《中国癌症杂志》2017年第27卷第4期
CHINA ONCOLOGY 2017 Vol.27 No.4251甲状腺乳头状癌BRAF V600E基因突变
及相关蛋白的表达
董丽儒1，杨 虎2，李 双1，宋旭东1
1.华北理工大学附属医院病理科，河北 唐山 063000；
2.河北省武警总医院病理科，河北 石家庄 050081
［摘要］ 背景与目的：BRAF V600E基因突变可作为甲状腺乳头状癌靶向治疗的靶点，因此检测患者BRAF基因状态对于能否应用靶向药物治疗具有重要意义。观察BRAF V600E基因突变及突变蛋白VE1在甲状腺乳头状癌中的表达情况，并分析其与甲状腺乳头状癌的临床病理特征及其预后的关系。方法：采用DNA测序法及免疫组织化学法分别检测108例甲状腺乳头状癌、54例甲状腺腺瘤和54例结节性甲状腺肿标本中BRAF基因突变及其相关蛋白VE1的表达。结果：108例甲状腺乳头状癌基因突变率为67.6%，VE1表达率为64.8%，与甲状腺良性病变相比差异有统计学意义(P<0.05)，与临床病理参数间无相关性。结论：甲状腺乳头状癌BRAF V600E 基因突变率和BRAF V600E蛋白表达水平增高，可以作为鉴别甲状腺良、恶性肿瘤的有效指标。免疫组织化学法检测甲状腺乳头状癌BRAF V600E蛋白的表达与其基因突
变的一致性高，可间接有效地反映BRAF V600E基因突变的状态。BRAF V600E基因突变及突变蛋白的表达与甲状腺乳头状癌患者预后无关。
［关键词］ BRAF V600E基因；VE1；甲状腺乳头状癌
DOI: 10.19401/jki.1007-3639.2017.04.002
中图分类号：R736.1 文献标志码：A 文章编号：1007-3639(2017)04-0251-05
BRAF V600E mutation and expression of its protein in papillary thyroid carcinoma DONG Liru1, YANG Hu2, LI Shuang1, SONG Xudong1 (1. Department of Pathology, Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China; 2. Department of Pathology, Hebei Provincial Corps Hospital of CAPF, Shijiazhuang 050081, Hebei Province, China)
Correspondence to: SONG Xudong E-mail:
［Abstract］ Background and purpo: The BRAF V600E mutation is a highly attractive drug target. Therefore, determining the BRAF gene mutation status of patients is esntial in order to asss patients’ eligibility for targeted BRAF gene inhibitor therapy. The aim of this study was to vali
date the utility of immunohistochemistry to rapidly obtain the BRAF gene mutation status. This study aimed to analyze the correlation of the BRAF V600E gene mutation and VE1 protein ex-pression with the clinical pathological characteristics in papillary thyroid carcinoma (PTC).Methods: The mutation status of BRAF V600E was detected by DNA quencing. Immunohistochemistry was ud to detect the expression of BRAF V600E protein in 108 cas of PTC, 54 cas of thyroid adenoma and 54 cas of normal thyroid tissue. Results: The gene mutation rate of BRAF V600E is 67.6%, and VE1 protein expression rate is 64.8% in 108 cas of PTC. The differences were statistically significant compared with thyroid adenoma and goiter (P<0.05), but have no correlation with the clinical pathological characteristics. Conclusion: BRAF V600E gene mutation and VE1 protein expression are uful biomarkers for the pathological diagnosis of PTC. High consistency was obrved between the immunohistochemical staining results and the DNA quencing results of BRAF V600E gene mutations. Immunohistochemical technique detecting the BRAF V600E protein expression can effectively reflect indirectly BRAF V600E gene mutation status in PTC. BRAF V600E gene mutation has no contribution to the development of papillary thyroid carcinoma.
