第36卷第2期 2017年4月
电子显微学报
Journal of Chine Electron Microscopy Society
V o l.36，No.2
2017-04
祝寿文章编号：1000_6281(2017)02-0177~03
一种适用于蚊类扫描电镜样品简便快速的制备方法
电脑维修知识姬曼，赵君朋*
(首都医科大学中心实验室，北京100069)
摘要本文介绍一种适合蚊类研究的扫描电镜样品制备方法。以库蚊为样品，用四氧化锇直接单固定处理，适当缩短脱水时间，改进临界点干燥前的制样程序。此方法观察效果良好，提高了样品制备质量，为蚊类扫描电镜样品制备提供了一种简易而快速的方法。
关键词库蚊；扫描电镜；样品制备
中图分类号：R384. 1;Q 336 文献标识码： A d o i：10. 3969/j. issn. 1000-6281. 2017. 02. 013
扫描电子显微镜（scanning electron microscope, S E M)是超微形态学研究中的重要工具。S E M具有 分辨率高、视野大、景深长和立体感强等优势，可对 光学显微镜下分辨困难的结构进行深入解析[1—2]。蚊子是人类所患疟疾、脑炎和登革热等虫媒疾病主 要的传播媒介，因其大多个体微小，分类鉴别研究中 常应用扫描电镜观察虫体表面的微小形态特征，以获得较光学显微镜观察结果更为详尽、细微的结构 特征，作为分类学研究资料的佐证和补充[3]。传统 的扫描电镜生物样品制备时，一般需采用固定、脱 水、干燥及表面镀金等处理步骤[4]。由于病媒昆虫 样本个体微小且表面极不规则，若固定、脱水和干燥 环节处理不当，会引起虫体表面变形，从而影响观 察和鉴定结果。因此探索一种简便可靠的扫描电镜 制样方法是非常必要的。
1材料与方法
1.1试验材料
库蚊成虫，由首都医科大学病原生物学系提供。
1.2实验仪器
本实验所使用的主要仪器为：临界点干燥仪 (Leica E M C P D3000 )；离子滅射仪（JEOL JFC-1600)；和扫描电子显微镜（Hitachi S-4800)。
1.3实验方法
季羡林日记
将库蚊样品浸入0. 1m o b L-1磷酸缓冲液配制 的1%四氧化锇溶液中，固定20 m i n后，经 0. 1mol丄_1磷酸缓冲液洗淥3次，5 min/次；然后依 次经 50%、70%、80%、90%、95%和 100% 乙醇梯度脱水，每次2 min；最后放入临界点干燥仪中，处理 1.5 h；干燥后的样品粘于样品台上，经离子滅射仪 镀膜，于扫描电子显微镜下观察并记录。
2结果
扫描电镜观察结果显示，库蚊样品表面超微结 构清晰，触角呈鞭节状，分节近端处布有刺形感器，每节段表面均可见许多毛形感器（图1)。口器的上 唇表面光滑，端部朝腹面呈凹陷的尖管状，上、下颚 末端齿状，锯齿数5〜7个（图2)。复眼表面呈弧 状，外表较光滑，由约数百个小眼组成，复眼中心区 域小眼排列紧密。每个小眼一般呈六角形，向外凸 出呈半球状，小眼间无感觉毛，进一步放大可见角膜 外表面有均匀的圆形乳头状颗粒分布（图3,4)。前 后翅布满微毛，边缘及翅脉处附有羽状鳞片，每个鳞 片表面有多条规则纵条纹（图5)。胸足的侧爪表面 光滑，呈弯曲状，爪间垫可见许多毛形感器和平覆宽 鳞，跗节表面除覆盖有平覆宽鳞外，还可见疏散分 布的刺状感器（图6)。
3讨论
运用扫描电镜观察病媒昆虫整体样品中各部位 的超微结构，关键是在样品制作过程中避免变形、皱 缩及塌陷，使这些细微结构在电镜下清楚地呈现出 来[1]。组织固定是极为重要的环节，电镜制样中一 般选用2%〜3%戊二醛作为前固定剂固定组织样 品，而后再用四氧化锇作后固定。戊二醛可与样品 组织蛋白质瞬间交联，固定作用强，但其穿透速度
收稿日期:2016 -11 -08；修订日期:2016 -12 -09
作者简介：姬曼（1979 -)，女（汉族），北京人，主管技师.E-m ail:jimanemail@sina.
*通讯作者：赵君朋（1975 -)，男（汉族），山东人，博士.E-m ail:
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图1触角结构（Bar =20p m)；图2 口器结构（Bar =2p m)；图3复眼结构（Bar = 8p m)；图4复眼的超微结构（Bar = 1p m)；图5鳞片的结构（Bar = 10p m)；图6侧爪及跗节的结构（Bar = 20p m) 0
Fig. 1 The ultra-structure of antennae;Fig. 2 M outhparts;Fig. 3 Compound eye;Fig. 4 The ultra-structure of compound eye;
Fig. 5 Squam a;Fig. 6Claw and tarsus.
聒噪的读音
慢、固定时间较长，长时间的戊二醛固定使组织较易 发生皱缩变形[M]。如果样品较大且样品表面有腊 质保护层时，更易出现组织深部固定不良，即使采用 四氧化锇后固定，在脱水过程中样品仍易发生变形、皱缩及塌陷，不利于样品超微结构的保存和观察。
本实验中直接应用四氧化锇固定处理库蚊样 品，对其形态结构进行扫描电镜观察。四氧化锇本 就是膜固定剂，一般用于电镜样品的后固定，经不饱 和脂肪酸的还原作用形成锇-脂质复合物，呈黑色，不溶于乙醇、二甲苯等有机溶剂[5—6]。样品经四氧 化锇快速固定后，一方面缩短了实验时间减少了虫 体的变形；另一方面，在昆虫的几丁质体表形成锇- 脂质复合物，增加了导电性，对表面极不规则的样品 也不易产生滞电现象，从而提高了固定的质量，样品 表面结构的清晰度和反差得以改善。有研究发现，只用戊二醛单固定处理的方法样品严重变形，鉴定 特征缺失[1，4]。而用四氧化锇直接固定制备的昆虫 样品，虫体不皱缩，不变形，形态结构清晰，能够很好 地进行扫描电镜观察。该方法其一缩短了常规样品制备的时间，其二证实四氧化锇对生物组织有固定 和染色双重作用，这是一个简便、快速和可行的制样 方法，对于扫描电镜观察微小生物具有重要意义。
鲁滨逊漂流记感受
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第2期姬曼等：一种适用于蚊类扫描电镜样品简便快速的制备方法179
A simple and rapid preparation technique for scanning
electron microscope of mosquito
J I M a n,Z H A O Jun-peng*
(C ore Facility C enter,C ap ital M edical U niversity,B eijing 100069,C hina)
Abstract A sim ple and rapid m ethod for m osquito scanning electron m icroscopy sam ple preparation is introduced here. A fter osm ium tettroxide fixation, the m osquito sam ples are dehydrated for a short tim e before critical point drying. W ith this m ethod, the original characteristics of the sam ple looked m aintained well and good experim ental photographs were obtained. This is a reliable, sim ple and rapid specim en preparation technique for SEM of m osquitoes.
Keywords m osquito;scanning electron m icroscope;sam ple preparation
Corresponding author
