抑制内质网应激关键信号通路蛋白eIF2α
去磷酸化与肝细胞增殖及c-Met表达的关系
陈欢1，蒋小铃2，李吉贵1，方家琴1，冯素敏1，何毅怀2，陈娅2
1 遵义市第五人民医院内科，遵义563000；
2 遵义医科大学附属医院感染科
摘要：目的 探讨抑制内质网应激（ERS）关键信号通路蛋白真核细胞起始因子2α（eIF2α）去磷酸化与肝细胞增殖及促肝细胞生长因子受体（c-Met）表达的关系。方法 将人肝细胞株L02分为对照组和胡萝卜素（TG）组，TG组加入含内质网钙平衡抑制剂毒胡萝卜素（TG）的RPMI1640培养基，诱导构建细胞ERS模型；对照组仅加入RPMI1640培养基，培养48 h。采用CCK-8检测细胞活力，Western blotting法检测细胞ESR相关蛋白p-eIF2α、ERAD通路相关蛋白HRD1、XBP1以及c-Met蛋白表达。另取L02细胞，分为TG组和Salubrinal+TG组，Salubrinal+TG组给予eIF2α去磷酸化抑制剂Salubrinal预处理2 h，然后加入1 μmol/L TG培养48 h；TG组加入1 μmol/L TG培养48 h。采用CCK-8检测细胞活力，Western blotting法检测细胞eIF2α、p-eIF2α、HRD1、XBP1、c-Met蛋白表达。结果 与对照组相比，TG组p-eIF2α、HRD1表达水平升高，TG组ERS相关蛋白p-eIF2α表达上调，ERAD通路激活，表明ERS
细胞模型构建成功。TG组细胞增殖活力和c-Met蛋白表达水平均低于对照组（P均<0.05）。与TG组相比，Salubrinal+TG 组细胞XBP1、HRD1蛋白表达降低，细胞增殖活力和c-Met蛋白表达升高（P均<0.05）。结论 在肝细胞ERS中，抑制eIF2α去磷酸化能够部分恢复肝细胞细胞增殖活力及c-Met表达，促进细胞存活。
关键词：内质网应激；促肝细胞生长因子受体；肝细胞增殖；真核细胞起始因子2α；肝损伤
doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.02.005
中图分类号：R575 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）02-0020-04
Relationships of inhibiting dephosphorylation of eIF2α， a key signaling pathway for ERS， with hepatocyte proliferation and c-Met expression
CHEN Huan1， JIANG Xiaoling， LI Jigui， FANG Jiaqing， FENG Sumin， HE Yihuai， CHEN Ya
1 Department of Internal Medicine， The Fifth People' s Hospital of Zunyi， Zunyi 563000， China
Abstract：Objective To investigate the relationships of inhibiting the dephosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2α （eIF2α）， a key signaling pathway protein of ERS， with hepatocyte
proliferation and hepatocyte growth factor receptor （c-Met） expression.Methods Human liver cell line L02 was divided into the control group and thapsi⁃gargin （TG） group. In the TG group， ERS model was induced by adding RPMI1640 medium containing endoplasmic retic⁃ulum calcium balance inhibitor TG. In the control group， we only added RPMI1640 medium. At 0， 24， 48 h of culture，CCK-8 was ud to detect cell viability， and Western blotting was ud to detect the expression levels of ERS-related pro⁃teins p-eIF2α， ERAD path-related proteins HRD1， XBP1， and c-Met. L02 cells were divided into TG group and Salubri⁃nal+TG group. L02 cells in the Salubrinal+TG group were pretreated with eIF2α dephosphorylation inhibitor Salubrinal for
2 h， and then were cultured with 1 μmol/L TG for 48 h. L02 cells in the TG group were added with 1 μmol/L TG and cul⁃
tured for 48 h. CCK-8 was ud to detect cell viability， and Western blotting was ud to detect protein expression levels of eIF2α，p-eIF2α，HRD1，XBP1，and c-Met.Results Compared with the control group，the expression levels of p-eIF2α and HRD1 in TG group incread， the expression of ERS-related protein p-eIF2α in TG group was up-regulated，and the ERAD pathway was activated， indicating that the ERS cell model was successfully constructed. The cell prolifera⁃tion activity and c-Met protein expression levels in the TG group were lower than tho in th
e control group （all P<0.05）.
