Nestin阳性细胞在小鼠心肌组织中的表达及分布特征
吴冰原;李桂兰;姜美花;彭朝权
消防安全文字内容【摘 要】[Objective] The main aim of this study was to systematically evaluate the expression patterns of the Nestin in the developing or damaged adult heart issue,and probe into whether Nestin can be as a marker of cardiac stem cell.[Methods] Nestin expression was assd in the embryonic 13.5 d and postnatal 1 d,7 d,1 month,3 months old Nestin-GFP transgenic mou heart tissue by fluorescence microscopy,real-time quantitative PCR and RT-PCR.Myocardial infaction model was established by ligation of left anterior descending coronary in adult Nestin-GFP mice and the Nestin expression was obrved in the myocardium at 7d after injury.Then,the correlation between Nestin and other stem cell markers expression in mou heart tissue were determined by immunofluorent assay.[Results] In embryonic 13.5 d,the Nestin mainly expresd in the brain,spinal cord,and the retina,and also can be obrved in the heart tissue.After the mou was born,Nestin expression is gradually reduced with growth,and t
hat was also confirmed by the RT-PCR and Q-PCR analysis.Nestin-positive cells incread significantly in myocardial infarction area compared to the normal tissue.Sca-1,c-kit,Isl-1,and Nkx2.5 were widely expresd in heart tissue,but not co-expresd with Nestin.However,in normal and injured tissue,Nestin was co-expresd with vimentin and musashi-1,neural cell marker.[Conclusion] The results indicate that Nestin expression is highly correlated with cardiac development,and the Nestin-positive myocardial cell might be ari from neural linage cells,which suggest that such cells play an important role in the growth and maintenance of the cardiogenesis and regeneration.%[目的]了解Nestin在小鼠正常和损伤心脏组织中的表达及分布特征,探讨Nestin能否作为心肌干细胞的标志物.[方法]通过倒置荧光显微镜观察、RT-PCR和实时荧光定量PCR检测,分析Nestin在胚胎期13.5 d、出生后1d、7d、1月、3月的Nestin-GFP转基因小鼠心脏组织中的表达情况;建立小鼠心肌梗死模型,观察损伤后心肌组织中Nestin的表达情况;利用免疫荧光染色法检测小鼠心脏组织中Nestin与多种干细胞标记物的共表达关系.[结果]胚胎13.5 d Nestin表达主要集中于大脑、脊髓、视网膜等部位,但在心脏组织中也可观察到Nestin的绿色荧光,小鼠出生后Nestin的表达随着小鼠年龄的增加而逐渐减少,并且RT-PCR、Q-PCR的结果显示Ne
stin表达同样呈递减趋势.在梗死部位的心肌组织中可见Nestin阳性的细胞较正常组织显著增多.可见Sca-1、c-kit、Isl-1、Nkx2.5在心肌组织中广泛表达,但是未与Nestin共表达,而Nestin在正常与损伤组织均可与musashi-1、vimentin共表达.[结论]Nestin与心脏发育成熟有密切的关系,可能为神经外胚层来源的一类心肌干细胞.
