附件2
畜肉中阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因桂圆补什么的测定
BJS 201711
1 范围
本方法规定了畜肉中阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。
本方法适用于畜类肌肉组织中阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因的定性确证和定量测定。
2 原理
用磷酸盐缓冲溶液提取畜类肌肉组织中阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因，提取液经离心、净化后用液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。
3 试剂和材料
以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯，水应为符合GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 甲醇（一曝十寒什么意思CH3OH）：色谱纯。
3.1.2 乙腈（CH3CN）：色谱纯。
3.1.3 甲酸（HCOOH）：色谱纯。
3.1.4 乙酸（CH3COOH）：色谱纯。
3.1.5 正己烷（C6H14）：色谱纯。
3.1.6 氢氧化钠（NaOH）。
3.1.7 磷酸二氢钾（KH2PO清除的英文4）。
3.1.8氨水（NH3·H2O）。
3.2 试剂的配制
3.2.1 氢氧化钠溶液（200 g/L）：称取氢氧化钠（3.1.6）20g，加适量的水溶解，冷却后加水稀释至100 mL，混匀。
3.2.2 磷酸二氢钾缓冲溶液（0.1mol/L）：称取磷酸二氢钾（3.1.7）13.6g，加水溶解至近1000 mL，用氢氧化钠溶液（3.2.1）调节pH至4.0，加水定容至1000 mL，混匀。
3.2.3甲酸溶液（2 mL/100 mL）：移取甲酸（3.1.3）2 mL，加水稀释至100 mL，混匀。
3.2.4 氨水甲醇溶液（2+98）：移取氨水（3.1.8）2 mL，加甲醇（3.1.1）稀释至100 mL，混匀。
3.2.5 乙酸溶液（0.1 mL/100 mL）：移取乙酸（3.1.4）1 mL，加水稀释至1000 mL，混匀。
3.2.6 甲酸溶液（0.1 mL/100 mL）：移取甲酸（3.1.3）1 mL，加水稀释至1000 mL，混匀。
3.3 标准品
硫酸阿托品、消旋山莨菪碱、氢溴酸东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因标准品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量和折算系数见附录A表A.1，纯度均≥98%。
3.4 标准溶液的配制
3.4.1 标准储备液（100 mg/L）：准确称取标准品（3.3），分别折算成含阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因10 mg炖老母鸡（精确至0.0001 g），置于100 mL本科论文范文烧杯中，加适量的甲醇（3.1.1）溶解，并用甲醇转移并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为100 mg/L标准储备液。置-18 ℃以下冰箱中保存，有效期6个月。
3.4.2 标准中间液（1.00 μg/mL）：移取标准储备液（3.4.1）1.00 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇（3.1.1）定容至刻度，摇匀，配制成浓度为1.00 μg/mL标准工作液。置于4℃~8℃保存，有效期3个月。
3.4.3 标准工作溶液：临用现配。
3.5 SPE小柱：Oasis MCX阳离子交换柱，60mg/3mL，或性能相当者。
4 仪器和设备
4.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。
4.2 均质器。
4.3 高速冷冻离心机：转速≥10000 r/min。
4.4 固相萃取装置。
4.5 涡旋混合器。
4.6 超声波清洗器。
4.7 氮气吹干仪。
4.8 电子天平：感量分别为0.01 g和0.000 1 g。
4.9 pH计:精度0.01。
5 测定步骤
5.1 试样的制备与保存
取空白或供试肌肉组织，绞碎，并使均质，得空白或试样。
5.2 试样的处理
5.2.1 提取
称取试样5 g（精确至0.01g）于50 mL具塞离心管中，加入磷酸二氢钾缓冲溶液（3.2.2）20 mL ，加盖后涡旋2 min，再超声处理15 min， 4℃以下10000 r/min离心15min，上清液倒入另一离心管中。残渣中再加入缓冲溶液20 mL，重复提取一次，合并上清液，滤纸过滤，用上述缓冲溶液4 mL洗涤滤纸，收集全部滤液于50 mL容量瓶中，用缓冲溶液定容至50 mL，待净化。
5.2.2 净化
Oasis MCX阳离子交换柱使用前依次用3 mL甲醇（3.1.1）、3 mL水和3 mL甲酸溶液（3.2.3）活化，保持柱体湿润。取待净化液5.00 mL加入SPE小柱（3.5），流速控制在1 mL/min内，依次用3 mL甲酸溶液、3 mL甲醇、3mL正己烷（3.1.5）淋洗小柱，弃去全部流出液，在65 kpa 的负压下，抽干2 min，最后用氨水甲醇溶液（3.2.4）5 mL洗脱，收集
洗脱液。洗脱液在40℃以下氮气吹干，加入甲酸溶液（3.2.6）1.00mL，涡旋0.5 min，过0.22 μm滤膜，供测定。
5.3 标准工作溶液的制备
称取空白试样5 g（精确至0.01 g）于50 mL具塞离心管中，分别加入标准中间液（3.4.2）适量，使其浓度为0.500、1.00、2.00、5.00、10.0、50.0 ng/mL，经5.2步骤操作，供测定。
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注:可根据仪器的灵敏度及样品中待测物的实际含量确定标准系列溶液浓度。
5.4 液相色谱-串联质谱测定
5.4.1 液相色谱参考条件
a.色谱柱：C18色谱柱（2.1 x 50 mm，1.8 µm），或性能相当者。
b.流动相：A：乙腈（3.1.2），B：乙酸溶液（3.2.5），梯度洗脱条件见表1。
表1 梯度洗脱条件
时间（min） | A（%） | B（%） |
0.0 | 10 | 90 |
1.0 | 10 | 90 |
3.0 | 17 | 83 |
3.5 | 90 | 10 |
4.0 | 10 | 90 |
5.0 | 10 | 90 |
| | |
c.柱温：30 ℃。
d.流速：0.4 mL/min。
e.进样量：5 μL。
5.4.2 质谱参考条件
a.扫描方式：正离子扫描；
b.采集方式：MRM采集方式；
c.电离电压：3.0 kV；
d.脱溶剂温度：450 ℃；运动会
e.定性离子对、定量离子和碰撞能量见表2。
表2 待测物质的定性离子、定量离子和碰撞能量
中文名称 | 母离子菠菜炒 (m/z) | 子离子 (m/z) | 碰撞能量 (eV) |
阿托品 | 290 | 124*；93 | 22/30 |
山莨菪碱 | 306 | 140*；122 | 25/30 |
东莨菪碱 | 304 | 138*；156 | 18/20 |
普鲁卡因 | 237 | 100*；120 | 16/30 |
利多卡因 | 235 | 86*；58 | 20/40 |
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注：*为定量离子。