基金项目：国家自然科学基金项目（81560110）；贵州省卫生健康委科学技术基金项目（gzwjkj2021-071，gzwjkj2020-1-041）；贵州省科技计划项目［黔科合支撑（2019）2803号］；贵州省遵义市科技计划项目［遵市科合HZ字（2021）58号］；遵义医科大学学术新苗培养及创新探索专项项目［黔科合平台人才（2017）5733-013］。
第一作者简介：陈欢（1990-），女，主治医师，主要研究方向为病毒性肝炎的发病机制及治疗。E-mail：
通信作者简介：陈娅（1992-），女，主治医师，主要研究方向为肝损害及肝再生。E-mail：
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Compared with TG group， the protein expression levels of XBP1 and HRD1 decread， while the proliferative activity and c-Met protein expression incread in the Salubrinal+TG group （all P<0.05）.Conclusion Inhibition of eIF2α dephos⁃phorylation can partially restore hepatocyte proliferation and c-Met expression in ERS， and promote cell survival.
鲁迅弃医从文
Key words： endoplasmic reticulum stress；c-Met；hepatocyte proliferation；eukaryotic translation initiation factor 2α；liver injury
肝损伤进展为肝衰竭与肝细胞抗损伤能力低下、肝细胞再生能力等因素相关，因此增强肝细胞抗损伤能力、促进肝细胞增殖是治疗肝损伤的基本策略。促肝细胞生长因子（HGF）受体（c-Met）是受体酪氨酸激酶亚家族成员，对细胞生长转化、细胞周期、细胞抗损伤能力及增殖具有重要作用［1］。研究发现，c-Met在急性肝衰竭中能够促进代偿性肝再生，是肝病治疗的潜在靶点［2］。内质网应激（ERS）是细胞的防御机制之一，对细胞增殖存在广泛影响。我们的前期研究发现，ERS可下调c-Met表达，影响肝细胞增殖，与肝病的发生发展密切相关［3］。
ERS作用于蛋白激酶R内质网激酶（PERK）/真核细胞起始因子2α（eIF2α）、肌醇激酶1（IRE1）/X盒结合蛋白1（XBP1）、活化转录因子6（ATF6）三条信号通路，通过减少新生蛋白的合成、激活内质网相关降解（ERAD）减轻内质网压力，恢复内质网稳态［4］。ERS与肝损伤的发生发展密切相关，但ERS影响肝细胞增殖的具体分子机制尚不明确。2018年1月—2020年1月，我们通过构建ERS肝细胞模型，探讨抑制eIF2α去磷酸化影响肝细胞增殖及c-Met表达的潜在机制。
不胜感激的意思1 材料与方法
1.1 材料 正常人肝细胞株L02购自中国科学院。内质网钙平衡抑制剂毒胡萝卜素（TG）、eIF2α去
磷酸化抑制剂Salubrinal均为Sigma-Aldrich公司产品；胎牛血清（Gibco），RPMI1640培养基（Hyclone），青—链霉素混合物、0.25%胰酶（索莱宝），DMSO试剂（Amresco），eIF2α、c-Met单克隆抗体（Santa Cruz），p-eIF2α、XBP1单克隆抗体（Cell Signaling），HRD1（SAB4200423，Sigma），GAPDH多克隆抗体（ET1601-4）。蛋白质电泳仪（Bio-Rad），ECL化学发光成像仪（ChemiScope 6000，Clinx），全波长酶标仪（Biotek）。
形容日出的唯美句子1.2 细胞培养 取L02细胞，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。至细胞生长密度≥85%时进行传代培养。1.3 肝细胞ERS模型的构建
1.3.1 细胞分组与干预方法 取1 mg TG溶于1.537 mL DMSO中，配制成含1 mg/mL TG母液，使用前加入含10%胎牛血清培养基稀释为1 μmol/L 的TG溶液。取对数生长期细胞，随机分为TG组和对照组，TG组加入含1 μmol/L TG的RPMI1640培养基，对照组仅加入RPMI1640培养基，培养48 h。