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【期刊名称】《中山大学学报（医学科学版）》
【年(卷),期】2013(034)004新年心愿作文
【总页数】8页(P505-512)电容的基本单位
【关键词】Nestin;心肌干细胞;心肌再生
【作 者】吴冰原;李桂兰;姜美花;彭朝权
【作者单位】中山大学附属第三医院心血管内科,广东广州510630;中山大学干细胞与组织工程研究中心,广东广州510080;中山大学干细胞与组织工程研究中心,广东广州510080;中山大学附属第三医院心血管内科,广东广州510630
【正文语种】中 文
【中图分类】Q254
营销主管目前普遍认为成体心肌干细胞是最有希望达到心肌细胞完全再生的干细胞类型，但其并没有明确、特异的表面标志，因此寻求统一的体外分离心肌干细胞群的细胞生物学或遗传学标志物成为近年来生物学家们研究的热点［1］。Nestin作为中间丝蛋白家族成员之一，在胚胎发育过程中广泛表达，最早的表达时间出现在胚胎发育第7.5天（E7.5）的单细胞神经外胚层［2］。在早期胚胎发育阶段，大多数Nestin阳性细胞代表了增殖旺盛的干/祖细胞群，而这群细胞一旦开始分化或者停止分裂，Nestin表达开始下降并逐渐被其他组织特异性的中间丝蛋白所取代。同时，Nestin阳性细胞在成体组织中也有一定分布，例如中枢神经系统的侧脑室下区、海马齿状回颗粒细胞层下区、嗅球神经上皮祖细胞等，在一定条件下这些细胞可以增殖、分化和迁移，具有成体干细胞的特性［3］。值得关注的是，在组织损伤发生时，可以观察到部分Nestin阴性细胞重新表达Nestin并进入细胞增殖和迁移状态［3-4］。有研究报道，在心肌缺血损伤后有Nestin阳性细胞可迁移到缺血坏死区域参与神经和血管的再生。因此，我们通过观察正常和损伤心脏组织Nestin的表达情况以及与几种
干细胞的标志物的共表达情况，为Nestin能否作为心肌干细胞的标志物提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 实验动物 选择胚胎期 13.5 d、 出生后 1 d、7 d、1个月和 3 个月的 C57BL/6遗传背景的Nestin-GFP转基因小鼠为实验动物，由日本熊本大学提供，实验过程中对动物的处置符合医学伦理学的标准。
1.1.2 主要试剂 免疫荧光染色所用一抗Nestin抗体购于美国Millipore公司，干细胞因子受体（ckit）抗体、干细胞抗原-1（Sca-1）抗体、胰岛因子-1（Isl-1） 抗体购于 abcam 公司，Nkx2.5 抗体购于Santacruz公司，波形蛋白（vimentin）抗体购于abcam公司，musashi-1抗体购于Sigma公司，二抗包括山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG抗体均购于Invitrogen公司。
1.1.3 主要实验仪器和器材 冰冻切片机（Leica公司CM1900），激光扫描共聚焦显微镜（Z
eiss公司），荧光倒置显微镜（Olympu公司IX71-22FL/PH），PCR 试剂盒（Fermentas公司），PCR 仪（Biorad公司），逆转录试剂盒（Fermentas公司），RNA提取试剂盒（Qiagen 公司），Light Cycler480 Detection System（Roche公司）。谢霆锋生日>颜勤礼
1.2 组织的冰冻切片制作
将小鼠 13.5 d的胚胎和出生后 1 d、7 d的Nestin-GFP小鼠心脏组织直接放入40 g/L多聚甲醛，4℃固定 6～10 h。1个月、3个月的 Nestin-GFP小鼠，先行40 g/L多聚甲醛心脏灌注，随后取出组织放入多聚甲醛4℃固定12 h。用300 g/L蔗糖对已固定好的各年龄的小鼠组织过夜脱水。常温下，将组织在液态OCT包埋剂中在切片托上调整好位置，转移至-20℃，使包埋剂凝结呈固体状，待冰冻切片机温度降至-20℃后对已包埋好的组织行6 μm厚度的切片。切片于-20℃避光保存。
1.3 组织免疫荧光染色
0.01 mol/L的 PBS冲洗组织上的 OCT后，用含 5 g/L TrionX-100 的 0.01 mol/L 的 PBS 对组织透化处理40 min，后山羊血清封闭30 min。吸出血清后加入一抗抗体 Sca-1（1∶100
