Wnt信号通路的作用机制与神经干细胞作用
【摘要】 wnt通路是细胞增殖分化的关键调控环节， 在胚胎发育和肿瘤发生中起着重要作用。wnt途径参与了基因表达调节、 细胞迁移粘附、 细胞极化等过程， 同时还与其它信号通路存在交叉协同。Wnt/β-catenin通路在进化过程中高度保守， 此通路的主要分子构成及相关调控机制已得到基本阐明。对神经系统而言已有足够证据显示此通路参与了对神经前体细胞增殖， 分化以及决定细胞命运的调控，本文将阐明wnt通路的作用机制与神经干细胞的作用。
【关键词】 神经干细胞 wnt信号通路 机制 作用
一、Wnt信号通路的研究历史
1973年Sharma等在对果蝇胚胎发育的研究中发现了无翅基因(wingless)。1982年Nusr等对小鼠乳腺肿瘤研究时发现一种可以在细胞间传递增殖分化信号的蛋白，当时称为int幼儿美术启蒙-1。由于发现小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)插入或整合入该基因后可以使其异常激活，并导致发生肿瘤，所以当时认为int-1裸眼3d是什么是癌基因。后经研究发现果蝇的int样基因就是无翅基因(wingless)，
所以统一命名为Wnt基因家族。目前已从不同动物的基因组中发现多种Wnt基因，人类基因组中已经发现Wnt基因19种，分别命名为Wnt-1、Wnt-2、Wnt-3、Wnt-3a，等等。
二、Wnt信号通路
Wnt基因编码长度为350～400个氨基酸的分泌型糖蛋白，其特征为含有22—24个保守型半胱氨酸残基。Wnt蛋白通过细胞表面受体及细胞外基质可以在较大范围内(～1001-Lm)起到信使的作用。目前研究认为Wnt在细胞内的通路至少有4条(Huelsken．2001)：(1)经典的Wnt/β一catenin信号通路(canonical Wnt／13一catenin pathway)；(2)wnL／polarity通路(或者称为planar cell polaritypathway)；(3)Wnt／Ca2+通路；(4)调节纺锤体定向和不对称细胞分裂的通路。其中研究比较清楚的是经典的Wnt/β一catenin信号通路。
Wnt信号起始于Wnt蛋白与细胞膜上的两类受体—Frizzled蛋白和脂蛋白受体相关蛋白5／6(1ipoproteinreceptor—related proteins 5 and 6，LRP-5／6)相结合。在经典的Wnt／β一多媒体技术应用catenin信号通路中，Wnt蛋白与受体结合后，通过磷酸化的Disheveled蛋白将信号传至细胞内，抑制APC蛋白(adenoma—tous polyposis coli，APC)、糖原合成激酶(GSK-313)、轴素(Axin)、3-连环蛋白(B—catenin)复合物激酶的活性，在没有Wnt信号的状态下，该复
合物可以通过磷酸化作用快速降解B—catenin。但在该复合物失活的情况下，活化B—eatenin在胞质内大量聚集，并进入细胞核，破坏淋巴增强因子(1ymphoidenchancer factor，Lef)／T细胞因子(T．cell factor，Tcf)家族与Groucho、CBP抑制蛋白形成的复合物，并与Lef／Tcf家族的转录因子结合，从而激活转录因子，进一步激活靶基因开始转录。
不同的传导通路的功能也不尽相同。Wnt/β一atenin通路主要在发育过程中调节细胞的增殖与分化，wnL／polarity通路主要控制细胞骨架的形成，而Wnt／Ca2+通路的生物学功能目前则尚不清楚。
三、Wnt信号通路对神经干细胞的作用
对基因敲除小鼠的研究证明Wnt信号通路在胚胎发育过程中有重要的作用，尤其是神经系统的发育。Wnt基因的突变会导致中脑、海马、脊髓、神经嵴等神经组织的缺失或异常。wnt-7a直接参与突触前结构的形成。Wnt-4引导脊髓背侧连合神经元(Commissural neurons)的轴突在穿过脊髓中线后由D．V(背一腹)方向改为A—P(头一尾)方向。脊髓运动神经元表达wnt-3来引导感觉神经元与之正确连接，从而形成可控制肌肉的神经通路。King