1.3.2 TG对细胞增殖能力的影响观察 采用CCK-8法。于培养0、48 h，取两组细胞，加入10 μL CCK-8试剂孵育60 min，置酶标仪450 nm处测定吸光度（A）值。
1.3.3 TG对细胞ESR相关蛋白p-eIF2α、ERAD通路相关蛋白HRD1以及c-Met蛋白表达的影响 采用Western blotting法。细胞培养0、48 h时，使用蛋白提取试剂盒按照说明书步骤提取蛋白，用BCA法检测蛋白浓度。通过电泳分离肝细胞裂解物，转移到PVDF膜上。用TBST封闭膜，分别加入稀释的G
APDH、p-eIF2α、HRD1、c-Met一抗4 ℃孵育过夜。TBST漂洗，加入辣根过氧化物酶标记的抗小鼠或抗兔IgG二抗，室温孵育1 h。TBST漂洗3次，用ECL 试剂盒曝光蛋白条带，获得蛋白条带灰度值。以目标蛋白与GAPDH蛋白条带灰度值的比值计算目标蛋白的相对表达量。
1.4 Salubrinal预处理对肝细胞ERS及细胞增殖的影响观察
1.4.1 细胞分组与干预处理 取5 mg Salubrinal溶于208.4 μL DMSO中，配制成含50 mmol/L Salubri⁃nal的母液，使用前加入含10%胎牛血清培养基稀释为20 μmol/L。将细胞分为TG组和Salubrinal+TG 组。待细胞生长融合度为70%～80%时，Salubri⁃nal+TG组加入20 μmol/L Salubrinal预处理2 h，然后加入1 μmol/L TG培养48 h；TG组加入1 μmol/L TG 培养48 h。
1.4.2 细胞增殖能力观察 采用CCK-8法检测两组细胞增殖能力，步骤参照“1.3.2”。
1.4.3 细胞p-eIF2α、XBP1、HRD1、c-Met蛋白表达检测 采用Western blotting法检测两组ESR相关蛋白p-eIF2α、XBP1，ERAD通路相关蛋白HRD1，以及c-Met蛋白表达，步骤参照“1.3.3”。前期物业合同
1.5 统计学方法 应用SPSS24.0统计软件。计量资料采用Kolmogorov-Smironv法进行正态性检验，符合正态分布的资料以
-x ± s表示，两组间比较采用独
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立样本T检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
为什么叫骆驼祥子
肩肘倒立教学视频2.1 肝细胞ERS模型构建结果 与对照组相比，TG组p-eIF2α、HRD1表达水平升高，c-Met表达水平降低（P均<0.05）。TG组ERS相关蛋白p-eIF2α表达上调，ERAD通路激活，表明ERS细胞模型构建成功。TG组和对照组细胞增殖A值分别为2.23 ± 0.18、
3.00 ± 0.13，TG组细胞增殖活力低于对照组（P<0.05）。见表1。
2.2 Salubrinal预处理对肝细胞ERS及细胞增殖的影响 与TG组相比，Salubrinal+TG组细胞p-eIF2α、c-Met蛋白表达水平升高，XBP1、HRD1蛋白水平表达降低（P均<0.05）。见表2。Salubrinal+TG组和TG组细胞增殖A值分别为2.64 ± 0.19、2.23 ± 0.17，Salubrinal+TG组细胞增殖活力较TG组升高（P<0.05）。
3 讨论
肝脏在受到不同类型的损伤后具有较强的再生能力。肝脏再生的潜力在决定肝脏疾病的结局中至关重要，特别是患有肝功能失代偿、肝再生受损的肝纤维、急性肝衰竭的患者［5］。但是，在一些病理条件下，如慢性乙醇摄入、脂肪肝疾病、肝硬化、肝衰竭、胆道梗阻，肝再生是延迟或受损的，其具体机制尚不明确。有研究发现，在急性和慢性肝损伤中，HGF/ c-Met信号对肝细胞和肝祖细胞再生能力具有显著的促进作用［6］。ERS是众多肝脏疾病的常见现象，对肝细胞的增殖与分化存在广泛影响。内质网是细胞内合成蛋白质、肽链折叠、修饰及脂类、糖类合成的重要场所，内质网还通过对钙的贮存与释放参与细胞内钙离子浓度的调节。当细胞受到缺氧、钙平稳紊乱等刺激引起内质网稳态失衡，使内质网腔内未折叠蛋白、错误折叠蛋白聚集，钙离子浓度改变时，可诱导ERS发生。ERS包括未折叠或错误折叠在内质网蓄积引起的未折叠蛋白反应（UPR）、正确折叠的蛋白在内质网过度蓄积、激活NF-κB引发的内质网超负荷反应、胆固醇缺乏引发的胆固醇调节级联反应。ERS诱导剂TG能够不可逆地阻滞钙