稀释）、c-kit（1∶100 稀释）、Isl-1（1∶150 稀释）、Nkx2.5（1∶100）稀释、vimentin（1∶100 稀释）、musashi-1（1∶100 稀释）、后于4℃过夜，次日取出在室温复温30 min，0.01 mol/L的PBS洗3次，每次5 min。加入相应二抗，室温孵育 1 h，0.01 mol/L 的 PBS 洗 3 次，每次 5 min。用 DAPI染核 5 min，0.01 mol/L 的 PBS 漂洗后加入20 μL荧光封片剂封片，封好片的样品可于荧光倒置显微镜或激光共聚焦照相系统下观察拍照。
1.4 心脏组织各时期RT-PCR和实时荧光定量PCR
根据Trizol说明书，整个过程注意防止RNa污染。将新鲜的心脏组织取出后立即放至消毒好的碾磨器，并立即在碾磨器中加入液氮，待液氮挥发干用碾磨器将组织碾磨成粉末状，加入1 mL Trizol于碾磨器中按照Invitrogen公司提供的方法提取RNA。对提取的RNA检测纯度和浓度，并使用Fermentas公司的逆转录试剂盒完成逆转录反应。对逆转录合成的DNA应用Fermentas公司的PCR试剂盒完成普通PCR反应，PCR引物Nestin上游为 5′-TCGCCAGGGAGGAGGCCATT-3′，下游为 5′-CTCCCCAGCCCTCCCCAGAC-3′，扩增片段194 bp，PCR反应体系为20 μL，反应结束后经过琼脂糖电泳、溴化乙锭染色后在凝胶成像系统下观察成像并记录结果。实时荧光定量PCR应用10 μL 的反应体系，在 LightCy
cler480（roche）上行如下程序：94℃变性5 min，而后开始做40个循环，循环程序为94℃变性5 s，55℃退火10 s，72℃延伸20 s，72℃延伸一步时收集荧光信号。循环完成后，做融解曲线步骤。结束后，使用PCR仪器配套分析软件进行相对定量的比较试验。
1.5 小鼠心肌梗死模型的建立和观察
用冠状动脉结扎法制作小鼠心肌梗死模型：将体质量在20～25 g的约3个月大的Nestin-GFP小鼠用40 g/L的水合氯醛腹腔注射麻醉后，气管插管连通小动物呼吸机，后于第3-4肋间作约1 cm长的切口，将左心耳和前室间隔沟暴露于视野下，结扎其左冠状动脉前降支后关胸腔。心肌梗死模型制作后做心电图确认小鼠心肌梗死的存在。心梗模型建立1周后取实验动物心脏的损伤部分分别做横切和纵切的冰冻切片，并于激光共聚焦显微镜下拍照观察。
2 结 果
上官女2.1 胚胎发育及不同年龄的小鼠心脏Nestin的表达
为了探讨Nestin在心肌组织中的表达及分布特性，我们利用Nestin-GFP转基因动物观察胚
胎发育及不同年龄段小鼠的心肌组织。通过在荧光倒置显微镜下观察可见：胚胎13.5 d Nestin表达主要集中于大脑、脊髓、视网膜等部位，但在心脏组织中也可观察到Nestin的绿色荧光（图1）。小鼠出生后Nestin的表达有随着年龄的增加而逐渐减少，在1 d的小鼠心脏组织中GFP阳性细胞数量最多，3个月的小鼠心脏组织中GFP阳性细胞明显减少，并且RT-PCR、Q-PCR的结果显示，Nestin的表达同样随年龄的增加呈递减趋势（图2）。同时为了鉴定其在心肌组织中的表达分布特点，我们分别观察了不同年龄的小鼠左心室、右心室及室间隔Nestin的表达情况，发现在上述部位均有Nestin阳性细胞的分布，Nestin表达情况未见明显差异（图3）。
图1 Nestin-GFP小鼠胚胎13.5 d的Nestin表达Fig.1 Expression of Nestin in embryonic 13.5 d Nestin-GFP mouA：In the 13.5 day of embryo，the expression of Nestin is mainly in the brain，spinal cord and the retina（bar＝ 1 mm）.B：Nestin green fluorescent can be obrved in the heart tissue（bar＝ 200 μm）.C：The expression of nestin obrved under high power microscope（bar＝ 50 μm）.
图2 RT-PCR和Q-PCR分析Nestin在出生后不同时期的Nestin-GFP小鼠心脏中的表达Fig.2
RT-PCR and Q-PCR analysis of Nestin expression in the hearts of different ages Nestin-GFP mou M：month