［Key words］ BRAF V600E gene; VE1; Papillary thyroid carcinoma
基金项目：河北省卫生厅科研基金项目(20170928)。
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通信作者：宋旭东 E-mail:
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BRAF基因属于RAF基因家族，位于染色体7q34，与鸟类的c-Rmil原癌基因同源，编码丝/苏氨酸蛋白激酶，已知的RAF家族有3个成员：Raf-1、BRAF和ARAF，它们均存在于细胞质中，是激活下游信号通路的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kina，MAPK)最强的激活剂［1］。近年来随着基因检测技术的广泛开展，在多种人类恶性肿瘤中均存在不同比例的BRAF突变。BRAF V600E基因突变可作为甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)靶向治疗的靶点，因此检测患者BRAF基因状态对于能否应用靶向药物治疗具有重要意义。观察BRAF V600E基因突变及突变蛋白VE1在PTC 中的表达情况，并分析其与PTC的临床病理特征及其预后的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
收集华北理工大学附属医院2010年—2013年经病理证实的PTC石蜡包埋标本共计108例。另外收集甲状腺腺瘤54例、结节性甲状腺肿54例。病例资料包含性别、年龄、是否完整切除、肿瘤大小、有无局部浸润和远处转移等，并参照标准对甲状腺癌病例进行MACIS评 分［2-3］。PTC中淋巴结转移阳
敦煌莫高窟性组19例，淋巴结转移阴性组89例；男性22例，女性86例。所有标本均采用4%的甲醛溶液固定，梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋，4 μm切片，HE染色，镜下观察。
1.2 主要试剂
DNA提取试剂盒和BRAF基因突变检测试剂盒(DNA测序法)均购自北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司。主要设备有美国ABI7500荧光定量PCR仪和ABI3130DNA测序仪。鼠抗人单克隆抗体BRAF V600E(克隆号VE1)工作液购自上海罗氏制药有限公司，S-P试剂盒(过氧化物酶阻断剂、封闭用正常山羊血清、生物素标记二抗工作液、辣根酶标记链霉卵白素工作液)、PBS、柠檬酸盐缓冲液、苏木素及其他免疫组织化学试剂均由华北理工大学附属医院病理科提供。1.3 方法
1.3.1 DNA测序法
镜下观察HE切片，选取含有足够比例肿瘤成分的蜡块，每例标本连续切取10 μm厚的蜡膜5张，直接封存于EP管中，二甲苯处理、蛋白酶K完全消化，依照DNA抽提试剂盒说明书提取石蜡组织标本DNA，应用聚合酶链反应对标本DNA的BRAF基因第15外显子进行扩增，而后在自动化基因分析仪上进行测序，采用chromas 软件对结果进行分析。BRAF基因的测序结果与BRAF基因组DNA序列进行比对以确定有无点 突变。
1.3.2 免疫组织化学法染色
采用SP两步法，4 μm厚切片，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固。PBS液代替一抗做阴性对照。
1.4 结果判定
免疫组织化学法染色结果由两名高年资病理科医师分别观察每张免疫组织化学切片后作出判断。BRAF V600E蛋白阳性产物为棕黄色颗粒，位于细胞质。高倍(×400)镜下对每张切片随机选取10个视野计算阳性细胞百分率，未着色或阳性细胞数<5%为阴性(-)，阳性细胞数>5%为阳性(+)。
1.5 统计学处理
采用SPSS 17.0统计学软件包对各数据进行统计学分析，计数资料的阳性率比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 BRAF V600E基因测序结果
BRAF V600E基因测序结果显示，108例PTC 中有73例第15外显子激活区第1 799位点发生杂合突变，即T突变为A(图1)，突变率为67.6%，甲状腺良性病变组(甲状腺腺瘤组及结节性甲状腺肿组)未见突变，两者相比差异有统计学意义(P<0.01，表1)。
2.2 BRAF V600E突变蛋白VE1在各组中的 表达
VE1在PTC组的阳性率为64.8%(70/108)，
董丽儒，等. 甲状腺乳头状癌BRAF V600E基因突变及相关蛋白的表达
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显著高于甲状腺腺瘤组的16.7%(9/54)及结节性甲状腺肿组的12.3%(7/54)，差异有统计学意义(χ2=56.492，P =0.000，表1)。
2.3 BRAF V 600E 基因突变及其蛋白表达与PTC临床病理特征间的关系
统计结果分析显示，PTC组BRAF V 600E 基因突变及其相关蛋白的表达与年龄、性别及淋巴结转移情况无关(P >0.05)；根据MACIS评分系统将PTC患者分为4组，统计分析显示，各组BRAF V 600E 基因突变率及其蛋白表达的阳性率
差异无统计学意义(P >0.05，表2)。
2.4 BRAF V 600E 基因突变与其相关蛋白表达的相关性
PTC组织中，73例BRAF V 600E 基因突变者出现70例BRAF V 600E 蛋白阳性表达，BRAF V 600E 蛋白表达的灵敏度为95.9%(70/73)，特异度为100%(35/35)，VE1蛋白阳性表达与BRAF V 600E 基因突变检测的一致率为97.2%，阳性预测值为100%，阴性预测值为92.1%。
