抗原修复大全
组织在福尔马林或其它固定液中固定会引起位于蛋白内或蛋白间的亚甲基桥的桥连，引起许多抗原决定簇被封闭。如在组织切片前未进行某种形式的抗原修复，免疫染色结果将不能令人满意甚至不能成功。最常用的抗原修复技术是酶消化和热引导的抗原决定簇的修复(heatinduced epitope retrieval,HIER)，但其它技术，如声波处理抗原修复技术也在某些实验室应用。有些抗体则适宜于几种抗原修复技术的联合使用，如酶消化加HIER可使anti-calponin抗体的染色效果最佳。有关抗原修复的基本要素如下：
1立才学校 足够的抗原修复是影响免疫组化染色结果最重要的因素，总的说来，较检测系统更为重要。
2 尽管某种形式的抗原修复对大多数抗体有益，但有些抗体经抗原修复后不再发生反应(例如某些不需要抗原修复的抗体)。
3 主要的抗原修复形式包括：
。酶处理，如：胰蛋白酶、胃蛋白酶、prona
通美。热引导的抗原决定簇修复，使用湿热。HIER对大多数的抗体有益，特别是核抗原(对它们来说，HIER可能是抗体工作的前提条件，如蕉门公园Ki-67、雌激素)。彼岸花有几种颜色
怎么看路由器密码 4 某些抗体适宜于几种抗原修复方法联合使用，如anticalponin抗体经酶处理及HIER联合修复后抗体工作效果最佳。
5 抗某一抗原的不同抗体可能需要不同的抗原修复方式，如有些抗CD21的抗体可能需要酶消化，而另一些则需要HIER。
6 使用HIER时，要注意两个基本点：
。抗体孵育前每一步操作均勿使组织干燥，否则免疫反应可能完全不能进行。
。加热后放置足够的时间(至少10～20 min)使之变凉是必需的，可假设为允许蛋白恢复到它的自然结构，否则HIER将无任何效果。
目前常见的抗原修复液，如：枸橼酸缓冲液、尿素、EDTA、Tris-HCl、氯化铵和商品化靶修复液。作者选择压力锅HIER方法，结果表明在pH8.0 1 mmol/L EDTA溶液中修复的效
果最佳，特别是与常用的枸橼酸缓冲液(pH6.0)比较。
有人认为EDTA-HIER的作用机制是通过钙离子的鳌合而实现的，而且这种鳌合作用只有在碱性pH值下才起作用(注意：枸橼酸缓冲液作用似乎也是通过钙离子的鳌合而实现的，并且也是在高pH值下工作的效果最好)。形成于hydromethylene、羧基及磷酸基团间的钙离子配体复合物通过空间排列的障碍作用，封闭了抗原决定簇的位点。因此去除了钙离子即打碎了混合物。然而，对于酸性的抗原修复液，如Tris-HCl，抗原修复似乎是通过高浓度的氢离子离解了钙离子复合物或打断了福尔马林固定产生的交联而实现的。
如果一个实验室想将枸橼酸缓冲液换为EDTA溶液作为抗原修复因子，大多数抗体的稀释度将被提高，这就是说，每个抗体的稀释度将要重新估测。这样不仅可以节省抗体，而且可使免疫染色更加稳定。pH值(碱性范围)非常重要，因为对有效的抗原修复来说，pH值似乎比抗原修复液的化学成分更为重要。对大多数抗体，抗原修复液全范围pH值均使HIER进行有效的修复，而对某些抗体，(如：Ki-67、ER)，中间范围的pH值(3.0～6.0)会降低染色的强度，高于或低于此临界带均使染色强度增强。
极少数抗体(CD34、HMB45)，用HIER时，在低pH值(1.0～2.0)下染色效果不好，在高pH
值下的染色效果极佳。因此，尽管pH值6.0的枸橼酸缓冲液可使大多数抗体良好地工作，但不可能总是工作良好。作为通用的修复液，碱性pH值的修复液远较枸橼酸缓冲液有效，而固定了很长时间或是非常旧的档案资料，酸性pH值的抗原修复液的工作效果优于碱性pH值的修复液(包括EDTA)，因此在通用抗原修复液不能进行免疫染色或染色效果不佳时，酸性抗原修复液可作为替代物。
(湖北省十堰东风汽车公司中心医院病理科李金范摘译自John KC Chan刊登在Advances in Anatomic Pathol上的文章)
抗原修复方法
抗原修复方法，大家共享。
Proteolytic antigen retrieval using Trypsin
Reagents:
Calcium Chloride 0.1g
Trypsin (Sigma Type II) 0.1g
Distilled Water 100 ml
Sodium Hydroxide (0.1 M)
Method:
1.Dissolve calcium chloride in distilled water and pH to 7.8 with sodium hydroxide. Store at 37oC.
2. Dissolve trypsin in calcium chloride solution.
火的字3. Place ctions in Trypsin solution at 37oC and incubate for pre-determined optimum time (approximately 20-30 minutes).
4. Wash in TBS and proceed with staining.
Proteolytic antigen retrieval using prona
Reagents:
Calcium Chloride 0.1g
Prona 0.1g
Distilled Water 100 ml
Sodium Hydroxide (0.1 M)
Method:
1. Dissolve calcium chloride in distilled water.
华为应用锁在哪里设置2. Dissolve prona in calcium chloride solution and pH to 7.8 with sodium hydroxide.
3. Place ctions in prona solution at room temperature and incubate for pre-determined optimum time (approximately 10 minutes).
4. Wash in TBS and proceed with staining
Heat mediated antigen retrieval
Heat mediated antigen retrieval may be ud in many cas to enable staining of certain antigens in paraffin embedded tissue ctions, or in some cas to improve results when staining is weak or inconsistent.
A number of buffers may be ud for this purpo. The choice of buffer should be as recommended on product specific datasheets, or determined experimentally by the customer. Serotec offer a range of pre-prepared antigen retrieval buffers, or alternatively customers may prefer to prepare their own buffers using the recipes provided below.
Reagents
Antigen retrieval buffer
Method:
1. Place slides in suitable container of prepared buffer, cover with cling-film (vented) and heat to 90oC (Plea note buffer must boil). Keep at this temperature for 10 minutes
2. Let ctions stand for 15 minutes to cool.
3. Wash in TBS/tween and proceed with staining.
Note: Actual heating times may vary depending on the antibody being ud and the fixation process that have been utilid.
Solutions ud:
TBS (Tris buffered saline) (stock solution x10 concentrated)
Sodium chloride 87.66 g
Tris 60.55 g
Distilled water 1 litre
Adjust pH to 7.4 using concentrated HCl.
TBS/Tween
Working strength TBS
1 litre
绿豆沙糖水Tween 20
0.5 ml
0.01M Citrate buffer for antigen retrieval
Anhydrous citric acid
3.84 g
Distilled water
1800 ml
Adjust pH to 6.0 using concentrated NaOH.
Make up to 2 litres with distilled water
0.001M EDTA buffer for antigen retrieval
EDTA
0.37 g
Distilled water
1000 ml
Adjust pH to 8.0 with 1 M NaOH