将Wnt信号蛋白粗略的分为两类：Wnt一1族和Wnt-5a族。Wnt一1族包括Wnt一1、Wnt一3a及Wnt-7a；Wnt-5a族包括Wnt．4及Wnt-Sa(http：／／web．indstate．eduthcme／mwking／wnts—andmore．html)。Wnt一1族在神经系统的发育过程中的作用尤其重要。美国盐湖城
(一) Wnt信号通路促进神经干细胞增殖 在Wnt信号通路对神经干细胞的作用这一问题上，目前的实验研究显示出不同的结果。Wnt促进神经干细胞增殖的作用很早就被人们所认识。最近Megas—on等对鸡胚脊髓发育的研究认为：Wnt对神经干细胞增殖的作用主要通过增加S期细胞数量、缩短G，和／或G：期的时间及抑制细胞由G，期过渡到G。期来完成。Wnt-1与wnt-3a不仅表现有丝分裂原(mi-togen)作用，而且在脊髓D—V应当的近义词方向上形成有丝分裂原浓度梯度(mitogen gradient)，在有丝分裂原浓度较高、Wnt信号强的脊髓背侧表现为大量增殖，而在有丝分裂原浓度低、Wnt信号较弱的脊髓腹侧则表现为大量分化(Megason．2002)。
B-catenin是Wnt信号通路中的重要的信息分子，13-catenin如不能被及时降解会导致Wnt下游靶基因的持续表达。Chenn等使用表达“AN9013一catenin．GFP”的转基因小鼠进行研究时发现，在这种不能被降解B—catenin持续作用下，神经干细胞的命运被改变，使得大
量本应分化的神经干细胞重新回到(re．enter)细胞周期中，神经干细胞的数量明显增加，导致E15．5d胎鼠的大脑皮质表面积明显扩大，本应光滑的大脑皮质出现脑沟和脑回，但大脑皮质的厚度并没有发生改变。
(二)Wnt信号通路促进神经干细胞分化新近的研究发现倾向于Wnt信号通路促进神经干细胞的分化，而且大幅提高了神经元的分化比例。Lyu等发现Wnt-3a虽然不能直接促进P19细胞(多能干细胞)向神经细胞分化，但对于已经进入分化状态的P19细胞，Wnt-3a可以显著促进其向神经元分化。Wnt-1不但促进P19细胞向神经元分化，并且可以抑制神经胶质的分化(Tang．2002)。Muroyama等发现Wn-t1与Wnt-3a基因的突变对胎鼠脊髓神经干细胞的数量没有明显影响，但脊髓背侧中间神经元D1与D2却大量缺失(Muroyama．2002)。在使用含有Wnt一3a蛋白的条件培养液培养E11．5d的胎鼠前脑的神经干细胞发现，神经干细胞球的增殖被抑制，神经干细胞大量分化成为MAP-2阳性的神经元。加入Wnt一3a抗体后神经干细胞的增殖能力被恢复，神经干细胞球的数量明显增加。当条件培养液中的FGF2去除后，分化的神经元形态则更为成熟。
来源于小鼠大脑皮质的神经干细胞转基因后超表达Wnt-7a或β-catenin，即使在培养液中加
入FGF2，依然大量向神经元分化。阻断Wnt信号通路后导致神经元分化被抑制。研究另外发现β-cate—nin／TCF复合物通过直接作用于neurogenin 1的表达，从而调控神经干细胞的分化”J。Iee等使用转基因小鼠进行体内实验发现稳定表达活化β—care—nin可以促进神经嵴干细胞(neural crest stem cell，NCSC)分化成为感觉神经元。β-catenin基因突变后，感觉神经元大量缺失。体外培养发现Wnt-1促使76．4％的神经嵴干细胞分化成为神经细胞，其中95．4％的为感觉神经元，而且细胞的增殖不受影响。但即使在一个区域里Wnt信号通路对神经干细胞也可以表现出不同的作用。Castelo．Branco等对胚胎腹侧中脑神经干细胞的研究发现，同在腹侧中脑，Wnt-1、Wn-t3a和Wnt-5a的作用却各不相同。Wnt．1主要促进神经干细胞的增殖同时也有助于各类神经元的分化。wnt-3a主要促进神经干细胞的
增殖。Wnt-5a却主要促进神经干细胞向多巴胺神经元分化。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)可以促使细胞内β-catenin大量聚集，从而使神经干细胞不断增殖、保持在干细胞状态。Israna等旧1发现超表达β-catenin和FGF2共同作用于神经干细胞可以保持增殖的状态，但当FGF2去除后，超表达β-catenin明显促进神经干细胞向神经元分化，染色质免疫沉淀分析(chromatin immunoprecipitation(CHIP)assays)证实p—catenin和Left均直接与neu—rogenin基因的启动子结合促进了神经元的分化。非经典的Wn
