过抑制氧化应激而减轻颅脑损伤⑴P13K
P-P13K
留学考研Akt
Bcl-Akt
H/R+Sco
H/R+Sco+miR-con H/R+Sco+miR-15b
P-actin
图6 过表达miR-15b 逆转Sco 对缺氧/复氧损伤
心肌细胞PI3K/Akt 信号通路的影响本研究结果显示H/R 处理后心肌细胞活力明显降低，
而不同浓度的Sco 处理后心肌细胞活力明显升高，
提
>三国演义第五回