表 1 PTC、甲状腺腺瘤及结节性甲状腺肿中BRAF V 600E 基因突变及其相关蛋白的表达Tab. 1 The mutation of BRAF V 600E and expression of related protein in each group
Group BRAF V 600E
桂梅VE1+- Percentage/%
+- Percentage/%
PTC 733567.6703864.8Adenoma 054094516.7Goiter
54
7
47
13.0
表 2 BRAF V 600E 基因突变及VE1的表达与PTC临床病理特征的关系
Tab. 2 The relationship between the variation of BRAF V600E and VE1 and clinicalpathological charateristics
Clincopathological characteristic n
BRAF V 600E
VE1+
-Percentage/%
P value
+
-Percentage/%
P value
Gender Male 22111150.00.557
小学生手工作品13959.10.529
Female 86
37
49
43.0
57
29
66.3
Age/year ＜402481633.30.214
15962.50.788
≥40
84
40
44
47.6
55
29
65.5
Lymph node metastasis Yes 1981142.10.821
12763.20.868
No 89
40
49
44.9
58
31
65.2
MACIS score <687394844.80.988
573065.50.925
6-6.99125741.77558.37-7.9952340.03260.0≥8
4
2
2
50.0
3
1
泻白散
75.0
图 1 BRAF V 600E 基因测序结果Fig. 1 Gene quencing results of BRAF V 600E
A: Benign lesions indicate wild BRAF gene, no mutations; B: BRAF gene showed heterozygosity mutations in PTC; C: PTC (HE, ×400); D: Immunoreactive staining of VE1 in PTC (SP, ×400)
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3 讨 论
BRAF基因突变是PTC最常见的遗传学事件，而甲状腺未分化癌检测到的均为野生型BRAF基因，几乎检测不到BRAF基因突变［4］。Quiros等［5］研究显示，合并PTC成分的未分化癌可检测到PTC突变，但其中检测到的突变成分来自于PTC，未分化癌更多的检测到RAS基因突变［6］。90%以上的BRAF基因突变都是BRAF的T1799A错义点突变，即15外显子第1 799位点的T被A替代(T1799A)，导致该基因编码的蛋白产物中第600位的缬氨酸被谷氨酸替代，致使其介导的信号转导通路发生了异常，平均突变率为44%~49%［7-8］。目前，关于BRAF的研究大部分是基于基因水平上的聚合酶链反应和基因测序等技术研究BRAF基因突变位点(突变位点多见于T1799A)及突变率，或使用免疫组织化学染色技术检测BRAF V600E突变蛋白VE1在PTC组织中的表达。有文献显示，采用BRAF V600E(克隆号VE1)单克隆抗体能特异性识别人BRAF V600E 基因突变后相关蛋白的表达，BRAF V600E蛋白位于596~606位氨基酸序列，免疫组织化学法检测结果与用聚合酶链反应和基因测序等技术检测具有较好的一致性［9-11］。本研究中的108例PTC有73例检测到BRAF(T1799A)基因突变，突变率为67.6%，而甲状腺腺瘤组及结节性甲状腺肿组均未检测到BRAF(T1799A)基因突变，提示BRAF基因突变是PTC发生的一项重要事件，对其早期确诊可能具有重要价值。本研究还发现BRAF V600E基因突变的73个病例中有70例表达VE1，VE1表达的灵敏度为95.9%(70/73)，特异度为100%(35/35)，
VE1蛋白阳性表达与BRAF V600E基因突变检测的一致率为97.2%(105/108)，该结果提示使用免疫组织化学法检测BRAF V600E突变蛋白VE1在PTC中的表达具有较高的灵敏度及特异度，能间接有效地反映BRAF V600E基因突变的状态，且因免疫组织化学法操作简单、费用低廉，可代替基因检测成为PTC病理诊断的一项实用观测指标。然而新技术的出现总是有利有弊的，包括免疫组织化学染色强度的判读存在一定程度的主观性及突变抗体选择方面存在人为因素的不确定性。此外，免疫组织化学结果会出现一定比例的假阳性和假阴性，本研究的73例免疫组织化学检测结果中有3例是假阴性即基因序列显示突变阳性而免疫组织化学法VE1不表达，这种情况的出现可能是由于突变抗原表达缺失或组织固定不充分；组织缺血及基因突变会引起BRAF V600E蛋白表达减少，这可能是免疫组织化学法出现假阴性的原因。因此，在应用免疫组织化学法检测BRAF V600E蛋白的过程中要做好质量控制，在临床应用中对于突变结果的判定需要综合多方面因素以保证结果的准确性。
BRAF基因突变与临床病理参数间的关系目前尚存在争议［10,12-13］，而本研究并未发现其与患者年龄、性别及淋巴结转移之间的相关性。PTC组根据MACIS评分系统再分为4个亚组，本研究发现，4个亚组间BRAF V600E突变及VE1的表达无明显差异，该结果说明BRAF V600E突变及VE1的表达与患者预后无关。
总之，采用免疫组织化学单克隆抗体BRAF V600E(克隆号VE1)代替DNA测序技术分析BRAF V600E基因的突变状态，有助于PTC的病理诊断，并有效地指导临床靶向治疗用药。
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（收稿日期：2016-08-18 修回日期：2016-11-15）