t信号通路可能也参与到神经干细胞分化的调控，Saneyoshi等∽o发现体虚怎么调理Wnt／Ca2+通路在非洲爪蟾(Xenopus)胚胎发育时就参与促进腹侧细胞的分化，同时对Wnt／β-catenin信号通路还表现出一定程度的抑制。
Wnt信号通路对神经干细胞的作用不能简单的加以总结，不同的条件下或许就有不同的结果：神经干细胞发育的阶段；Wnt猪肉脯读音信号蛋白的种类一1；Wnt的信号强度(Megason．2002)等因素都可能与之相关。Sommer认为Wnt信号通路在神经组织的发育过程中对神经干细胞有许多不同的作用。产生这种现象可能的机制之一是神经干细胞自身的特点及所处的微环境可能会导致细胞对Wnt信号的不同反应，另外一个可能性是Wnt信号通路下游的靶基因众多，不同的靶基因产生的作用不尽相同。例如cyclinDl、c—myc参与控制细胞周期；neurogenins、NRSF／REST参与神经生发；Ephrins参与细胞间作用。但其根本的分子机制目前尚不清楚。
四、展望
Wnt信号通路对神经干细胞增殖分化的作用给目前的基因治疗带来了希望。从1992年神经干细胞被成功在体外分离至今，神经干细胞移植治疗中枢神经系统退行性病变及中枢神经
系统创伤的研究取得了许多进展，但如何有效促进神经干细胞向神经元的定向分化这一问题一直没能很好的解决。
Garrido等的研究发现激活蛋白激酶C可以导致B．catenin的聚集进而激活Wnt信号通路下游靶基因，其结果明显抑制B一淀粉样肽(amyloid p pep—tide)对神经细胞的毒性，减轻Alzheimer's病神经细胞的退行性变。激活蛋白激酶c使存活的神经细胞数增加20％，抑制它则使存活的神经细胞数下降7％(Garrido．2002)。Wnt信号对中脑多巴胺神经元的促分化作用也提示在Parkinson，s病中的应用潜力。在神经干细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究中，移植的神经干细胞多数分化成为神经胶质细胞。其中重要的一个原因是脊髓损伤后大量促神经胶质细胞分化的信号十分活跃。骨形成蛋白(bone nor-phogenetic proteins，BMP)是脊髓神经干细胞发育中重要的调控信号。正常的脊髓中有BMP-7的表达，只是维持在一个低水平状态，而在脊髓损伤后BMP一7表达提高近4倍(Setoguchi．2001)。BMP-7和其同家族的BMP-2、BMP-4等有抑制神经生发和促进神经干细胞向胶质细胞分化(Nakahara．2001)。Notch信号在脊髓损伤后表达同样明显提高(Yamamoto．2001，Scardigli．,2001)。Notch信号的激活可加速并不可逆的促进神经干细胞向胶质细胞分化(Taniga—ki．2001)。Wnt信号通路既可以诱导产生Noggin蛋白，该蛋白结合BMP，抑制
它与受体结合，以此来拮抗BMP信号(Reshef．1998)，更可以在多个水平上对抗Notch信号。Wnt信号通路对神经元分化的促进、对BMP、Notch拮抗性的“crosstalk”作用让人们看到了利用Wnt基因对神经干细胞进行定向分化研究的希望。如果人为在脊髓损伤后刺激wnt信号高表达，利用wnt信号刺激神经干细胞向神经元分化，同时竞争性抑制神经胶质细胞的产生，从而对脊髓功能的恢复将具有重大的意义。神经干细胞的增殖分化的定向调控问题一直未能很好的解决，Wnt赵孟頫楷书代表作信号通路在中枢神经系统发育过程中起到的关键作用，而且它所表现出来的对神经元分化的刺激作用，给人们解决这一问题带来了新的方法，更让人们对其在神经系统疾病基因治疗方面的应用价值抱有很大的希望。尽管Wnt信号通路对神经干细胞增殖分化的作用日益受到重视，但目前对于它的根本作用机制依然不清楚，还需要进一步深入研究探讨。