烟花散ATP酶，阻止钙从细胞质向内质网重吸收，导致ER 中钙浓度降低，抑制钙依赖性分子伴侣，使错误折叠的蛋白质增加，从而诱导ERS［7-8］。本研究采用TG 诱导L02细胞建立ERS细胞模型，探讨ERS与肝再生之间的潜在关系。结果表明，1 μmol/L TG可显著增加肝细胞ERS相关蛋白p-eIF2α磷酸化水平，ERAD通路激活，表明ERS细胞模型构建成功；肝细胞增殖活力和c-Met蛋白表达均下降，提示ERS可下调c-Met蛋白表达，抑制肝细胞的增殖。
目前一般用UPR来提示ERS的发生。UPR有3个应激感受蛋白，即PERK、ATF6、IRE1α，通过这些蛋白发挥作用，增强内质网对蛋白的折叠能力、促进内质网腔的错误折叠蛋白降解、减少蛋白质合成，从而恢复内质网的稳态。eIF2α是调节ERS的关键信号通路蛋白之一。细胞ERS可激活未折叠蛋白反应，激活PERK转化为具有活性的p-PERK，进而磷酸化eIF2α生成p-eIF2α，p-eIF2α可抑制eIF2B催化eIF2·GDP到eIF2·GTP交换的功能，使得eIF2不能被重复利用，降低AUG启动密码子识别率，从而抑制大多数蛋白质合成的启动过程，抑制细胞整体的蛋白翻译水平，从而减轻内质网负担，维持内质网平衡的稳态［9］。p-eIF2α也可经蛋白磷酸酶1（PP1）作用恢复至eIF2α非活性状态。Salubrinal作为eIF2α去磷酸化抑制剂，通过抑制PP1活性来抑制p-eIF2α去磷酸化（即保持其磷酸化状态），减少蛋白合成，从而起到缓解细胞ERS的作用［10-12］。为了观察eIF2α对肝细胞中c-Met表达的影响及机制，本研究用Sa⁃lubrinal预处理抑制TG诱导的ERS细胞模型eIF2α去磷酸化，结果显示经过Salubrinal预处理后，eIF2α磷酸化水平较TG组显著增加，ERS标志蛋白XBP1显著下降，提示Salubrinal可以缓解细胞ERS。这与TIAN等［13］的研究结果相符，即Salubrinal抑制eIF2α去磷酸化可以减轻细胞ERS。为明确Salubrinal减轻ERS后对细胞增殖的影响，随后检测了c-Met蛋白表达和细胞增殖活力，结果显示经过Salubrinal预处理后，与TG组相比，c-Met的下调趋势可部分逆转，肝细胞增殖活力部分回升。CHEN等［11］也得出了类似结果，L02细胞经Salubrinal减轻ERS后，反映再生的标志蛋白Cyclin D1也得到了部分回升。
表1 两组细胞p-eIF2α、HRD1、c-Met蛋白表达水平比较（-x ± s）
组别TG组对照组
p-eIF2α
15.65 ± 1.41*
1.00 ± 0.08
HRD1
13.49 ± 1.26*
1.00 ± 0.06
c-Met
0.19 ± 0.01*
1.00 ± 0.09
注：与对照组比较，*P<0.05；
表2 两组细胞p-eIF2α、XBP1、HRD1、c-Met蛋白表达水平比较（-x ± s）
组别Salubrinal+TG组TG组
p-eIF2α
2.46 ± 0.16*
1.00 ± 0.06
XBP1
0.54 ± 0.02*
1.00 ± 0.07
HRD1
0.68 ± 0.03*
1.00 ± 0.07
c-Met
1.77 ± 0.06
1.63 ± 0.09
注：与TG组比较，*P<0.05。22
以上研究表明，Salubrinal具有抑制蛋白的翻译作用，但促进再生的指标c-Met却部分恢复，提示
eIF2α磷酸化对蛋白质翻译的抑制作用并不直接调控c-Met蛋白的表达。
ERAD是ERS的反应形式之一，其降解机制是IRE1/XBP1/EDEM信号通路对蛋白质发挥质量控制的关键机制，它可以直接作用于错误折叠或组装不完全的前体蛋白，使其逆向转运进入细胞质并被蛋白酶体降解［14］。HRD1通过其生物活性域E3泛素连接酶参与ERAD，促进蛋白质逆转易位［15］。本研究结果显示，ERS能够上调HRD1，激活ERAD信号通路；给予Salubrinal预处理后，XBP1、HRD1蛋白表达水平较TG组降低，提示ERAD及ERS减弱。c-Met在给予Salubrinal预处理后表达的部分恢复是否与激活内质网相关降解的减弱有关，目前尚不明确，有待进一步研究。
综上所述，在肝细胞ERS模型中，抑制eIF2α去磷酸化可部分恢复肝细胞c-Met表达，促进细胞存活，其机制可能与反馈减轻ERS有关。抑制eIF2α去磷酸化有望成为恢复损伤肝细胞增殖的靶点。
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